הפרוטוקול הנוכחי עשוי לשמש פלטפורמה חדשה למחקר ופיתוח של נשאי תרופות כדי להתמקד באתרי מחלות בתוך מערכת כלי הדם האנושית. היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו הוא שהיא מאפשרת לחקור את הצטברותם של נשאי סמים בתוך מודל עורקי תלת-ממדי משוכפל על ידי בני אדם. זה נעשה בתנאים פיזיולוגיים, כולל זרימת דם.
גישה זו יכולה לשמש כדי לייעל את נשאי התרופות לאבחון וטיפול במגוון רחב של מחלות כלי דם, כולל עורקים טרשת עורקים. התחל על ידי בחירת תמונות מחולים או גיאומטריות שנחקרו בעבר של ביפורציה עורק העורק הראשי האנושי ושימוש בתמונות כדי ליצור מודל עיצוב בסיוע מחשב של התבנית. השתמש במדפסת תלת-ממד כדי להדפיס את העיצוב, להסיר את תומכי ההדפסה הזמנית ולשטוף את הדגם עם אצטון לפני השימוש בנייר זכוכית כדי ללטש ולהחליק את התבניות, במיוחד את האזורים שמהם נחתכו התומכים.
לאחר ליטש, לשטוף את המודל עם אלכוהול איזופרופיל כדי להסיר כל אבק פלסטיק ולאפשר לדגם להתייבש במכסה המנוע הכימי במשך שעתיים עד שלוש שעות. כדי להקל על התפכחות קלה של הפלסטיק, לרסס את המודל עם לכה שקופה שלוש פעמים, ומאפשר לכה לייבש אוויר במשך שעה אחת בין יישומים. לאחר היישום האחרון, השתמש במברשת צבע ולכה כדי להדביק רצועות שקופות ומלבניות של פלסטיק חלק לכל צד של המסגרת, כך שהמודל יהיה אטום בתחתית ויפתח בחלק העליון.
לאחר הייבוש, מניחים את התבנית בייבוש ולאט לאט גרוע פתרון גומי סיליקון טרי מוכן לתוך הפתח. מוציאים בועות אוויר עד שהתערובת ברורה ומשאירים את התבנית בתוך התבשר למשך הלילה. כאשר התערובת יבשה לחלוטין, להסיר את השקופיות שקופות לטבול את המודל אצטון מוחלט במשך 48 שעות במכסה המנוע הכימי עד הפלסטיק מומס לחלוטין.
כדי לאדות את האצטון הלכוד לפני זריעת התא, לדגור על המודל לפחות ארבעה ימים ב 60 מעלות צלזיוס. כדי לזרוע את המודל עם תאים, תחילה לעקר את המודל ושני מחברי מפרצון ושקע על ידי אור או קרינה אולטרה סגול. לאחר 20 דקות, באמצעות מזרק כדי לצפות את המודל עם ארבעה מיליליטר של 100 מיקרוגרם למיליליטר פיברונקטין במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס.
בסוף הדגירה, להסיר את פתרון פיברונקטין דרך השקע לשטוף את המודל עם מדיום תא אנדותל. השתמש מזרק כדי למלא את המודל שטוף עם ארבעה מיליליטר של 2.5 פעמים 10 כדי 10 כדי השישי תאי אנדותל למיליליטר של השעיית תא אנדותל בינוני ולהבטיח את המודל לסיבוב בתוך חממת תרבית התא 48 שעות במהפכה אחת לדקה, כדי להבטיח התפלגות הומוגנית של התאים. בסוף הדגירה, השתמש מזרק פלסטיק 10 מיליליטר לשטוף את הדגם עם PBS.
לתקן את התאים במשך 15 דקות, עם ארבעה מיליליטר של 4%paraformaldehyde, ולאחר מכן לשטוף את הדגם שלוש פעמים עם PBS כפי שהודגם לפני אחסון הדגם בארבע מעלות צלזיוס בארבעה מיליליטר של PBS טרי. לפני תחילת ניסוי, השתמש צינורות שקע כדי לחבר מנחת תנודה מחובר משאבה peristaltic לכניסת דגם הראשי התרבותי ולהשתמש חתיכת צינורות כדי למזג את שני שקעים. לאחר מכן לפצל את צינורות השקע לשני צינורות שקע ולהוסיף מהדק פלסטיק לכל צינור.
כדי להגדיר תצורה במעגל סגור, להוסיף 300 מיליליטר של PBS למיכל במעגל סגור ולהניח מפרצון אחד וצינור שקע אחד בתוך מיכל מלא PBS עם מהדקים B ו- C פתוח, בהתאמה, ולאחר מכן למקם את צינור הכניסה האחר לתוך מיכל כביסה ליטר אחד מלא במים מזוקקים, ואת צינור שקע אחר לתוך מיכל פסולת ריק ליטר אחד עם מלחציים A ו- D סגורים, בהתאמה. מקם את דגם הכבישים תחת מיקרוסקופ סטריאו, הגדר את המשאבה לקצב זרימה התחלתי של 10 מהפכות לדקה, עם חמש מהפכות לדקה תוספת גדל כל ארבע עד חמש דקות. כאשר קצב הזרימה מגיע ל -100 סיבובים לדקה, הוסף 1.6 מיקרוגרם של חלקיקי פוליסטירן קרבוקסילטר פלואורסצנטיים למיליליטר של PBS למיכל המעגל הסגור וצלם את אזור העניין כל 10 שניות למשך שעה וחצי.
כדי להגדיר תצורה של מעגל פתוח, פתח את מהדקי A ו- D וסגור מיד את מהדקי B ו- C. תן לרוב המים לזרום ממיכל הכביסה למיכל הפסולת ב-100 סיבובים בדקה. לפני שהמים הועברו לחלוטין, עצרו את המשאבה וסגרו את מהדקי הצינור לפני ההמלטה ואחרי השקע של דגם עורק הלב.
באמצעות המסננים המתאימים, ללכוד תמונות של המודל באזור העניין כדי להראות את התצהיר וההידבקות של החלקיקים לתאים. עם השלמת הניסוי, השתמש בקוד תוכנה מותאם אישית כדי לנתח את התמונות שצולמו באזור העניין, הזן את שם התמונה והגדר את הסף המשוער. אז תריץ את הקוד.
בדוק את התמונה המתקבלת ואת מספר החלקיקים שנספר בתמונה. בניתוח מייצג זה, מיקרוגרפים תמונה של תאי אנדותל מתורבתים זרע במודל עורק עורק תלת-ממדי ניתן לראות על ידי הדמיה מיקרוסקופית קונפוקלית brightfield ופלואורסצנטיות. חרוזי זכוכית בקוטר 10 מיקרון פלואורסצנטיים, שנזרעו בדגם תלת-ממדי הציגו דפוס של תגמול, מה שמרמז על חיקוי מוצלח של תנאים פיזיולוגיים בתוך המודל.
הדמיה של תצהיר החלקיקים גילתה כי רמה גבוהה יותר של הידבקות של החלקיקים לתאים נצפתה מחוץ לאזור ההדקלציה שבו לחץ הגניסוח בקיר היה גבוה. בעקבות פרוטוקול זה, חלקיקים פונקציונליים עם קינטיקה מחייבת ספציפית ותרבית ליבה של תאים במודלים שונים של עורקים אנושיים עשויים להיחקר כדי לשפר את המודל וללמוד ניסוחים ספציפיים. טכניקה זו מספקת פלטפורמה חדשה לחקר פילוח כלי הדם של נשאי סמים.
לאחרונה השתמשנו בו כדי להראות כיצד ניתן להתאים את התוספת של חלקיקים כדי למקד אזורי כלים חולים שונים.
