המחברים מבקשים להודות מקורות מימון, ובכלל זה AHA (13GRNT16990019 לWT) וNHLBI (HL097246 וHL119371 לWT).

1. Silanization וbiomolecule Functionalization של שקופיות או פוליקרבונט ממברנה הערה: רבים מהכימיקלים והפתרונות בפרוטוקול זה שיעורי אידוי גבוהים (אתנול (EtOH), אצטון, וכו &#39;). צעדים אחרים כרוכים פעמים דגירה ארוכות לשיעורי אידוי נמוכים. סרט פרפין מומלץ לאטום מכולות. זהירות: רבים של הכימיקלים (כולל: חומצה גופרתית, אצטון, (3-aminopropyl) triethoxysilane, glutaraldehyde, EtOH) נחשבים מסוכן, או הפכפך. התייעץ גיליון בטיחות חומרים (MSDS) של כל חומר לאחסון נאות, טיפול, ורשות לפני השימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים שקופית חדשה זכוכית מדידת 75 מ&quot;מ ב -50 מ&quot;מ על ידי מ&quot;מ 1, ב, מנה מכתימה שקופיות זכוכית נקייה ללא קשר לנטייה, הבטחת טבילה מלאה. השתמש במכל לצעדים 1.1-1.12. קרום לתרבות משותפת, כולל פוליקרבונט (PC) עם 0.4 מיקרון גודל נקבובית, לחתוך לגודל של 75 מ&quot;מ ב -50 מ&quot;מ, לכל STE הבא: הערהנ.ב. לfunctionalization מחשב וזריעת EC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופית בחומצה גופרתית (20%), O / N. זהירות: התייעץ MSDS לחומצה גופרתית לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות ידי טבילה במים ללא יונים (DI) ל5 דקות, שלוש פעמים, שינוי DI בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופית באצטון למשך 30 דקות. זהירות: התייעץ MSDS לאצטון לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופית ב6% O פתרון triethoxysilane / אצטון (3-aminopropyl) / N. זהירות: התייעץ MSDS לtriethoxysilane (3-aminopropyl) ואצטון לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופית באצטון ל5 דקות, שלוש פעמים, שינוי אצטון בכל פעם. זהירות: התייעץ MSDS לאצטון לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות ידי הטבילה בDI ל5 דקות, שלוש פעמים, שינוי DI בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופית בשיעור של 1.5% פתרון glutaraldehyde / DI במשך 60 דקות. זהירות: התייעץ MSDS לglutaraldehyde לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות ידי הטבילה בDI ל5 דקות, שתי פעמים, שינוי DI בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופית מקוםשל 70% אתנול ל( EtOH) למשך 30 דקות בסטרילי, זרימה למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר EtOH ולאפשר נותרו שאריות להתאדות. לטבול את השקופיות בDI וניקוז סטרילי כדי רעננות השקופיות. הערה: שקופיות או קרום מחשב יכול להיות אטום בהחזיק שקופיות זכוכית ומאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד שבוע. על השימוש לתרבית תאים, חזור על שלבים 1.10 ו1.11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השקופיות מהחזיק השקופיות ולמקם אותו לתוך 100 מ&quot;מ על ידי 100 מ&quot;מ צלחת פטרי רבוע בזרימה למינרית. הערה: מיכל זה ישמש לכל השלבים הנותרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שקופית או מחשב לזריעת תאי האנדותל לניסוי monoculture. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל השקופיות פונקציונליות או מחשב (שלב 1.11) עם פתרון 1 מיליליטר פיברונקטין (25 מיקרוגרם / מיליליטר), בצד אחד, המכסה את האזור המשוער שנחשף לתא תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שקופיות או מחשב בחממה סטרילית נקבעה על 37 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לשאוב את הפתרון שנותר באמצעות GLAפיפטה aspirator ss מחוברת לואקום. הערה: שקופיות יכולות עכשיו להיות מאוחסנים O / N ב 4 ° C לשימוש עתידי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב 1.12.2 צעדים רק להכנת שיתוף תרבות EC / SMC. הכן וזרע תרבות חלקה תא שריר (SMC) לניסוי התרבות משותפת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אטם סיליקון מקום על גבי השקופית (שלב 1.11), עם ממדים של 75 מ&quot;מ על ידי קוטר 50 מ&quot;מ חיצוני, קוטר הפנימי של 50 מ&quot;מ ב -30 מ&quot;מ, עובי של 0.5 מ&quot;מ, ונקבים שליישר עם זרימת תא ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 מיליליטר SMC ב 10% FBS השעיה / DMEM. לנטרל 1 מיליליטר פתרון של 2 מ&quot;ג / מיליליטר קולגן סוג אני עם 7% NaHCO 3 ו 0.1 פתרון M NaOH לpH של 7.4, ולערבב עם ההשעיה SMC עם צפיפות תא סופית של 2 x 10 6 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים פתרון SMC בתוך אטם דגירה שקופיות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לכסות את השקופית עם סרום 25 מיליליטר 0.1% שור עוברי (FBS) מעורבת בDulbecco של שינוינשר בינוני (DMEM) במשך 72 שעות. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי האנדותל תרבות (ECs) על קרום שקופיות / פוליקרבונט זכוכית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 1 ECs מיליליטר ב 10% FBS / DMEM, עם ריכוז ראשוני של 6.0 x 10 5 תאים / מיליליטר, על משטחי פיברונקטין של שקופיות זכוכית או קרום פוליקרבונט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים בחממה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, ו -10% FBS 120 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות כיסוי המכילות תאים עם תוספת של 10% FBS / DMEM, ומקום בחממה ב -37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 O / N, עד 70% -80% ומחוברות. </li></ol></li></ol> 2. קביעת צמיגות נוזל ונפח קצב זרימה הערה: viscometers סיבוב הוא ציוד רגיש, והמדריך למשתמש viscometer יש להתייעץ לפני הכיול, איפוס, או ביצוע מדידות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע גזירה רצויה נוזל (τ) מהספרות של כלי הדם הממוקד של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MeasurFBS דואר 1% / צמיגות DMEM (μ), באמצעות viscometer סיבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע קצב זרימת נפח הנדרש (Q) ממשוואה Poiseuille: <img alt="משוואת 1" src="/files/ftp_upload/53224/53224eq1.jpg" /> , שבו τ = גזירת נוזל, μ = צמיגות, Q = כרך. קצב זרימה, רוחב w = קאמרי, וh = קאמרי גובה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משאבה מוגדרת קצב הזרימה נגזר בשלב 2.3, ולהשתמש לכל השלבים הבאים. </li></ol> 3. קביעת Pulsatility האינדקס הערה: כל יציאות החיבור במערכת צריכה להיות מחוברות עם עקיצה נעילת טבעת לגודל מתאים, או חיבורי luer לעקיצה נקבה. צינורות PVC חיבור עשויים אז להיות מחוברים לאבזרי עקיצה, ומעגל הושלם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר זרימת מעגל כמו באיור 2, עם דעיכת קאמרית (איור 3) ומד זרימה קולי בכיוון זרימה נכון. הערה: מד זרימת Ultrasonic הוא פיסת הציוד רגישה, והמדריך למשתמש יש להתייעץ לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא זרימת מעגל ומאגר עם מים די, על ידי הבטחת צינור לשקע מאגר (לשאוב) הוא שקוע בתוך מאגר נפח. דמיין זרימת צורת גל באמצעות מד זרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שסתום שחרור האוויר פתוח בתא דעיכת לשנות יחס נפח נוזל / אוויר. שסתום לסגור שחרור אוויר במרווחי מפלס נוזל שונים ולחשב מדד pulsatility (PI = (V מקס - V מינ &#39;) / V Mean) באמצעות זרימת שיא גל (V מקס), שוקת (V מינ&#39;), ואומרים (V מתכוון). ערכי PI רשומות במחברת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מארק וכתוצאה מכך רמת נוזל וPI על חדר דעיכת, באמצעות הלבד הטה, עט דיו קבוע לשימוש עתידי. לקבוע רמות PI רצויות מהספרות פתולוגיה 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Tube הסיליקון Formation- אופציונאלי, שיטה מתקדמת יותר של pulsatility שליטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את בסיס אלסטומר סיליקון וסוכן ריפוי ביחסים שונים (לדוגמא, basיחס בין 10 דואר ל- crosslinker: 1 עד 36:. 1) למגוון moduli אלסטי הממוקד, כפי שמודגם בעבר 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפברק צינורות סיליקון על ידי תהליך טבילה-תרופה חוזרת ונשנית, טבילה קצרה צינורית פלדה (14 G) לתערובת prepolymer סיליקון עם יחס הבסיס לcrosslinker שנקבע מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינורית מצופה prepolymer לתנור על 60 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות כדי לרפא את ציפוי הפולימרים בצינורית, מיתוג הכיוון באמצע תהליך הריפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך הטבילה באותה התערובת אלסטומר סיליקון ומניח בחזרה בתנור במשך 4 שעות נוספות, וכתוצאה מכך ~ 0.3 מ&quot;מ צינורות עבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צינור סיליקון Ultrathin מצינורית הנירוסטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר צינורות לזרום במעגל במקום דעיכת קאמרית, וPI בדיקה עבור כל אחד כמו ב3.3. </li></ol></li></ol> עיקור 4. משאבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את תא הזרימה (איור 2), צינורות PVC, ואטמים ב10% מי חמצן (H 2 O 2). לשטוף עם DI סטרילי לפני שלב 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את משאבת הדם על מדף חממת חילוף. הערה: מדפי חממה צריכים להיות נירוסטה, ולהיות מסוגל לתמוך במשקל של כל מעגל הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את זרימת המעגל ומאגר עם 10% H 2 O 2 על ידי הבטחת צינור לשקע מאגר (לשאוב) הוא שקוע בתוך מאגר נפח. הפץ H 2 O 2 על ידי שאיבה באמצעות מעגל עבור 20 דקות בזרימה למינרית עם אור UV על. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב כל H 2 O 2 מצינורות, ולשטוף עם PBS סטרילי על ידי שאיבה באמצעות זרימת מעגל. </li></ol> 5. עצרת לשכת זרימה הערה: תא הזרימה מורכב של אקריליק, צלחת מותאמת אישית, עם יציאות ואקום וכניסה וזרימה לשקע יציאות (ראה איור 2). הרכבה קאמרית מורכבת של הצבת תא הזרימה ואטמים על גבי שקופיות תרבות, פרוPerly מיושר, והוא מתואר להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם 1% FBS / DMEM באמבט מים 37 מעלות צלזיוס ולהכין תא זרימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח שקופיות EC מתקשורת (מצעד 1.13) ואטם מקום על גבי עם צד תא למעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי) קרום מחשב קח את המדיה (מצעד 1.13) ואטם מקום על גבי עם צד תא למעלה. מניחים שקופית שיתוף תרבות עם זרע SMC (שלב 1.12.2) מתחת קרום מחשב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר ערוץ ואקום של תא הזרימה עם החורים באטם (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף צינור ואקום ליציאות ואקום (איור 2) להבטיח שום הדלפות לתקשורת לואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גיליון פוליקרבונט מקום מתחת שקופיות זכוכית והרכבת תא זרימת מהדק עם מהדק האביב, אחד בכל צד של תא זרימה (איורים 2 ו 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכת זרימת מקום בחממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, ולמלא את המעגל עם תקשורת על ידי שאיבה ממאגר מלא בpulsatility הנמוך.לשמור על התזרים הזה במשך 4 שעות לנפשיים מראש תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם נפח נוזל בדעיכה קאמרי לרמת PI הניכרת, ותרבות לזמן רצוי. </li></ol>

<ol>
	<li>Scott-Drechsel, D., Su, Z., Hunter, K., Li, M., Shandas, R., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+flow+co-culture+system+for+studying+mechanobiology+effects+of+pulse+flow+waves.">A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves.</a> Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).</li><li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffening-Induced+High+Pulsatility+Flow+Activates+Endothelial+Inflammation+via+a+TLR2/NF-&#954;B+Pathway.">Stiffening-Induced High Pulsatility Flow Activates Endothelial Inflammation via a TLR2/NF-&#954;B Pathway.</a> PLoS ONE. 9 (7), e102195 (2014).</li><li>Wexler, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+Artery+Calcification:+Pathophysiology,+Epidemiology,+Imaging+Methods,+and+Clinical+Implications+A+Statement+for+Health+Professionals+From+the+American+Heart+Association.">Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, Epidemiology, Imaging Methods, and Clinical Implications A Statement for Health Professionals From the American Heart Association.</a> Circulation. 94 (5), 1175-1192 (1996).</li><li>Lan, T. -. H., Huang, X. -. Q., Tan, H. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+fibrosis+in+atherosclerosis.">Vascular fibrosis in atherosclerosis.</a> Cardiovasc Pathol. 22 (5), 401-407 (2013).</li><li>Lee, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+endothelial+recovery+and+reducing+neointimal+hyperplasia+using+sequential-like+release+of+acetylsalicylic+acid+and+paclitaxel-loaded+biodegradable+stents.">Promoting endothelial recovery and reducing neointimal hyperplasia using sequential-like release of acetylsalicylic acid and paclitaxel-loaded biodegradable stents.</a> Int J Nanomedicine. 9, 4117-4133 (2014).</li><li>Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Remodeling+in+Hypertension+Roles+of+Apoptosis+Inflammation,+and+Fibrosis.">Vascular Remodeling in Hypertension Roles of Apoptosis Inflammation, and Fibrosis.</a> Hypertension. 38 (3), 581-587 (2001).</li><li>Greil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+carotid+artery+flow+velocities+after+stent+implantation:+a+fluid+dynamics+study+with+laser+Doppler+anemometry.">Changes in carotid artery flow velocities after stent implantation: a fluid dynamics study with laser Doppler anemometry.</a> J Endovasc Ther. 10 (2), 275-284 (2003).</li><li>Egorova, A. D., van der Heiden, K., Poelmann, R. E., Hierck, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+as+biomechanical+sensors+in+regulating+endothelial+function.">Primary cilia as biomechanical sensors in regulating endothelial function.</a> Differentiation. 83 (2), S56-S61 (2012).</li><li>Liu, S. Q., Goldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+blood+shear+stress+in+the+regulation+of+vascular+smooth+muscle+cell+migration.">Role of blood shear stress in the regulation of vascular smooth muscle cell migration.</a> IEEE T Bio-Med Eng. 48 (4), 474-483 (2001).</li><li>Scott, D., Tan, Y., Shandas, R., Stenmark, K. R., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+pulsatility+flow+stimulates+smooth+muscle+cell+hypertrophy+and+contractile+protein+expression.">High pulsatility flow stimulates smooth muscle cell hypertrophy and contractile protein expression.</a> AJP: Lung C. 304 (1), L70-L81 (2013).</li><li>Panaritis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsatility+Index+of+Temporal+and+Renal+Arteries+as+an+Early+Finding+of+Arteriopathy+in+Diabetic+Patients..">Pulsatility Index of Temporal and Renal Arteries as an Early Finding of Arteriopathy in Diabetic Patients..</a> Ann Vasc Surg. 19 (1), 80-83 (2005).</li><li>Miao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Flow+Patterns+on+the+Localization+and+Expression+of+VE-Cadherin+at+Vascular+Endothelial+Cell+Junctions:+In+vivo+and+in+vitro+Investigations.">Effects of Flow Patterns on the Localization and Expression of VE-Cadherin at Vascular Endothelial Cell Junctions: In vivo and in vitro Investigations.</a> J Vasc Res. 42 (1), 77-89 (2005).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר שיטה של שכפול זרימה פועמת במבחנה, ועשוי להיות צעד ראשון סייע בקביעת תרומה של תנאי זרימה לפתולוגיות מחלה. המחקרים קודמים תוך שימוש בפרוטוקול זה מצאו תנאי זרימה לתרום לתגובה דלקתית בכלי הדם. 1, 10 בנוסף, פרוטוקול זה מיועד למעבדות מנוסים. ככזה, ?...

שיעורי תחלואה במחלות לב וכלי דם הם הגדולים ביותר באמריקה, עם רבים כתוצאה מכלי דם בריאים. עורקים בריאים מורכבים של רקמה אלסטית, עם משטח luminal רך מצופה monolayer תא האנדותל (EC). זרימה בעורקים עשויה להיות מודל כפונקצית גל נדנוד עם שיעור זרימה ממוצע חיובי. מדד pulsatility (PI) הוא המנה של גודל תנודה ואומר זרימה (PI = (מקס -.. מינ &#39;) / Mean), 1 וכבר דגם במבחנה עם גמישות כלי משתנה 2 גמישות עורקים חשובה באחסון של זרימה. אנרגיה מהתכווצויות לב, מתרחב בלחץ הסיסטולי, וממלא תפקיד משמעותי בויסות זרימת דם לצרכן. כי הלב שומר עקבי, pulsatile, זרימת נפחית, הרחבת עורקים מגבירה שטח חתך, שיפור זרימת יציבות על ידי הקטנת מהירות זרימה, מאמץ גזירה, וצרכן. לעתים קרובות, שינויי עורקים בריאים נוכחי לגמישותאו עמידה, בו מוצגות התקשות משיפוץ כלי דם, רקמת צלקת או הסתיידות 3, 4. בנוסף, הפרעות אחרות של כלי דם, כגון היפרפלזיה neointimal (NIH), 5 מפרצת ויתר לחץ דם 6 וסיסטיק כלי דם 4, עלולות להצר קוטר כלי. עם זאת, טיפול תרופתי וטיפול הנוכחי של מכשיר מחלות כלי דם לעתים קרובות להזניח את החשיבות של דינמיקת קיר כלי עמידה או זרימת דם במחלת כלי דם שמסתבכת לעתים קרובות על ידי שינויים במורפולוגיה כלי ונכסים. לא אנגיופלסטיקה הבלון ולא תומכן לענות הסיבוך של קיר גמישות 7. לכן, דוגמנות במבחנה של דם זורמת כתוצאה ממחלת עורקים וטיפולים חשובה בחקירת פתולוגיות מחלה ויעילות של טיפול בעתיד. בזאת, אנו מתארים שיטה של ​​שכפול זרימת דם פיזיולוגית ופתולוגיים שנועדה לקבוע את תגובת תא בpathol מחלת כלי דםogies. זרימת נוזל גורמת ללחץ גזירה בקיר הכלי, שהוא אות מכאנית חשובה בבריאות כלי שיט, המשפיע על כל התאים בתוך כלי הדם. כמה חיישנים מכאניים על האנדותל של כלי הדם לגזירת נוזל זוהו, כולל cilium העיקרי שמוצג במחקרים שנעשה לאחרונה לאנדותל mechanosensing 8. פעילות תאי האנדותל ומורפולוגיה מושפעות מהירות זרימה, כיוון, וpulsatility. בנוסף, תא שריר חלק הגירה (SMC) יכולה להיות מושפעת על ידי mechano-אותות של מהירות זרימה נמוכה עד 9 נוזל ביניים, וגם יכולה להיות דרך האיתות אוטוקריני מתאי האנדותל באמצעות תגובתם לזרום וmechano-התמרה של זרימת אותות באמצעות ציטוקינים לשחרר 10. תלות &quot;המנה&quot; של גזירה ממוצעת, PI, ואיתות אוטוקריני יכולה להיות גם תלות הדדית. לשם כך, קביעת תגובת תא כלי דם לגזירת נוזל עם &quot;מינון&quot; מגוון בתרבות monolayerאו שיתוף התרבות במבחנה יכולה לספק תובנות מכניסטית לשיפוץ כלי דם ולשפר את המחלה וחיזוי טיפול. מערכת הזרימה השתמשה בניסוי זה מורכב ממשאבת דם, מאגר אוויר זרימת דעיכת במעלה הזרם, מד זרימה במורד הזרם משמש רק במהלך התקנה ניסיונית, תרבית תאים במורד הזרם, תא זרימת לוחות מקבילים, ומאגר המדיה. בקרת הזרימה משתנה כלי דם כגון מתכוונים קצב זרימה, פעימות לדקה, וPI יכול להיות מושגת באמצעות קצב זרימת שליטה, תדירות דופק, והכנסה של לחץ דעיכת. משאבות דם פועמות זמינות עם עקירת שבץ משתנה, בתדירות שבץ מבוקרת, הנוגעות ישירות לאומרים קצב זרימת נפחית, ותדירות דופק. מבוא של מאגר אוויר בתוך זרימת המעגל מאפשר לדעיכת לחץ, צמצום גודל זרימת תנודה. תקשורת היא נוזל בלתי דחיס, בעוד אוויר בתוך חדר דעיכת הוא דחיסה, המאפשר לחץ עודף מזרימת הגל להיותנקלט על ידי דחיסת אוויר. האוויר ליחס תקשורת מאפשר שליטה על כמה דעיכת מתרחשת. תא זרימת תרבית תאים מותאם אישית 75 מ&quot;מ באורך של 50 מ&quot;מ ברוחב נוצר מאקריליק. הזרימה נכנסה דרך נמל הכניסה, ומרחיבה דרך סעפת היניקה, מתן זרימה עקבית בשלמות של תא הזרימה. זרימה ומבנים דומים נמצאות בתא שקע. תאים הם זורעים על גבי שקופיות פונקציונליות, ולאחר מכן מחובר לתא הזרימה. זה מאפשר לאוכלוסיות גדולות, לקח בקלות לאחר המחקר. ניסויי שיתוף התרבות יכולים להשתמש בקרום פוליקרבונט נקבובי לחסל מגע תא אל התא בין תרבויות, ובמקביל לאפשר ציטוקינים / זרימת תחבורה. מערכת זו בעבר שימשה מודל זרימה הגבוה PI והשפעתו על תרבות monolayer האנדותל ושיתוף תרבות EC / SMC 1, 10, לחקור תא תגובה למחלה לצרכן גבוהה פתולוגית. בתיאור הפרוטוקול המשמש למודל הזרימה קון אלהditions, אנו מקווים לסייע לאחרים בקביעת תרומת זרימת אות לתא תגובה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)trethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slide (70mm x 50mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS294775X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Membrane</td>
			<td>Millipore Corp.</td>
			<td>HTTP09030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Gasket</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>RD 475464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin (25 &#956;g/mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type-I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>36486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Damping Chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>529552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Vinyl Carbonate Tubing</td>
			<td>US Plastic</td>
			<td>65066, 65063, 65062</td>
			<td>Various sizes may be required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Connections</td>
			<td>Nordson Medical</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Chamber</td>
			<td>Machined in-house</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Petri Dish</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-14007-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slide Holder</td>
			<td>Capitol Scientific</td>
			<td>WHE-900303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Mediatech, Inc.</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Mediatech, Inc.</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter</td>
			<td>Sonotec, GmbH</td>
			<td>Sonoflow co.55/060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard Elastomer Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 G Steel Cannula</td>
			<td>General Laboratory Supply</td>
			<td>S8365-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model of physiological and pathological blood flow with application to investigations of vascular cell remodeling

מחלת כלי דם היא סיבה שכיחה למוות בארצות הברית. במסמך זה, אנו מציגים שיטה לבחון את התרומה של זרימת דינמיקה לקראת פתולוגיות מחלת כלי דם. עורקים בריאים לעתים קרובות נוכחי עם קיר התקשות, צלקות, או היצרות חלקית אשר עשוי להשפיע על כל שיעורי זרימת נוזל, ואת הגודל של זרימה פועמת, או מדד pulsatility. שכפול של תנאי זרימה שונים הוא התוצאה של כוונון לחץ זרימת דעיכת קאמרית במורד הזרם של משאבת דם. מבוא של אוויר בתוך מערכת זרימה סגורה מאפשר למדיום דחיסה לספוג לחץ פועם מהמשאבה, ולכן משתנה מדד pulsatility. השיטה המתוארת במסמך זה היא פשוט לשכפל, עם קלט השליטה ביותר, ותוצאות ניתן למדוד בקלות. מגבלות מסוימות הן בילוי של צורת גל המורכבת הפיזיולוגית הדופק, שנאמד רק על ידי המערכת. תאי אנדותל, תאי שריר חלק, ופיברובלסטים מושפעים זרימת דם through העורק. הרכיב הדינמי של זרימת דם נקבע על ידי עמידת פלט ודפנות העורקים של הלב. mechano-התמרה תא כלי דם של זרימת דינמיקה עלולה לעורר שחרור ציטוקינים והצטלבות בין סוגי תאים בתוך העורק. שיתוף התרבות של תאי כלי דם היא אינטראקציה תאי תאי תמונה המשקפת מדויקת יותר על קיר כלי דם ותגובת כלי דם לאיתות מכאנית. תרומה של זרימת דינמיקה, כולל תגובת התא למרכיבים הדינמיים וממוצעים (או יציבים) של זרימה, ולכן מדד חשוב בקביעת פתולוגיה מחלה ויעילות טיפול. באמצעות החדרת מודל שיתוף תרבות במבחנה ולחץ דעיכת במורד הזרם של משאבת דם אשר מייצרת תפוקת לב מדומה, פתולוגיות מחלת עורקים שונות עשויים להיחקר.

תחזוקה של תנאי זרימה היא סומך על הרכבה נכונה של זרימת המעגל (איור 1). צינורות בקוטר הוא בחירה חשובה בהרכבה, בקטרים ​​גדולים יותר צמצום זרימת התנגדות וירידה בלחץ הבא לפני ואחרי חדר התרבות. כדי להבטיח שנועדה מהירות לחץ וזרימה, להרכיב את המערכת עם מד זרימה לפני ?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling at JoVE.com

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

פרוטוקול זה משכפל את זרימת דם פיזיולוגית או פתולוגי במבחנה כדי לסייע בקביעת תגובת תא בפתולוגיות מחלה. על ידי החדרת לחץ דעיכת הקאמרית במורד הזרם של משאבת דם, זרימת דם בכלי הדם ברחבי ניתן סכמה והוטלה על monolayer של האנדותל של כלי דם או תרבות משותפת כוזב.

במבחנה הדגם של פיזיולוגי ופתולוגיים זרימת דם עם בקשה לחקירות של שיפוץ תא דם

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

in-vitro-model-physiological-pathological-blood-flow-with-application

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

9.5K Views.  University of Colorado at Boulder.  פרוטוקול זה משכפל את זרימת דם פיזיולוגית או פתולוגי במבחנה כדי לסייע בקביעת תגובת תא בפתולוגיות מחלה. על ידי החדרת לחץ דעיכת הקאמרית במורד הזרם של משאבת דם, זרימת דם בכלי הדם ברחבי ניתן סכמה והוטלה על monolayer של האנדותל של כלי דם או תרבות ...

Video: In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

התקן תזרים הלשכה תלת ממדי רומן ללמוד chemokine ביים-extravasation של תאים במחזור בתנאי זרימה פיסיולוגיים

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Shock Wave Application to Cell Cultures

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to target cells or tissue without any subsequent damage. Therefore, in vitro experiments are of increasing interest. Various methods of applying shock waves onto cell cultures have been described. In general, all existing models focus on how to best apply shock waves onto cells.
However, this question remains: What happens to the waves after passing the cell culture? The difference of the acoustic impedance of the cell culture medium and the ambient air is that high, that more than 99% of shock waves get reflected! We therefore developed a model that mainly consists of a Plexiglas built container that allows the waves to propagate in water after passing the cell culture. This avoids cavitation effects as well as reflection of the waves that would otherwise disturb upcoming ones. With this model we are able to mimic in vivo conditions and thereby gain more and more knowledge about how the physical stimulus of shock waves gets translated into a biological cell signal (&#8220;mechanotransduction&#34;).

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Therefore in vitro experiments are of increasing interest. We therefore developed a model for in vitro shock wave trials (IVSWT) that enables us to mimic in vivo conditions thereby avoiding distracting physical effects.

Shock Wave אפליקציות לסלולריים תרבויות

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

הנדסת רקמות של גידול סטרומה Microenvironment עם בקשה לפלישת תאי הסרטן

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to model well differentiated human airway epithelium and heart muscle cells. This could be an invaluable tool to study the deleterious effects of toxic inhaled chemicals, such as chlorine, that can normally interact with the cell surfaces, and form various byproducts upon reacting with water, and limiting their effects in submerged cultures. Our model using well differentiated human airway epithelial cell cultures at air-liqiuid interface circumvents this limitation as well as provides an opportunity to evaluate critical mechanisms of toxicity of potential poisonous inhaled chemicals. We describe enhanced loss of membrane integrity, caspase release and death upon toxic inhaled chemical such as chlorine exposure. In this article, we propose methods to model chlorine exposure in mammalian heart and airway epithelial cells in culture and simple tests to evaluate its effect on these cell types.

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

This protocol is designed to demonstrate exposure method of cell cultures to inhaled toxic chemicals. Exposure of differentiated air-liquid&#160;interface (ALI) cultures of airway epithelial cells provides a unique model of airway exposure to toxic gases such as chlorine. In this manuscript we describe effect of chlorine exposure on air-liquid&#160;interface cultures of epithelial cells and submerged culture of cardiomyocytes. In vitro exposure systems allow important mechanistic studies to evaluate pathways that could then be utilized to develop novel therapeutic agents.

בדגם תרבית תאים במבחנה לרעילה בשאיפת בדיקות כימיות

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

שימוש בעכבת Cell-מצע והדמיה של תא חי כדי למדוד שינויים בזמן אמת בסלולרית הידבקות ודה-הידבקות הנגרמים על ידי מטריקס שינוי

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

גירוי מבחן העין (EIT) לסיכוני זיהוי כימיקלים עיניים מעצבנים באמצעות אפיתל דגם רקמות כמו-קרנית משוחזר אדם (RHCE)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Microfluidic זרימה צ&#39;יימברס שימוש מחדש דם למודל המוסטאסיס ואת טסיות עירוי<em&gt; במבחנה</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

מודל לשכת תזרים Microfluidic עבור עירוי טסיות המוסטאסיס מודד הפקדת טסיות והיווצרות הפיברין בזמן אמת

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם תרבות איברים של הדיסק הבין חולייתי Murine

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...