Thanks to Jason Wright for suggesting the Golden Gate Assembly cloning strategy and Katherine Helming and members of Orkin lab, particularly Jian Xu, Guoji Guo, Elenoe Smith, and Partha Das for helpful discussions. This work was supported by NIH R01HL032259 and P30DK049216 (Center of Excellence in Molecular Hematology) to S.H.O. and NIDDK K08DK093705 to D.E.B.

<ol>
	<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. Z. F. N., TALEN, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas-based+methods+for+genome+engineering.">CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li><li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes.">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315, 1709-1712 (2007).</li><li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs.">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Larson, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+interference+(CRISPRi)+for+sequence-specific+control+of+gene+expression.">CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2180-2196 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li><li>Canver, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Genomic+Deletion+Efficiency+Mediated+by+CRISPR/Cas9+in+Mammalian+Cells.">Characterization of Genomic Deletion Efficiency Mediated by CRISPR/Cas9 in Mammalian Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (31), 21312-21324 (2014).</li><li>Xiao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+deletions+and+inversions+mediated+by+TALENs+and+CRISPR/Cas+in+zebrafish.">Chromosomal deletions and inversions mediated by TALENs and CRISPR/Cas in zebrafish.</a> Nucleic Acids Research. 41 (14), e141 (2013).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+sgRNAs+facilitate+CRISPR/Cas9+mediated+mouse+genome+targeting.">Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9 mediated mouse genome targeting.</a> The FEBS Journal. , (2014).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Gene-Modified+Cynomolgus+Monkey+via+Cas9/RNA-Mediated+Gene+Targeting+in+One-Cell+Embryos.">Generation of Gene-Modified Cynomolgus Monkey via Cas9/RNA-Mediated Gene Targeting in One-Cell Embryos.</a> Cell. 156 (4), 836-843 (2014).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+RNA/Cas9-mediated+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis.">Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Development. 141 (3), 707-714 (2014).</li><li>Xie, K., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+genome+editing+in+plants+using+a+CRISPR-Cas+system.">RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system.</a> Molecular Plant. 6 (6), 1975-1983 (2013).</li><li>Waaijers, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-targeted+mutagenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 195 (3), 1187-1191 (2013).</li><li>Bassett, A. R., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+and+Genome+Editing+in+Drosophila.">CRISPR/Cas9 and Genome Editing in Drosophila.</a> Journal of Genetics and Genomics. 41 (1), 7-19 (2014).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+Intestinal+Stem+Cell+Organoids+of+Cystic+Fibrosis+Patients.">Functional Repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in Intestinal Stem Cell Organoids of Cystic Fibrosis Patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+a+Genetic+Disease+in+Mouse+via+Use+of+CRISPR-Cas9.">Correction of a Genetic Disease in Mouse via Use of CRISPR-Cas9.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 659-662 (2013).</li><li>Lappalainen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+and+genome+sequencing+uncovers+functional+variation+in+humans.">Transcriptome and genome sequencing uncovers functional variation in humans.</a> Nature. 501 (7468), 506-511 (2013).</li><li>Bauer, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Erythroid+Enhancer+of+BCL11A+Subject+to+Genetic+Variation+Determines+Fetal+Hemoglobin+Level.">An Erythroid Enhancer of BCL11A Subject to Genetic Variation Determines Fetal Hemoglobin Level.</a> Science. 342 (6155), 253-257 (2013).</li><li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one+pot,+one+step,+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability.">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PloS One. 3, e3647 (2008).</li><li>Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation:+theory+and+methods,+perspectives+for+drug+delivery,+gene+therapy+and+research.">Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 177, 437-447 (2003).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+Plasmid+DNA+from+Bacterial+Colonies+Using+the+Qiagen+Miniprep+Kit.">Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit.</a> J. Vis. Exp. (6), e247 (2007).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Plasmid+DNA+into+E.+coli+Using+the+Heat+Shock+Method.">Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.</a> J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).</li><li>Finney, M., Nisson, P. E., Rashtchian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+PCR+products.">Molecular cloning of PCR products.</a> Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 15. (Unit 15.4), (2001).</li><li>Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Bacopulos, S., Seth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+Detection+in+Prostate+Tumors+by+Quantitative+Real-time+PCR+(qPCR).">MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR).</a> J. Vis. Exp. (63), e3874 (2012).</li><li>Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Culture+of+Human+Vestibular+Schwannomas.">Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas.</a> J. Vis. Exp. (89), e51093 (2014).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+Blotting:+Sample+Preparation+to+Detection.">Western Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).</li><li>McVey, M., Lee, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMEJ+repair+of+double-strand+breaks+(director&#8217;s+cut):+deleted+sequences+and+alternative+endings.">MMEJ repair of double-strand breaks (director&#8217;s cut): deleted sequences and alternative endings.</a> Trends in Genetics. 24 (11), 529-538 (2008).</li><li>Symington, L. S., Gautier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+break+end+resection+and+repair+pathway+choice.">Double-strand break end resection and repair pathway choice.</a> Annual Review of Genetics. 45, 247-271 (2011).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+off-target+mutagenesis+induced+by+CRISPR-Cas+nucleases+in+human+cells.">High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 822-826 (2013).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+binding+of+the+CRISPR+endonuclease+Cas9+in+mammalian+cells.">Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. , (2014).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs.">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> Nature Biotechnology. 32, 279-284 (2014).</li><li>Alem&#225;n, L. M., Doench, J., Sharp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Comparison+of+siRNA-induced+off-target+RNA+and+protein+effects.">a Comparison of siRNA-induced off-target RNA and protein effects.</a> RNA. 13 (3), 385-395 (2007).</li><li>Anderson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+validation+of+the+importance+of+seed+complement+frequency+to+siRNA+specificity+Experimental+validation+of+the+importance+of+seed+complement+frequency+to+siRNA+specificity.">Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity.</a> RNA. 14, 853-861 (2008).</li><li>Marine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+seed+analysis+to+identify+off-target+effects+in+siRNA+screens.">Common seed analysis to identify off-target effects in siRNA screens.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (3), 370-378 (2012).</li></ol>

We have no conflicts of interest related to this report.

CRISPR / מערכת Cas9 ניתן להשתמש כדי ליצור מחיקות הגנומי של מגוון רחב של גדלים. למרות שראינו כי שכיחותה של מחיקה משתנה ביחס הפוך ביחס לגודל מחיקה נועד, הצלחנו להתאושש מחיקות של עד 1 מגה, ומחיקות של עד 100 kb להניב באופן שגרתי שיבוטים biallelic נמחק מרובים. יש לנו לא הבחנתי בהפסד ביעילות של מחיקות ברצף מציגים לקו תא. אסטרטגיה זו יכולה לשמש ליצירת מחיקה קומבינטורית של גנים רבים ואלמנטים. תהליך קבלת שיבוטים מחיקת biallelic יכול להיות מזורז על ידי הערכת המספר המינימאלי של שיבוטים שצריכים לסרוק על בסיס גודל מחיקה כדי לקבל את המספר הרצוי של שיבוטים עם מחיקת biallelic 12. היכולת להשיג מחיקת monoallelic עם היעדר מחיקת biallelic בהפצה הסתברותי יכולה להצביע קטלני תא הקשורים לאובדן תפקוד מלא. fr הנמוך<html> equency או השמטות נעדרו יכול לשקף מספר התרחישים כוללים transfection העני, sgRNAs לא יעיל או לא יעילים פריימרים PCR הקרנה (בשל חוסר שליטה חיובית כדי לאמת פריימרים PCR למסך למחיקה). תאי GFP + יכולים לשמש כתחליף ליעילות transfection (ראה שלב 5.2), כך לירידה בGFP + תאים סביר משקפת transfection העני ותוצאה כך ירדו יעילות מחיקה. שימוש בשני זוגות sgRNA שונים עם פריימרים הקרנה עצמאיים יכול לעזור שליטה לsgRNA לא יעיל והקרנת פריימרים PCR ומקסם את סיכויי קבלת שיבוטים מחיקת biallelic. מיון התא לGFP + תאים מעשיר לאללים מחיקה. בעוד שניתן להשמיט את הצעד הזה, השמטה צפויה מחייבת הקרנה יותר שיבוטים לזהות אלו עם מחיקות monoallelic או biallelic. במידה שיעילות transfection עשויה להיות מותאמת, היינו מצפה יעילות עריכת הגנום להיות משופרת. = &quot;Jove_content&quot; ילדה&gt; אירועי NHEJ העומדים בבסיס מחיקות ותוצאת תיקון מקומי בסדרה של אללים עם מגוון רחב של indels באתרי היעד. התוצאה העיקרית היא ~ 1 קטנה - 10 הוספות נ&quot;ב או יותר נפוצה מחיקות באתר של מחשוף מכוון sgRNA (איור 2). לעתים קרובות אללים אלה מופיעים להיות התוצאה של 34,35 תיקון מבוסס microhomology. יש לציין כי אסטרטגית זיהוי מבוססת PCR אנו מתארים לא תזהה את הוספות גדולות יותר או מורכבות יותר, מחיקות, תנוחות הפוכות, או ארגון מחדש. למרות שהאירועים אלה הם פחות נפוצים, שראינו בו לא שיבוטים מחיקה ולא amplicons הלא המחיקה ניתן הייתה לזהות, ועל חקירה נוספת משקפים תוצאות אלה מורכבות יותר. אנו צפינו בCRISPR הנרחב / התיווך Cas9 &quot;צלקות&quot; של אללים שאינם מחיקה משיבוטי monoallelic ולא מחיקה (ראה איור 2). &quot;צלקות&quot; אלה כוללותindels הקטן המיוצר באתר מחשוף sgRNA ללא מחיקה המיועדת (כלומר, מחיקה של המגזר להתערב בין sgRNAs A ו- B). צלקות אלה לעתים קרובות להפריע הכרת מטרה על ידי sgRNA. לכן היינו ממליץ על זהירות בretargeting אללים בתאים שנחשפו בעבר לsgRNAs תוך שימוש באותה sgRNAs. אסטרטגית מיקוד מחדש מוצלחת יותר היה לנצל sgRNA ייחודי רצפים שונים מהעבר &quot;מצולק&quot; אתרי הכרה. במקרים שבם זוג sgRNAs מכיר רצפי exonic (איור 1, למטה), אללים frameshift עשוי להיות מיוצר גם בהיעדרו של מחיקה. לכן, יכולים להיות מועשרים שיבוטים מחיקת monoallelic לאובדן של פונקציה בשל התדירות הגבוהה של מוטציות frameshift על שאינם נמחק אלל 12. דאגה אחת עם CRISPR / מערכת Cas9 היא השפעות חוץ-היעד, כלומר, שינוי הגנומי באתרים לא רצויים 36-38. Rדיווחי ecent הציעו כי RNAs מדריך קצר עם 17-19 נוקלאוטידים יכול להפחית את התדירות של CRISPR / Cas9 מבוסס השפעות חוץ-יעד 39. בנוסף, אסטרטגיה כפול nicking באמצעות שני מדריכים לכל אתר יעד עם nickase יכולה לשמש כדי ליצור DSBs תוך מזעור השפעות חוץ-יעד 7. לחלופין, מקביל לאסטרטגיות המשמשות לRNAi, אנו מציעים שזוגות שונים של sgRNAs עם רצפי protospacer שאינו חופפים לשמש כדי להוכיח כי הפנוטיפ שנצפה היא התוצאה של CRISPR / השינוי Cas9 על-היעד בניגוד לפוטנציאל מחוץ היעד אפקט. גישה נוחה תהיה לתכנן לפחות שני זוגות sgRNA סמוכים אך אינם חופף, כך שקבוצה אחת של פריימרים הקרנה (ראה שלב 2) יכולה לשמש לזוגות רבים sgRNA (איור 1 א). יתר על כן, משלים קו תא מחיקה על ידי reintroducing הרצף החסר ו / או גן שיבש יכול לבסס קשר סיבתי ביןמחיקה נתון הגנומי ופנוטיפ. לביולוגים עבודה עם מערכות מודל סלולארי, RNAi ייצג כלי רב עוצמה לגנומיקה פונקציונלית. עם זאת, מגבלות של גישה זו כללו הפחתה חלקית ברמות תעתיק mRNA היעד, ההטרוגניות של השפעה של חומרים כימיים עצמאיים מיקוד אותו הגן, וידועות השפעות חוץ-היעד כוללים אפקטים מבוססי זרע ולא זרע 40-42. אסטרטגיות עריכת הגנום מבטיחות לטפל ברבים מחששות אלה ומייצגים גישה מרגשת, משלימה להפרעות גנטיות פוטנציאליים 8,36,37. יתר על כן, עריכת הגנום מאפשרת לחקר ללא קידוד אלמנטים גנטיים בדרך לא ניתן על ידי RNAi ומאתגרת על ידי מיקוד קונבנציונלי גישות 25. אנו מעודדים את הדור של מחיקות הגנומי ידי CRISPR / Cas9 כשיטת חזקה וספציפית כדי לייצר ולאפיין אללים פסד של פונקציה.

Recent advances in genome engineering technology have allowed for unprecedented opportunities for site-specific modification of the genome. This technology may be utilized to investigate the function of genes and regulatory elements via prospective genetic perturbation. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription-activator like (TAL) effector nucleases (TALENs), and CRISPR/Cas9 RNA-guided nucleases each leverage customizable DNA specificity to localize a nuclease for the introduction of DSBs1&#8211;3. The resulting DSBs can be repaired by indel-forming NHEJ or by homology-directed repair (HDR) using a donor template4.
The CRISPR/Cas9 nuclease pathway, an adaptive immune system in prokaryotic cells5, has been recently adapted for mammalian genome engineering2,3. This tool has been demonstrated to be an inexpensive, efficient, and reliable genome engineering technique6. Briefly, a complex of Streptococcus pyogenes-derived Cas9 nuclease and a sgRNA achieve target recognition via Watson-Crick base-pairing with cognate genomic DNA sequences. sgRNAs include 20-mer sequences complementary to genomic sequences adjacent to an obligate protospacer adjacent motif (PAM) NGG. Cas9 induces a DSB at a predictable position within the target site. Additionally, variants of Cas9 with single-strand cleavage capacity or catalytic inactivity may be used to facilitate &#8220;nicking&#8221; or transcriptional regulation respectively7&#8211;9. CRISPR/Cas9 has been used for a wide range of applications including both knock-in and knockout10,11, large-scale genomic deletions12&#8211;14, pooled library screening for gene discovery15,16, genetic engineering of numerous model organisms10,11,17&#8211;21, as well as gene therapy22,23.
Here we describe a protocol for efficient deletion of desired genomic regions. The protocol includes CRISPR design, cloning, and delivery, as well as deletion, identification, and characterization. Genomic deletions can be generated by the introduction of two CRISPR sgRNAs with Cas9 to induce repair of the resultant two DSBs by NHEJ with deletion of the intervening segment. This strategy has been used to create deletions ranging from one kilobase to over one megabase12. Deletions can be informative for the study of genes and other genetic elements, either in isolation or in combination. There are several potential advantages of genomic deletions as compared to HDR or single-site small indel production. First, this method capitalizes on the high efficiency of NHEJ in many cellular contexts7. The high frequency of deletion limits the number of clones needed to be screened to identify informative clones. Deletion frequency is inversely related to deletion size. Biallelic deletion clones may be retrieved at frequencies at least as great as of probabilistic expectation12. Second, both monoallelic and biallelic deletions may be easily identified and distinguished by conventional PCR, simplifying the screening process. Strategies relying on small indels or point mutations may require RFLP, allele-specific PCR, T7EN1 cleavage assay, Sanger sequencing, RT-qPCR, or immunoblotting, which may be more laborious. Third, by removing a substantial portion of a gene or element of interest, a reliable loss-of-function allele may be obtained. In contrast, frameshift mutations in protein-coding sequences may not always induce nonsense-mediated decay, may produce a hypomorphic or neomorphic allele, or target an exon excluded from an alternate isoform24. Finally, deletions may be particularly revealing for the study of non-coding DNA such as regulatory elements since frameshift mutations as produced by single-site indels would not be relevant25.

<table><tbody><tr><td>T4 polynucleotide kinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase (with associated ligation buffer)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&#039;-triphosphate (ATP)</td><td>New England Biolabs</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>BSA, molecular biology grade</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>BbsI restriction enzyme (with associated NEB Buffer 2.1)</td><td>New England Biolabs</td><td>R0539S</td><td></td></tr><tr><td>pSpCas9(BB) (pX330)</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. medium</td><td>Life Technologies</td><td>15544-034</td><td></td></tr><tr><td>BTX ECM 830</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0052</td><td></td></tr><tr><td>BTX solution and 2 mm cuvettes</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0803</td><td></td></tr><tr><td>pmaxGFP plasmid</td><td>Lonza</td><td>VPA-1003</td><td></td></tr><tr><td>QuickExtract DNA Extraction Solution</td><td>Epicentre</td><td>QE09050</td><td></td></tr><tr><td>HotStarTaq PCR Master Mix Kit</td><td>Qiagen</td><td>203443</td><td></td></tr><tr><td>Zero Blunt PCR Cloning Kit</td><td>Life Technologies</td><td>K2700-20</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid</td><td><a href="http://www.addgene.org/42230/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Addgene</a></td><td>42230</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of genomic deletions in mammalian cell lines via crispr/cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

מטרת ניסוי זה הייתה המחיקה של Pim1 בתאי MEL. שימוש בזוגות רבים שאינו חופף sgRNA (כלומר, רצפי protospacer עצמאיים) עשויים לעזור לשלוט על השפעות חוץ-יעד (איור 1 א). פנוטיפ עקבי יהיה סביר יותר כתוצאה מהשפעה על היעד בניגוד להשפעה מחוץ יעד משותפת של רצפי protospacer עצמאיים מרובים. כל זוג היה להוביל לייצור של נקודת עצירה מחיקה ייחודית. אם קרוב זה לזה (כלומר, n פחות מ ~ 150 נ&quot;ב), יכולים לשמש באותה פריימרים הקרנה לזהות מחיקות המיוצרות על ידי כל קבוצה של sgRNAs. מחיקות הגנומי עלולות לשבש גנים באמצעות זוגות sgRNA במקומות שונים ביחס לגן (איור 1). לדוגמא, זוג sgRNA יכול לאגף גן למחיקה של גוף הגן כולו; הזוג יכול להיות ממוקם בתוך שני אקסונים, עם הפוטנציאל ליצירת indels frameshift גם אם allel אחד או שניהםes לא נמחקו; או הזוג עשוי לאגף אקסון ספציפי כדי לאפשר שיבוש איזופורם מסוים. אסטרטגית המחיקה משמשת לPim1 הייתה לתכנן איגוף sgRNAs למחוק את כל גוף הגן, מחיקת 8 kb (איור 2). אסטרטגיה זו נבחרה בין שאר בשל גודלו הקטן יחסית של גן Pim1. דוגמא זו מראה PAM אחד (ירוק) בחלק העליון (ווטסון) הגדיל וPAM אחד בתחתית הגדיל (קריק); עם זאת, DSB הוא עצמאי של לוקליזציה רצף PAM לגדיל העליון או תחתון. זוגות sgRNA יכולים לקבל את שניהם רצפי PAM על הגדיל העליון, הן על הגדיל התחתון, או אחד מכל אחד. תוך שימוש בפרוטוקול שתואר לעיל, שתי sgRNA נועדו, משובטים לתוך וקטור ביטוי pX330, ונמסר לתאי MEL על ידי electroporation יחד עם כתב ה- GFP (איור 2 א). 3% העליונים של תאי GFP + מוינו יומיים לאחר electroporation ומצופים clonally בהגבלת דילול. מסךפריימרים ing תוכננו כמתואר בשלב 2 וכפי שמוצג באיור 2. תנאי PCR היו מותאמים באמצעות gDNA מבודד מתאי MEL הורים ומתאים &quot;בתפזורת&quot; מסודרים. 10 ימים לאחר הציפוי, gDNA היה מבודד מכל השיבוטים והוקרן למחיקה באמצעות PCR, שזיהה שאינו מחיקה, monoallelic ושיבוטי מחיקת biallelic פי הדפוסים של אי-מחיקה (ND) ומחיקה (D) amplicons (איור 3) . שיבוטים ללא מחיקה זוהו כבעלי הנוכחות של amplicon שאינו המחיקה והעדר amplicon המחיקה. שיבוטים Monoallelic זוהו כבעלי הנוכחות של שני הלא-המחיקה וamplicons מחיקה. שיבוטים Biallelic זוהו כבעלי העדר amplicon הלא המחיקה ואת הנוכחות של amplicon המחיקה. למחיקה זו, 400 שיבוטים הוקרנו אשר זיהה 126 שיבוטים מחיקת monoallelic ו -32 delet biallelic<html> שיבוטים יון (חשוב לשים לב כי תדירות מחיקה משתנה עם גודל מחיקה 12). שיבוטים מחיקת Biallelic נבחרו ועברו לצנצנות עם 8 מיליליטר של תקשורת. לאחר 5 ימים ומאפשרים להרחבה, כל שיבוט היה הערכה מחדש על ידי PCR של gDNA כדי לאשר amplicons מחיקה ומחיקת biallelic היו נתונים לסנגרו רצף לזהות את המחיקה המדויקת (איור 2). ההטרוגניות בתוך amplicons המחיקה משקפת תיקון NHEJ יוצרי indel מושלם. רצף של אלל הלא המחיקה בשיבוטי מחיקת monoallelelic חשפו indels ברוב המכריע של המקרים, הוכחה כי אפילו אלל-נמחק לא נערך לעתים קרובות על ידי CRISPR / Cas9, אשר עשוי להיות חשוב עבור יישומים בהם שני שיבוטים מחיקת monoallelic וbiallelic נדרשים . RNA היה מבודד משיבוטי מחיקת biallelic ונותח על ידי RT-qPCR כדי לאשר אובדן ביטוי Pim1 (איור 4). דרכים &quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52118/52118fig1highres.jpg" /> איור 1. סכמטי של אסטרטגיות מחיקה אפשריות. () זוגות sgRNA שתי דוגמא למחיקות הגנומי (מוצג בשחור וכתום, בהתאמה). החיצים הכחולים מצביעים על פריימרים לזהות amplicon הלא המחיקה וחצים אדומים מצביעים על פריימרים לזהות amplicon המחיקה. sgRNA ממקם 17 ו -18 מודגשים באדום וכחול בsgRNA-אתרים-1/2 ומודגשים בסגול וכתום בsgRNA-אתרים-B 1 / B 2 עם קו אדום מציין את מחשוף Cas9 חזה בין עמדות 17 ו18. שסעים (B) מכוון CRISPR מוצגים כקווים שחורים אנכיים. החיצים הכחולים מצביעים על פריימרים לזהות amplicon הלא המחיקה וחצים אדומים מצביעים על פריימרים לזהות amplicon המחיקה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52118/52118fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן לצפייה</a>גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52118/52118fig2highres.jpg" /> איור 2. אסטרטגיה לייצר ולזהות מחיקה של Pim1, כוללים מחיקת רצף ואללים שאינם מחיקות. () סכמטי של אסטרטגית ההקרנה מבוססת PCR לזהות שיבוטים מחיקת Pim1. זוג פריימר אחד ממוקם פנימי למחיקה (חיצים כחולים) וזוג פריימר אחד הוא מקומי חיצוני למחיקה (חצים אדומים). רצפי sgRNA (רצפי protospacer) מוצגים בסגול. הקווים האדומים האנכיים מצביעים על מחשוף Cas9 חזה בין עמדות 17 ו -18 של רצף sgRNA. סנגר רצף (B) מגלה היווצרות indel באתר הכרת sgRNA. רצפי sgRNA מוצגים ברצפים סגולים וPAM בירוק. אירועי מחיקה הם shשלו על ידי מספר דומה של סימני מקף והוספות מודגשים בכחול. קווים אדומים אנכיים מצביעים חזו אתר מחשוף, בין עמדות 17 ו -18 של sgRNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52118/52118fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52118/52118fig3highres.jpg" /> איור 3. ג&#39;ל נציג זיהוי שאינו מחיקה, monoallelic, ושיבוטים biallelic. עבור כל שיבוט, הנתיב השמאלי מייצג את amplicon הלא המחיקה (&quot;ND&quot; בכחול) והנתיב הימני מייצג את amplicon המחיקה (&quot;D&quot; באדום ). שיבוטים בודדים מופרדים על ידי קווים מקווקווים. שלושה השיבוטים מחיקת monoallelic הם שיבוטים 5, 6, ו -2 שלושה השיבוטים מחיקת biallelic הם שיבוטים 15, 17, 13. וכפי שניתן לראות בנתונים הרצף, להקת המחיקה לג<html> יש בודד 13 גודל קטן יותר בשל מחיקות גדולות יותר בצומת המחיקה. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52118/52118fig4highres.jpg" /> הפסד איור 4. ביטוי Pim1 בשיבוטי מחיקת biallelic. ביטוי Pim1 חושב לשני שיבוטים מחיקת biallelic על ידי RT-qPCR. הנתונים מנורמלים לGAPDH באמצעות 2 - שיטת ΔCt. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> Protospacer רצף </td></tr><tr><td> sgRNA- </td><td> 5&#39;-TAGGAAAATGACTCGTCACT-3 &quot; </td></tr><tr><td> sgRNA-B </td><td> 5&#39;-GTCTATCCTATCTCGATAAA-3 &quot; </td></tr></tbody></table> טבלה 1. רצפי protospacer 20-mer לשתי sgRNA למחיקה של Pim1. 543 &quot;&gt; <tbody><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;width:101px;"></td><td style="width:443px;"> משלים הפוך של רצף Protospacer </td></tr><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;"> sgRNA-A-rc </td><td> 5&#39;-AGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 &quot; </td></tr><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;"> sgRNA-B-rc </td><td> 5&#39;-TTTATCGAGATAGGATAGAC-3 &quot; </td></tr></tbody></table> טבלת 2. השלמה היפוך של רצפי protospacer לsgRNA שתי מטבלת 1. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> רצפים </td></tr><tr><td> sgRNA- </td><td> 5&#39;-CACCTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 &quot; </td></tr><tr><td> sgRNA-A-rc </td><td> 5&#39;-AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 &quot; </td></tr><tr><td> sgRNA-B </td><td> 5&#39;-CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 &quot; </td></tr><tr><td> sgRNA-B-rc </td><td> 5&#39;-AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 &quot; </td></tr></tbody></table> טבלת 3. רצפי Protospacer וההפוך שלהם משלים עם &quot;CACC&quot; ו- &quot;AAAC&quot;, הוסיפו לשיבוט לתוך וקטור pX330 באמצעות אנזים הגבלת BbsI. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> רצפים </td></tr><tr><td> sgRNA- </td><td> 5&#39;- CACCGTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 &quot; </td></tr><tr><td> sgRNA-A-rc </td><td> 5&#39;- AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTAC-3 &quot; </td></tr><tr><td> sgRNA-B </td><td> 5&#39;- CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 &quot; </td></tr><tr><td> sgRNA-B-rc </td><td> 5&#39;- AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 &quot; </td></tr></tbody></table> שולחן ביטוי 4. sgRNA מאמרגן U6 של וקטור pX330 מוגבר על ידי התוספת של נוקלאוטיד G לאחר רצף CACC ולפני20-mer. התוספת של נוקלאוטיד G נוסף דורשת תוספת של נוקלאוטיד C בסוף &#39;3 ​​של אוליגו המשלים ההפוך (למשל, sgRNA-A). עם זאת, אם המיקום הראשון של 20-mer (רצף protospacer) הוא כבר נוקלאוטיד G, אין צורך להוסיף G אחר (לדוגמא, sgRNA-B) ואין צורך להוסיף ג &#39;לעמדתו הסופית של ההשלמה ההפוכה אוליגו.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9 at JoVE.com

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

דור של מחיקות הגנומי בשורות תאים יונקים באמצעות CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

generation-of-genomic-deletions-in-mammalian-cell-lines-via-crisprcas9

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 2

Analyzing Gene Expression and Function

SCIENTISTS IN ACTION

95.3K Views.  Harvard Medical School. CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

Video: Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play in the functioning of cells and whole organisms. This cause has been tremendously aided by the recent introduction of the CRISPR/Cas9 system-a versatile tool that allows researchers to manipulate the genome and transcriptome in order to, among other things, knock out, knock down, or knock in genes in a targeted manner. For the purpose of knocking out a gene, CRISPR/Cas9-mediated double-strand breaks recruit the non-homologous end-joining DNA repair pathway to introduce the frameshift-causing insertion or deletion of nucleotides at the break site. However, an individual guide RNA may cause undesirable off-target effects, and to rule these out, the use of multiple guide RNAs is necessary. This multiplicity of targets also means that a high-volume screening of clones is required, which in turn begs the use of an efficient high-throughput technique to genotype the knockout clones. Current genotyping techniques either suffer from inherent limitations or incur high cost, hence rendering them unsuitable for high-throughput purposes. Here, we detail the protocol for using fluorescent PCR, which uses genomic DNA from crude cell lysate as a template, and then resolving the PCR fragments via capillary gel electrophoresis. This technique is accurate enough to differentiate one base-pair difference between fragments and hence is adequate in indicating the presence or absence of a frameshift in the coding sequence of the targeted gene. This precise knowledge effectively precludes the need for a confirmatory sequencing step and allows users to save time and cost in the process. Moreover, this technique has proven to be versatile in genotyping various mammalian cells of various tissue origins targeted by guide RNAs against numerous genes, as shown here and elsewhere.

The genotyping technique described here, which couples fluorescent polymerase chain reaction (PCR) to capillary gel electrophoresis, allows for high-throughput genotyping of nuclease-mediated knockout clones. It circumvents limitations faced by other genotyping techniques and is more cost effective than sequencing methods.

באמצעות טכניקה ג&#39;ל אלקטרופורזה פלורסנט PCR-נימי הגנוטיפ קריספר / Cas9 בתיווך נוק מוטאנטים בתוך פורמט תפוקה גבוהה

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Genetics

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide RNA (sgRNA) that confers specificity, the Cas9 protein cleaves both DNA strands at the targeted locus. The DNA break can trigger either non-homologous end joining (NHEJ) or homology directed repair (HDR). NHEJ can introduce small deletions or insertions which lead to frame-shift mutations, while HDR allows for larger and more precise perturbations. Here, we present protocols for generating knockout cell lines by coupling established CRISPR/Cas9 methods with two options for downstream selection/screening. The NHEJ approach uses a single sgRNA cut site and selection-independent screening, where protein production is assessed by dot immunoblot in a high-throughput manner. The HDR approach uses two sgRNA cut sites that span the gene of interest. Together with a provided HDR template, this method can achieve deletion of tens of kb, aided by the inserted selectable resistance marker. The appropriate applications and advantages of each method are discussed.

Recent advances in the ability to genetically manipulate somatic cell lines hold great potential for basic and applied research. Here, we present two approaches for CRISPR/Cas9 generated knockout production and screening in mammalian cell lines, with and without the use of selectable markers.

הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often located distally from the regulated gene in intergenic regions or even within the body of another gene. The position independent nature of enhancer activity makes it difficult to match enhancers with the genes they regulate. Deletion of an enhancer region provides direct evidence for enhancer activity and is the gold standard to reveal an enhancer's role in endogenous gene transcription. Conventional homologous recombination based deletion methods have been surpassed by recent advances in genome editing technology which enable rapid and precisely located changes to the genomes of numerous model organisms. CRISPR/Cas9 mediated genome editing can be used to manipulate the genome in many cell types and organisms rapidly and cost effectively, due to the ease with which Cas9 can be targeted to the genome by a guide RNA from a bespoke expression plasmid. Homozygous deletion of essential gene regulatory elements might lead to lethality or alter cellular phenotype whereas monoallelic deletion of transcriptional enhancers allows for the study of cis-regulation of gene expression without this confounding issue. Presented here is a protocol for CRISPR/Cas9 mediated deletion in F1 mouse embryonic stem (ES) cells (Mus musculus129 x Mus castaneus). Monoallelic deletion, screening and expression analysis is facilitated by single nucleotide polymorphisms (SNP) between the two alleles which occur on average every 125 bp in these cells.

Experimental validation of enhancer activity is best approached by loss-of-function analysis. Presented here is an efficient protocol that uses CRISPR/Cas9 mediated deletion to study allele-specific regulation of gene transcription in F1 ES cells which contain a hybrid genome (Mus musculus129 x Mus castaneus).

יצירת CRISPR / Cas9 מתווכת Monoallelic מחיקות ללמוד לתפקד Enhancer בתאי עכבר גזע עובריים

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Developmental Biology

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been successfully repurposed for genome engineering in many different living organisms. Most commonly, the wildtype CRISPR associated 9 (Cas9) or Cas12a endonuclease is used to cleave specific sites in the genome, after which the DNA double-stranded break is repaired via the non-homologous end joining (NHEJ) pathway or the homology-directed repair (HDR) pathway depending on whether a donor template is absent or present respectively. To date, CRISPR systems from different bacterial species have been shown to be capable of performing genome editing in mammalian cells. However, despite the apparent simplicity of the technology, multiple design parameters need to be considered, which often leave users perplexed about how best to carry out their genome editing experiments. Here, we describe a complete workflow from experimental design to identification of cell clones that carry desired DNA modifications, with the goal of facilitating successful execution of genome editing experiments in mammalian cell lines. We highlight key considerations for users to take note of, including the choice of CRISPR system, the spacer length, and the design of a single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor template. We envision that this workflow will be useful for gene knockout studies, disease modeling efforts, or the generation of reporter cell lines.

CRISPR-Cas is a powerful technology to engineer the complex genomes of plants and animals. Here, we detail a protocol to efficiently edit the human genome using different Cas endonucleases. We highlight important considerations and design parameters to optimize editing efficiency.

הגנום עריכה בשורות תאים בתרבית של שימוש CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian cells, this technology represents a novel means to perform genome-wide genetic screens for functional genomics studies. Libraries of guide RNAs (sgRNA) targeting all open reading frames permit the facile generation of thousands of genetic perturbations in a single pool of cells that can be screened for specific phenotypes to implicate gene function and cellular processes in an unbiased and systematic way. CRISPR-Cas screens provide researchers with a simple, efficient, and inexpensive method to uncover the genetic blueprints for cellular phenotypes. Furthermore, differential analysis of screens performed in various cell lines and from different cancer types can identify genes that are contextually essential in tumor cells, revealing potential targets for specific anticancer therapies. Performing genome-wide screens in human cells can be daunting, as this involves the handling of tens of millions of cells and requires analysis of large sets of data. The details of these screens, such as cell line characterization, CRISPR library considerations, and understanding the limitations and capabilities of CRISPR technology during analysis, are often overlooked. Provided here is a detailed protocol for the successful performance of pooled genome-wide CRISPR-Cas9 based screens.

CRISPR-Cas9 technology provides an efficient method to precisely edit the mammalian genome in any cell type and represents a novel means to perform genome-wide genetic screens. A detailed protocol discussing the steps required for the successful performance of pooled genome-wide CRISPR-Cas9 screens is provided here.

מסכי גנטי מבוססי CRISPR במאגר תאים ממיונקים

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

הדור של שינויים גנומית מוגדרים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם Pluripotent

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Electroporation-Based CRISPR-Cas9-Mediated Gene Knockout in THP-1 Cells and Single-Cell Clone Isolation

The human acute monocytic leukemia (AML) THP-1 cell line is widely used as a model to study the functions of human monocyte-derived macrophages, including their interplay with significant human pathogens such as the human immunodeficiency virus (HIV). Compared to other immortalized cell lines of myeloid origin, THP-1 cells retain many intact inflammatory signaling pathways and display phenotypic characteristics that more closely resemble those of primary monocytes, including the ability to differentiate into macrophages when treated with phorbol-12-myristate 13-acetate (PMA). The use of CRISPR-Cas9 technology to engineer THP-1 cells through targeted gene knockout (KO) provides a powerful approach to better characterize immune-related mechanisms, including virus-host interactions. This article describes a protocol for efficient CRISPR-Cas9-based engineering using electroporation to deliver pre-assembled Cas9:sgRNA ribonucleoproteins into the cell nucleus. Using multiple sgRNAs targeting the same locus at slightly different positions results in the deletion of large DNA fragments, thereby increasing editing efficiency, as assessed by the T7 endonuclease I assay. CRISPR-Cas9-mediated editing at the genetic level was validated by Sanger sequencing followed by Inference of CRISPR Edits (ICE) analysis. Protein depletion was confirmed by immunoblotting coupled with a functional assay. Using this protocol, up to 100% indels in the targeted locus and a decrease of over 95% in protein expression were achieved. The high editing efficiency makes it convenient to isolate single-cell clones by limiting dilution.

The THP-1 cell line is widely used as a model to investigate the functions of human monocytes/macrophages across various biology-related research areas. This article describes a protocol for efficient CRISPR-Cas9-based engineering and single-cell clone isolation, enabling the production of robust and reproducible phenotypic data.

נוקאאוט גנים בתיווך CRISPR-Cas9 מבוסס אלקטרופורציה בתאי THP-1 ובידוד שיבוט של תא בודד

The human acute monocytic leukemia (AML) THP-1 cell line is widely used as a model to study the functions of human monocyte-derived macrophages, including ...

Immunology and Infection

CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis

MicroRNAs (miRNAs) have emerged as important cellular regulators (tumor suppressors, pro-oncogenic factors) of cancer and metastasis. Most published studies focus on a single miRNA when characterizing the role of small RNAs in cancer. However, ~30%&#160;of human miRNA genes are organized in clustered units that are often co-expressed, indicating a complex and coordinated system of noncoding RNA regulation. A clearer understating of how clustered miRNA networks function cooperatively to regulate tumor growth, cancer aggressiveness, and drug resistance is required before translating noncoding small RNAs to the clinic.
The use of a high-throughput clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-mediated gene editing procedure has been employed to study the oncogenic role of a genomic cluster of seven miRNA genes located within a locus spanning ~35,000 bp in length in the context of prostate cancer. For this approach, human cancer cell lines were infected with a lentivirus vector for doxycycline (DOX)-inducible Cas9 nuclease grown in DOX-containing medium for 48 h. The cells were subsequently co-transfected with synthetic trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA) complexed with genomic site-specific CRISPR RNA (crRNA) oligonucleotides to allow the rapid generation of cancer cell lines carrying the entire miRNA cluster deletion and individual or combination miRNA gene cluster deletions within a single experiment.
The advantages of this high-throughput gene editing system are the ability to avoid time-consuming DNA vector subcloning, the flexibility in transfecting cells with unique guide RNA combinations in a 24-well format, and the lower-cost PCR genotyping using crude cell lysates. Studies using this streamlined approach promise to uncover functional redundancies and synergistic/antagonistic interactions between miRNA cluster members, which will aid in characterizing the complex small noncoding RNA networks involved in human disease and better inform future therapeutic design.

This protocol describes a high-throughput clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) gene editing workflow for microRNA cluster network analysis that allows the rapid generation of a panel of genetically modified cell lines carrying unique miRNA cluster member deletion combinations as large as 35 kb within a single experiment.

כלי עריכת גנים CRISPR לניתוח רשת אשכולות מיקרו-רנ"א

MicroRNAs (miRNAs) have emerged as important cellular regulators (tumor suppressors, pro-oncogenic factors) of cancer and metastasis. Most published ...

עריכת גנים הקשורים ל- Centromere Protein-E באמצעות מערכת CRISPR/Cas9

Generation of Centromere-Associated Protein-E CENP-E-/- Knockout Cell Lines using the CRISPR/Cas9 System

The CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 system has emerged as a powerful tool for precise and efficient gene editing in a variety of organisms. Centromere-associated protein-E (CENP-E) is a plus-end-directed kinesin required for kinetochore-microtubule capture, chromosome alignment, and spindle assembly checkpoint. Although cellular functions of the CENP-E proteins have been well studied, it has been difficult to study the direct functions of CENP-E proteins using traditional protocols because CENP-E ablation usually leads to spindle assembly checkpoint activation, cell cycle arrest, and cell death. In this study, we have completely knocked out the CENP-E gene in human HeLa cells and successfully generated the CENP-E-/- HeLa cells using the CRISPR/Cas9 system.
Three optimized phenotype-based screening strategies were established, including cell colony screening, chromosome alignment phenotypes, and the fluorescent intensities of CENP-E proteins, which effectively improve the screening efficiency and experimental success rate of the CENP-E knockout cells. Importantly, CENP-E deletion results in chromosome misalignment, the abnormal location of the BUB1 mitotic checkpoint serine/threonine kinase B (BubR1) proteins, and mitotic defects. Furthermore, we have utilized the CENP-E knockout HeLa cell model to develop an identification method for CENP-E-specific inhibitors.
In this study, a useful approach to validate the specificity and toxicity of CENP-E inhibitors has been established. Moreover, this paper presents the protocols of CENP-E gene editing using the CRISPR/Cas9 system, which could be a powerful tool to investigate the mechanisms of CENP-E in cell division. Moreover, the CENP-E&#160;knockout cell line would contribute to the discovery and validation of CENP-E inhibitors, which have important implications for antitumor drug development, studies of cell division mechanisms in cell biology, and clinical applications.

מחבר זרקור: הקמת תאי HeLa בנוקאאוט CENP-E – גישה חדשנית לחקר הביולוגיה של קינזין-7 CENP-E ומעכביו

This article reports the construction of centromere-associated protein-E (CENP-E) knockout cells using the CRISPR/Cas9 system and three phenotype-based screening strategies. We have utilized the CENP-E&#160;knockout cell line to establish a novel approach to validate the specificity and toxicity of the CENP-E inhibitors, which is useful for drug development and biological research.

יצירת Protein-E CENP-E-/- Knockout Cell Lines באמצעות מערכת CRISPR/Cas9

The CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 system has emerged as a powerful tool for precise and efficient gene editing ...

דור של מחיקות הגנומי בשורות תאים יונקים באמצעות CRISPR / Cas9

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

באמצעות טכניקה ג'ל אלקטרופורזה פלורסנט PCR-נימי הגנוטיפ קריספר / Cas9 בתיווך נוק מוטאנטים בתוך פורמט תפוקה גבוהה