פרוטוקול זה משתמש בתהליך עבודה של עריכת גנים בקריספר בתפוקה גבוהה כדי לנתח מולקולרית גנים של מיקרו-רנ"א יחידות מאורגנות ומקובצות. וכדי לקבוע כיצד רשתות RNA לא מקודדות אלה מתאמות את מסלולי התקדמות הסרטן. הליך עריכת גנים זה של קריספר מאפשר לחוקר ליצור במהירות פאנל שלם של קווי תאים הנושאים שילובים ייחודיים של מחיקת אשכולות מיקרו-רנ"א, תוך הימנעות משיבוט תת-וקטורי DNA הגוזל זמן רב.
שיטה זו תספק הבנה ברורה יותר של האופן שבו מיקרו-רנ"א מקובצים באשכולות מתפקדים בשיתוף פעולה כדי לווסת את צמיחת הגידול, האגרסיביות והעמידות לתרופות לפני שהם מתרגמים מיקרו-רנ"א למרפאה ככלי טיפולי ואבחוני. מי שתדגים את ההליך תהיה גרייס יי, עוזרת מחקר במעבדה שלי. כדי להתחיל, צור קובץ DNA המכיל את הרצף הגנומי המלא של אזור צביר המיקרו-רנ"א המעניין לפחות קילובייט אחד של אזורים גנומיים מסביב באמצעות תוכנת ביאור רצף DNA.
לאחר מכן, תכנן ארבעה RNA קריספר ייחודיים עבור כל מוקד מיקרו-רנ"א ממוקד. שני רנ"א קריספר מתוכננים כך שיתמקדו ברצפי דנ"א משלימים באופן מיידי חמישה פריימים של צביר סיכות המיקרו-רנ"א ושני רנ"א קריספר מתוכננים כך שיתמקדו ברצפי דנ"א משלימים באופן מיידי שלושה פריימים של צביר סיכות המיקרו-רנ"א. השתמש בכלי לעריכת תכונות בקובץ הדנ"א שנוצר כדי לסמן את רצף היעד של הדנ"א עבור כל רנ"א קריספר מתוכנן שיש לסנתז.
פריימרים מתוכננים ומסונתזים של PCR המאגפים את אזורי אשכולות המיקרו-רנ"א הממוקדים לגנוטיפ קווי תאי קריספר. בצעו עקומת ריכוז דוקסיציקלין על קווי תאי Cas9 חדשים שנוצרו ב-lenti inducible כדי לקבוע את התנאים האופטימליים להשראת חלבון Cas9. צלחת חמש פעמים 10 של התאים הרביעיים לכל באר של כל צלחת שש באר ולגדול ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, בתווך המועדף במשך 24 שעות.
דילול דוקס בתווך המועדף עם עקומת ריכוז דוקס סופית הנעה בין 0 5100, 150, 250 עד 500 ננוגרם למילי ליטר. תייג את הבארות של כל שש צלחות באר יושבות מאחת עד שש. מוציאים את המדיום ומחליפים בריכוזי הדוקס המתאימים.
לגדל צלחות אחת עד ארבע עד 24 שעות, 48 שעות, ו 72 שעות dox אינדוקציה ו 120 שעות לאחר גמילה dox. קציר בארות הצלחת בכל נקודת זמן. מעבדים את כדורי התא ואת מאגר הבשלה לבידוד ליזאט.
בצע ניתוח כתמים מערבי עם 40 מיקרוגרם חלבון כדי למדוד אינדוקציה של חלבון Cas9 ולקבוע ריכוז Cas9 אופטימלי. על הנייר, מפה את חמשת השילובים של זוגות רנ"א ראשוניים ושלושה ראשוניים של CRISPR שיועתקו לכל באר של לוח באר 24 המכוון לכל צביר המיקרו-רנ"א, שילובים שונים של גנים של מיקרו-רנ"א אשכולות, כמו גם חברים בודדים של צבירי מיקרו-רנ"א. צלחת ה-lenti inducible יצוקה תשעה קו תאים בחמש פעמים 10 לתאים הרביעיים לכל באר של צלחת 24 באר בתווך המועדף המכילה את ריכוז הדוקס האופטימלי.
לגדל את התאים במשך 24 עד 48 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני כדי לגרום לביטוי חלבון Cas9. טרנספקט את תאי Cas9 האינדוקטיביים של lenti עם חמישה רנ"א ראשוניים ושלושה מנחים ראשוניים. תייג ארבעה צינורות מיקרו-צנטריפוגה בקוטר 1.5 מיליליטר לכל מוקד מיקרו-רנ"א ממוקד.
בכל צינור, ערבבו יחס טוחן אחד לאחד של RNA עוקב ו-RNA קריספר ייחודי יחד כדי ליצור את קומפלקס הרנ"א המנחה את שני המיקרומולר. הוסף 2.5 מיקרוליטרים של RNA עוקב, 1.25 מיקרוליטרים של חמשת ה- RNA של קריספר במיקום ראשוני, 1.25 מיקרוליטרים של שלושת ה- RNA של קריספר במיקום ראשוני, וחמישה מיקרוליטרים של 10 מילימולר tris hcl pH 7.5 חיץ לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. מיקרו צנטריפוגה במשך 30 שניות ב 16, 000 פעמים G לערבוב.
לדגור בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לכל צינור ב 40 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת ל 10 מיקרוליטר של תגובה מורכבת RNA מנחה. מערבבים בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה.
בצינור צנטריפוגה נקי של 1.5 מיליליטר, ערבבו שני מיקרוליטרים של מגיב הטרנספקציה ו-48 מיקרוליטרים של מדיום סרום מופחת בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה. לדגור בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לכל צינור המכיל את 50 המיקרוליטרים של תערובת RNA מנחה, הוסף את 50 המיקרוליטרים של מגיב הטרנספקציה המדולל.
צלע את התערובת לאט לאט למעלה ולמטה פעם אחת כדי לערבב. לדגור בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. הוסיפו 400 מיקרוליטרים של מדיום נטול אנטיביוטיקה בתוספת דוקסיציקלין לכל צינור המכיל את 100 המיקרוליטרים של תערובת ה-RNA המנחה.
פיפטה בעדינות כדי לערבב. הסר את המדיום מתאי Cas9 המושרים על ידי doxycycline lenti. הוסף 500 מיקרוליטרים של תערובת טרנספורמציית RNA מנחה מדיה המבוססת על מפת הניסוי של 24 לוחות באר.
לדגור על התאים הטרנספקטיביים במשך 48 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו-חמצני. החלף את המדיום במדיום המוכן טרי ללא דוקסיציקלין. אפשרו לתאים להתאושש למשך 24 עד 48 שעות נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני.
קצור את התאים שעברו טרנספקציה והתכונן לגנוטיפ ולאשליות של תאים בודדים. הפרד את 150 המיקרוליטרים של תאים שעברו החייאה לשלושה חלקים. הקפיאו שליש מהתאים שעברו שינוי במדיום בתוספת 10% DMSO בבקבוקוני קריו לאחסון לטווח ארוך.
העבר שליש מהתאים שעברו טרנספקציה לצינור PCR נקי של 0.2 מיליליטר לגנוטיפ. הכן את השליש האחרון של התאים שעברו טרנספקציה לספירה ודילול בתבנית של 96 לוחות באר כדי ליצור מושבות של תאים בודדים. באמצעות פייפטר רב-ערוצי של 12 ערוצים ומאגר ריאגנטים סטרילי, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של תאים מדוללים לכל באר לשתי שורות של הצלחת עבור כל דילול.
הקדישו ארבעה עד שישה שבועות עד שהתאים יגדלו לכדי שיתוף פעולה להרחבת מושבה חד-תאית. לאסוף כ 10 עד 15 מושבות תאים בודדים עבור גנוטיפ. זהה לפחות שלושה קווי מושבת חד-תאיים עצמאיים עבור כל מוקד מיקרו-רנ"א ממוקד.
שמור על שורות תא בודד מסוג פראי כפקדים. Resuse היה גלולת התא בארבעה מיקרוליטרים של חמישה חיץ X DNA פולימראז, מיקרוליטר אחד של פרוטאינאז K, מיקרוליטר אחד של RNase A, ומים נטולי נוקלאז עד לנפח כולל של 20 מיקרוליטר. כינים במחזור התרמו-מחזורי בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ו-96 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.
אחסנו את התא בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס עד שיהיו מוכנים לגנוטיפ PCR. בצע תגובת גנוטיפ של PCR באמצעות פריימרים מתוכננים של PCR המאגפים את ה-RNA המנחה חמישה אתרים ראשוניים ושלושה אתרים ממוקדי RNA מנחים ראשוניים. הפעל את תגובת ה- PCR בתרמוציקלר באמצעות התוכנית המוזכרת בכתב היד של הטקסט.
העמיסו את מוצרי ה-PCR על ג'ל 1%אגרוז לניתוח אלקטרופורזה. חלץ דנ"א מקטעי ה-PCR המבודדים בגודל המולקולרי החזוי עבור הגנוטיפים של הנוקאאוט. הכינו את הדגימות לריצוף DNA.
לאמת שתגובת הקריספר הייתה מוצלחת ולבצע ריצוף DNA של מקטעי ה-PCR המבודדים כדי לזהות את אתר המחשוף Cas9 ולאשר את מחיקת לוקוס המיקרו-רנ"א. תוכננו רנ"א קריספר ייחודיים שהתמקדו בכל אזור האשכולות miR-888 של בסיסים במשקל 35 קילו. שילובי צבירים קטנים יותר בתוך משפחת miR-743 או משפחת miR-891 וכן מחיקות מיקרו-רנ"א.
ניתוח אלקטרופורזה בג'ל של תגובות ה-PCR הצביע על כך שגודל מקטע הדנ"א החזוי המייצג את הגנוטיפ של הנוקאאוט הוגבר עבור כל טרנספקציה של קריספר. מושבות של תאים בודדים עברו גנוטיפ על ידי PCR ברצף מאומת. ריצוף הדנ"א של מקטעי ה-PCR המבודדים האלה אישר כי חמשת ה-RNAs הראשוניים ושלושת ה-Prime Guide מכוונים את קשירת המחשוף של Cas9 בערך שלושה נוקלאוטידים במעלה הזרם של אתרי PAM ואובדן גנומי מאומת של מוקד המיקרו-רנ"א הממוקד.
מבחני התפשטות WST-1 המשווים בין נוקאאוט miR-891a לתאים מסוג פראי מאשרים כי ביטוי יתר של מיקרו-רנ"א מחקה וקטור לנטי-ויראלי גורם לצמיחת תאי ערמונית ולכן נחזה כי אובדן miR-891 יראה השפעות הדדיות. מלבד תכנון RNA מנחה זהיר, חשוב ליצור במהירות מושבות של תאים בודדים דרך כל קו נוקאאוט של מיקרו-רנ"א. זה רלוונטי במיוחד אם תאי הנוקאאוט של המיקרו-רנ"א הפחיתו את הצמיחה של הכדאיות והיו עולים בקלות על אוכלוסיות מעורבות עם תאים מסוג בר.
יש לבצע שיטות נוספות כגון PCR כמותי בזמן אמת, כתם צפוני וריצוף RNA כדי לאשר שקווי תאי הנוקאאוט של הקריספר אינם מבטאים מיקרו-רנ"א בוגר עבור הלוקוס שנמחק.
