Thanks to Jason Wright for suggesting the Golden Gate Assembly cloning strategy and Katherine Helming and members of Orkin lab, particularly Jian Xu, Guoji Guo, Elenoe Smith, and Partha Das for helpful discussions. This work was supported by NIH R01HL032259 and P30DK049216 (Center of Excellence in Molecular Hematology) to S.H.O. and NIDDK K08DK093705 to D.E.B.

1. CRISPR Design- <ol><li> Design sgRNAs manuell oder mit frei verfügbaren Online-Tools 7. Verwenden Sie diese Werkzeuge, um zur Ermittlung Leitsequenzen, die identisch genomische Spiele oder nahezu Spiele zu minimieren, um das Risiko der Spaltung von Zielseiten (Off-Target-Effekte) zu reduzieren. Sicherzustellen, dass die Führungssequenzen bestehen aus einem 20-mer (&quot;protospacer Sequenz&quot;) stromauf eines &quot;NGG&quot; -Sequenz (&quot;protospacer benachbarten Motiv&quot; oder PAM) auf genomischer Erkennungsstelle. ANMERKUNG: Abbildung 1 beschreibt mögliche Strategien für die Gene und nicht-codierenden Elementen Löschung. Für die Erstellung einer Gen-Knockout werden zwei sgRNA innerhalb Exons liegen noch monoallelic Deletionsklonen zum Funktionsverlust zu bereichern. Dies ist aufgrund der hohen Frequenz der indels auf nicht-deletierten Allele 12 ausgebildet, die geeignet sind, Frameshift-Mutationen, die zu Nonsense-vermittelten Abbau des mRNA-Transkripts (1B) zu verursachen. </li><li> Verwenden Sie dieBeispiel führt für die vorgesehene Streichung von Pim1 in der Maus (Mus musculus; Tabelle 1, Abbildung 2A). HINWEIS: In diesem Beispiel ist sgRNA-A protospacer Folge und PAM zufällig auf dem Boden (Crick) Strang fallen, während protospacer Folge und PAM sgRNA-B auf der Oberseite (Watson) Strang (Abbildung 2A) fallen. Jedoch wird DSB treten unabhängig von Ausrichtung des protospacer Sequenz / PAM relativ zum oberen oder unteren Strang. </li><li> Bestimmen Sie die reverse Komplement (rc) jedes Führungssequenz. Beispiel Reverse Ergänzung Sequenzen des Pim1 sgRNA aus Tabelle 1 sind in Tabelle 2 zu finden. </li><li> Erhalten 24- oder 25-mer Oligonukleotide für jede Führung und die damit verbundenen reverse Komplement einschließlich zusätzliche Nukleotide zur Klonierung und Expression Zwecke. HINWEIS: die Nutzung der pSpCas9 (BB) Plasmid (pX330) (Addgene Plasmid-ID 42230) Hier diskutieren wir. Dieses Plasmid ermöglicht die gleichzeitigeExpression sgRNA und SpCas9, aber nicht Marker für Selektions 7 enthalten. Andere Konstrukte können verwendet werden, wie pX458 (Addgene Plasmid ID 48138) oder pX459 (Addgene Plasmid ID 48139), die GFP und Puromycin als Selektionsmarker bzw. oder Konstrukte, bei dem mehrere sgRNAs können aus einem einzigen Plasmid exprimiert, umfassen. <ol><li> Add &quot;CACC&quot; vor dem 20-mer-Führungssequenz und &quot;AAAC&quot; vor des Führers reverse Komplement zur Klonierung in den Vektor mit pX330 BbsI Restriktionsenzym (Tabelle 3). </li><li> Hinzufügen eines G-Nucleotid nach CACC-Sequenz und vor dem 20-mer, wenn die erste Stellung des 20-mer nicht G. sgRNA Expression vom U6-Promotor des pX330 Vektor wird durch den Einschluss von einem G-Nukleotid nach CACC-Sequenz erhöhte . Hinzufügen eines C am 3&#39;-Ende des reversen Komplement Oligo (zB sgRNA-A in Tabelle 4). Die sich daraus ergebenden Oligos würde 25-mer Oligonukleotide sein. </li><li> Wieimmer, wenn die erste Stellung des 20-mer (protospacer Sequenz) ist G, die keinen Mehr weiteren G (zB sgRNA-B in Tabelle 4) und nicht in die Endposition des revers-komplementären Oligo hinzuzufügen C. In diesem Fall würden die resultierenden Oligos 24mer Oligos (Tabelle 4) liegen. </li></ol></li></ol> 2. Design Löschen Screening Grundierungen <ol><li> Entwurf eines Satzes von Primern innerhalb des Sequenz gelöscht (&quot;non-Deletion Band&quot;) und einen anderen Satz von Primern stromaufwärts und stromabwärts der sgRNA Spaltstellen (&quot;Deletion band&quot;; Figuren 1 - 2). In Abwesenheit des Löschens ist der &quot;Löschen-Band&quot; oft zu groß, um effizient zu verstärken. Typischerweise verwenden Primer mindestens 100 bp von der vorhergesagten Spaltstelle, um sicherzustellen, Detektion nicht durch eine kleine indel am sgRNA Zielstelle beeinträchtigt. <ol><li> Gestalten Sie zusätzliche Primer, um Narben zu analysieren (kleine indels am sgRNA c hergestelltlaub Website ohne den beabsichtigten Löschung). Verwenden Sie ein Paar Vorwärts- und Rückwärtsprimer flankieren jede sgRNA Zielort (innerhalb von 150 bis 350 bp), die sgRNA Zielort für die Narbenbildung zu untersuchen zu verstärken. Dies kann nützlich sein, um die nicht-deletierten Allele in monoallelic Deletionsklone charakterisieren. </li></ol></li><li> Für kleine Deletionen (als der &quot;Löschen-Band&quot; kann noch verstärken), zu lösen Amplicons wurden auf einem Agarose-Gel, um zu bestimmen, ob eine Größe im Einklang mit der Anwesenheit oder Abwesenheit des Löschens. Für diesen Ansatz können die in Schritt 2.1 beschrieben internen Primer verzichtet werden. </li></ol> 3. CRISPR Klonen <ol><li> Glühen und phosphorylieren Oligos. <ol><li> Resuspendieren Oligos bei einer Konzentration von 100 &amp; mgr; M in ddH 2 O. </li><li> Bereiten Sie eine 10 &amp; mgr; l Reaktionsgemisch für jede Führung und seine reverse Komplement: 1,0 ul sgRNA 24- oder 25-mer Oligo (100 uM, siehe Schritt 1.4), 1,0 ul sgRNA 24- oder 25-mer Reverse complement-Oligo (100 uM; siehe Schritt 1.4), 1,0 ul 10x Ligationspuffer T4, 6,5 ul ddH &amp; sub2; O und 0,5 ul T4 Polynukleotidkinase (PNK) (10.000 U / ml). HINWEIS: phosphoryliert Oligos kann stattdessen bestellen. Für diesen Ansatz ist die Verwendung von T4-PNK weggelassen. </li><li> Glühen in einem Thermocycler mit den folgenden Parametern: 37 ° C für 30 min; 95 ° C für 5 min, dann Rampe auf 25 ° C bei 5 ° C / min. </li><li> Verdünne Oligos 1:10 in ddH 2 O (beispielsweise 1,0 &amp; mgr; l geglüht Oligos + 9,0 &amp; mgr; l ddH 2 O auf eine Konzentration von 1 &amp; mgr; M zu ergeben). </li></ol></li><li> Ligieren geglüht Oligos in pX330 mit einem Golden Gate Montage Klonierungsstrategie 26. <ol><li> Bereiten Sie eine 50 ul Reaktionsansatz: 100 ng Rund pX330 Vektor, 1,0 ul geglüht Oligos (1 &amp; mgr; siehe Schritt 3.1.4), 5,0 ul Restriktionsenzym Puffer (10x), 4,0 ul (20 U) BbsI Restriktionsenzym (5.000 U / ml), 5,0 μl ATP (10 mM), 0,25 ul (5 ug), BSA (20 mg / ml), 0,375 ul (750 U) T4 DNA Ligase (2000000 U / ml) und H 2 O auf ein Endvolumen von 50 ul. Diese Reaktion kann auf eine kleinere Endvolumen skaliert werden, wenn nötig. </li><li> Führen Proben in einem Thermocycler unter Verwendung der folgenden Parameter: Zyklen 1-20 (37 ° C für 5 min, 20 ° C für 5 min); Zyklus 21 (80 ° C für 20 min). Diese Zyklusbedingungen erlauben für die Verdauung und Ligation in einer Reaktion (siehe Schritt 3.2) auftreten. </li><li> Transform 10 ul DH5 E. coli-Zellen mit 1 &amp; mgr; l der Reaktion (ab 3.2.1 - 3.2.2). </li><li> Platte auf einem LB-Medium (LB) Agarplatten mit 100 ug / ml Ampicillin und Inkubieren O / N bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Wählen Sie 2-3 Kolonien und impfen zu einem Mini-Prep-Kultur. <ol><li> Führen Mini-Prep für jede Probe und Sequenz jede Kolonie mit einem U6-Promotor Vorwärtsprimer: CGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGC. Dies ist arepräsentativer Sequenzierprimer; andere flankierende Primer verwendet werden können. </li></ol></li><li> Wählen Sie eine Sequenz-verifiziert Kolonie und impfen zu einem Maxi-Prep-Kultur. Prep Größe kann auf der Grundlage der erforderlichen DNA-Ausbeute skaliert. </li><li> Führen Maxi-Prep für jeden CRISPR / Cas9 Konstrukt. </li></ol> 4. Transfektion CRISPRs in Zellen von Interesse Hinweis: Dieses Protokoll umfasst die Lieferung von CRISPR / Cas9 Plasmiden durch Elektroporation 27. Dieses Protokoll wird im Detail für murinen Erythroleukämie (MEL-Zellen), eine Suspension Zelllinie beschrieben. Das Kulturmedium in allen Schritten besteht aus DMEM mit 2% Penicillin / Streptomycin und 1% L-Glutamin, die MEL-Zellen verwendet wird, ergänzt wird. Jedoch transiente Transfektion von CRISPR / Cas9 Plasmide erfolgreich in zahlreichen Zelltypen mit bevorzugten Kulturbedingungen und Transfektion Strategien für jeden Zelltyp angepasst werden. Während MEL Zellen Suspensionszellen, Anweisungen für die anhaftenden Zellen have ebenfalls enthalten. <ol><li> Stellen Sie sicher, gibt es 2 x 10 6 Zellen pro CRISPR Paar. Resuspendieren 2 x 10 6 Zellen in 100 ul Elektroporation Lösung und in den Elektroporationsküvette. <ol><li> In 5 ug jedes CRISPR / Cas9 Konstrukt (10 ug insgesamt). In 0,5 ug GFP-Expressionskonstrukt. </li></ol></li><li> Elektroporieren Zellen mit 250 Volt für 5 ms in einer 2 mm Küvette mittels eines Elektroporationssystem. HINWEIS: Alternativ verwenden Sie einen anderen Transfektionsverfahren wie kationische Liposomen basierende Transfektion. Optimieren Transfektionsbedingungen für jede Zelllinie mit einem Reporterkonstrukt, um robuste Plasmid Liefer bevor Genom Bearbeitung zu gewährleisten. </li><li> Lösung sofort aus Küvette übertragen nach der Elektroporation in 1 ml Kulturmedien. Minimieren Sie die Zeit zwischen der Elektroporation und Übertragen der Lösung in Medien, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern. </li><li> Inkubation bei 30 - 37 ° C für 24 bis 72 h. 30 ° C kann Genom verbessernBearbeiten Effizienz, sondern 37 ° C ist akzeptabel. </li></ol> 5. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) von transfizierten Zellen <ol><li> Vorbereitung der Zellen für FACS durch Filtern sie durch ein 50 um-Filter in ein FACS-Rohr. </li><li> FACS sortieren Sie die oben ~ 3% der GFP-positiven Zellen, um für Zellen, die große Mengen des CRISPR erhalten bereichern / Cas9 konstruiert. </li><li> Platte sortierten Zellen einzeln in 96-Well-Rundbodenplatten mit Sortierers oder durch Verwendung von Grenzverdünnung bei 30 Zellen pro 96-Well-Rundbodenplatte. Optimieren Plattieren der Zelltyp bei Grenzverdünnung vor der Durchführung dieses Schrittes um etwa 30 Zellen pro 96-Well-Platte zuverlässig zu erhalten. </li><li> Umfassen 100 ul pro Vertiefung von Zellkulturmedien. </li><li> Für die verbleibenden sortierten Zellen (&quot;bulk&quot;), die nicht plattiert wurden, gefrier Hälfte der Zellen für zukünftige Plattierung. Platte, die andere Hälfte für das Screening und Primer Validierung (siehe Schritt 6). HINWEIS: Diese protocol ist für Suspensionszellen. Adhärente Zellen können entweder wachsen, wie einzelne Zellen in 96-Well-Flachbodenplatte oder in einem 10-cm-Spiegel bei niedriger Konzentration, so dass einzelne einzellige abgeleitete Klone können abgeholt und in eine Flachboden-96-Well-Platte werden. </li><li> Ermöglichen, dass die Großzellen bei 37 ° C für 3 inkubieren - 7 Tagen und ermöglichen, dass die Klone bei 37 ° C für 7 inkubieren - 14 Tagen. Variieren diese Zeiten in Abhängigkeit von der Verdopplungszeit der Zelllinie verwendet. HINWEIS: Diese Inkubationszeit kann für eine ausreichende Zellproliferation für das Screening genomischer DNA (gDNA) für die vorgesehene Streichung von PCR (siehe Schritte 6.1 und 7.1). Die Großzellen ausreichend vermehrt, wenn die Konzentration von mehr als ~ 100.000 Zellen / ml oder für adhärente Zellen wurden die Zellen ~ 80% Konfluenz erreichten. Die Klone wurden ausreichend vermehrt einmal makroskopisch mit ~ 2 mm Durchmesser sichtbar. </li></ol> 6. Primer Validierung und Screening für CRISPR / Cas9-vermittelte Deletion <ol><li> Isolieren gDNA von Eltern- und Groß sortierten Zellen durch Resuspendieren der Eltern und Großzellpellets in 50 ul DNA-Extraktionslösung. HINWEIS: In der Regel ~ 100.000 Zellen für die DNA-Extraktion verwendet wird, obwohl eine Vielzahl von Zellzahlen ist akzeptabel. Die Schütt aussortierte Zellen eines polyklonalen Population sgRNA-A und sgRNA-B ausgesetzt zusammensetzt (siehe Schritt 5). Der Zweck des folgenden PCR-Primer ist es, zu überprüfen, und überprüfen Sie das Vorhandensein soll genomische Deletion. </li><li> Führen Probe im Thermocycler und führen Sie das folgende Programm: 65 ° C für 6 min, 98 ° C für 2 Minuten, um gDNA zu extrahieren. Messung der DNA-Konzentration. HINWEIS: Bei Schritten 6.1 und 6.2 empfohlen, ein effizientes Verfahren zur DNA-Extraktion, kann jedes Verfahren zur Isolierung genomischer DNA verwendet werden, um in der Lage, PCR in Schritt 6.3 durchführen zu können. </li><li> Stellen Sie ein 20 ul PCR mit den folgenden Komponenten: 10 ul 2x PCR-Mix, 0,5 ul Vorwärts-Primer (10 _6; M), 0,5 ul Reverse-Primer (10 uM), 50-100 ng gDNA und H 2 O bis zu 20 &amp; mgr; l. Verwenden der Primer in Schritt 2 oben entwickelt. Führen PCR für &quot;Nicht-Löschen-Band&quot; und &quot;Löschen Band&quot; in getrennten Reaktionen. HINWEIS: Zahlreiche Polymerasen für Schritt 6.3 verwendet werden. <ol><li> Führen Proben im Thermocycler mit den folgenden Parametern: 95 ° C für 15 min, 35 Zyklen (95 ° C für 30 sec, 60 ° C für 1 min, 72ºC für 1 min) und 72 ° C für 10 min . Optimieren PCR-Bedingungen für jedes Primerpaar basierend auf der Prüfung der Groß sortierten Zellen ausgelegt. </li></ol></li><li> Führen Proben auf einem 2% igen Agarosegel bei 10 V / cm mit 1x Tris-Acetat-EDTA-Puffer (TAE). </li><li> Untersuchen Proben auf die Anwesenheit / Abwesenheit von nicht-Deletion und Löschung Bänder (Abbildung 2). Betrachten Multiplexen der &quot;Löschen&quot; und &quot;Nicht-Löschen&quot; PCR-Primerpaare in einer einzigen Reaktion. Optimieren Multiplexingin einem polyklonalen Population (dh sortiert Großzellen) vor Screening einzelner Klone. Es ist kritisch, daß die Lösch- und Nichtlösch Amplikons einfach auf einem Agarose-Gel für das Multiplexen gelöst werden. </li></ol> 7. Screening CRISPR / Cas9 Clones für Streichungen und Clone Auswahl <ol><li> Für Suspensionskulturen, übertragen alle Klone auf einen einzigen 96-Well-Platte, das bereits 50 ul Zellkulturmedien pro Vertiefung ein Endvolumen von 150 ul. Dies erleichtert Screening indem eine Mehrkanalpipette, um die restlichen Schritte in Schritt 7 verwendet werden. <ol><li> Transfer 50 ul aus jeder Vertiefung (Abfahrt 100 ul in jede Vertiefung) auf einer 96-Well PCR-Platte mit einer Mehrkanalpipette. </li><li> Zentrifugen-PCR-Platte bei 400 xg für 5 min und entfernen Überstand Dazu den PCR-Platte über ein Waschbecken. Fügen Sie 50 ul der DNA-Extraktionslösung pro Vertiefung und resuspendieren. Weiterhin für Suspensionszellen Schritt 7.3. </li&gt; </ol></li><li> Für adhärente Zellen, absaugen Medien. In 20 ul 0,05% Trypsin-EDTA in jede Vertiefung mit einem Geschenk-Klon. <ol><li> Zellen in 200 ul Medium. Pipette zu mischen, um Zellen zu lösen. </li><li> Platte jeweils 100 ul in zwei separate 96-Well-Flachbodenplatten. Halten Sie eine Platte zu ermöglichen Klone wachsen und mit der anderen Platte, jeden Klon für Löschungen Bildschirm. </li><li> Fügen Sie weitere 100 ul in jede Vertiefung mit einem Gesamtvolumen von 200 ul. Warten Sie 24 bis 72 Stunden, damit Zellen zu wachsen. </li><li> Absaugen Medien. In 50 ul DNA-Extraktionslösung pro Well, resuspendieren und Transfer zum 96-Well-PCR-Platte. Fahren Sie mit Schritt 7.3. </li></ol></li><li> Entpacken Sie die gDNA von Klonen. Führen Probe in Thermocycler: 65 ° C für 6 min und 98 ° C für 2 min, um gDNA extrahieren. </li><li> Bildschirm jedes Klons unter Verwendung der gleichen PCR-Primern und den Bulk-Zellen optimierten Reaktionsbedingungen (siehe Schritt 6). </li><li> Wählen Sie das Klonen Identifiziert mit der gewünschten Löschung und Umzug in größere Platte oder Kolben für Wachstum. </li></ol> 8. Validierung von Biallelische Deletionsklonen <ol><li> Um erhaltenen Klone zu charakterisieren und zu validieren eine erfolgreiche Knockout bewerten Klone auf DNA- und RNA und / oder Protein-Ebene. <ol><li> Zur Beurteilung der DNA verstärken Deletion Bands biallelischen Deletionsklone mit einem Korrektur Polymerase und klonieren Amplicons (beispielsweise mit einer PCR-Klonierungskit) in einem Plasmidvektor. Verwandeln Sie das Plasmid in DH5 E. coli-Zellen und die Platte auf LB-Agar-Platten mit den entsprechenden Antibiotika. Wählen Sie mehrere Kolonien, Mini-Prep jeder, und unterziehen jeden Klon Sanger-Sequenzierung, um jeden Deletionsallel 28 charakterisieren - 30. Wiederholung der PCR-Test zum Löschen nach dem Einstiegsbild stellt sicher, dass der richtige Klon wurde ausgewählt und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. </li><li> Um die RNA zu bewerten, führen RT-qPCR für Gen-e Expression des betreffenden Gens 30,31. </li><li> Um das Protein zu bewerten, führen einen Immunoblot unter Verwendung eines Antikörpers gegen das relevante Protein 33. </li></ol></li></ol>

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We have no conflicts of interest related to this report.

Die CRISPR / Cas9 System kann verwendet werden, um genomische Deletionen von einer Vielzahl von Größen zu erzeugen. Obwohl wir beobachtet haben, dass die Frequenz des Löschens umgekehrt proportional bezüglich beabsichtigten Deletion Größe, haben wir in der Lage, Deletionen von bis zu 1 Mb und Deletionen von bis zu 100 kb zu gewinnen routine Ausbeute mehreren biallelischen gelöscht Klone. Wir haben keinen Verlust in der Effizienz des sequentiellen Einführen Deletionen in eine Zelllinie beobachtet. Diese Strategie kann für die Erstellung von kombi Deletion zahlreicher Gene und Elemente verwendet werden. Das Verfahren zur Erlangung biallelischen Deletionsklone kann durch Schätzen der minimalen Anzahl von Klonen benötigt, um basierend auf Deletion eine Größe, um die gewünschte Anzahl von Klonen mit biallelischen Deletion 12 erhalten gescreent werden beschleunigt werden. Die Fähigkeit, monoallelic Deletion mit der Abwesenheit von biallelischen Deletion an Wahrscheinlichkeitsverteilung zu erhalten könnte anzeigen Zell Letalität mit kompletten Funktionsverlust verbunden. Low frequency oder nicht vorhanden Löschungen könnte eine Reihe von Szenarien, einschließlich schlechte Transfektion ineffizient sgRNAs oder ineffiziente PCR-Screening-Primer (aufgrund des Fehlens von einer positiven Kontrolle, um PCR-Primer zu validieren, um zum Löschen-Bildschirm) zu reflektieren. GFP + -Zellen können als Ersatz für die Transfektionseffizienz (siehe Schritt 5.2), so dass eine Verringerung der GFP + -Zellen spiegelt wahrscheinlich schlecht Transfektion und einem daraus resultierenden verringerten Effizienz Löschung. Mit zwei verschiedenen sgRNA Paare mit unabhängigen Screening-Primer können Steuerung für ineffiziente sgRNA helfen und Screening-PCR-Primer und maximieren Chancen auf biallelischen Deletionsklonen. Zellsortierung für GFP + -Zellen bereichert zum Löschen Allele. Während dieser Schritt weggelassen werden kann, wird wahrscheinlich erforderlich machen Weglassen Screening weitere Klone zu denen mit monoallelic oder biallelischer Deletionen identifizieren. In dem Maße, Transfektionseffizienz optimiert werden kann, würden wir erwarten, Genom Bearbeitungseffizienz verbessert werden. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Die NHEJ Ereignisse, Löschungen und lokale Reparatur Ergebnis zugrunde liegen, in einer Reihe von Allelen mit einer Vielzahl von indels an den Zielorten. Die vorherrschende Ergebnis klein ~ 1 - 10 bp Insertionen oder häufiger Deletionen an der Stelle der sgRNA gerichtete Spaltung (2B). Oft werden diese Allele scheinen das Ergebnis von microhomology basierten Reparatur 34,35 sein. Es sollte beachtet werden, dass die PCR-basierten Nachweis Strategie, die wir beschreiben werden nicht größer und komplizierter Insertionen, Deletionen, Inversionen oder Umlagerungen identifizieren. Obwohl diese Ereignisse sind weniger verbreitet, haben wir Klone, bei denen weder das Löschen noch nicht gelöscht Amplikons nachgewiesen werden konnte beobachtet werden, und bei einer weiteren Untersuchung auch auf diese komplexeren Ergebnissen widerspiegeln. Wir haben beobachtet, umfangreiche CRISPR / Cas9 vermittelte &quot;Narben&quot; nicht Deletionsallelen aus monoallelic und nicht-Deletionsklone (siehe 2B). Diese &quot;Narben&quot; auskleine indels am sgRNA Spaltstelle ohne den beabsichtigten Deletion erzeugt (dh Deletion der intervenierenden Segment zwischen sgRNAs A und B). Diese Narben oft unterbrechen, Zielerfassung durch die sgRNA. Deshalb möchten wir Vorsicht bei Retargeting-Allele in Zellen, die zuvor auf sgRNAs mit den gleichen sgRNAs ausgesetzt zu drängen. Ein erfolgreicher Re-Targeting Strategie wäre einzigartig sgRNA nutzen Sequenzen unterscheidet sich von zuvor &quot;Narben&quot; Erkennungsstellen. In Fällen, wenn ein Paar von sgRNAs erkennt Exon-Sequenzen (1B, unten), kann Aster Allelen selbst bei Abwesenheit des Löschens erzeugt werden. Daher kann monoallelic Deletionsklone zum Verlust der Funktion aufgrund der hohen Frequenz von Frameshift-Mutationen auf dem Allel 12 nicht gelöschten angereichert werden. Ein Problem bei der CRISPR / Cas9 System Off-Target-Effekte, also Genomveränderung bei unbeabsichtigter Websites 36-38. Reuere Berichte haben vorgeschlagen, dass kürzere Führung RNAs mit 17-19 Nukleotiden können die Häufigkeit der CRISPR reduzieren / Cas9-basierte Nebeneffekte 39. Zusätzlich kann eine Doppelstrangbruchstrategie mit zwei Führungen pro Zielort mit einem Nickase verwendet werden, um DSBs erstellen und minimiert Nebeneffekte 7. Alternativ analog zu Strategien für RNAi verwendet, empfehlen wir, dass verschiedene Paare von sgRNAs mit nicht überlappenden protospacer Sequenzen verwendet, um zu zeigen, dass der beobachtete Phänotyp ist das Ergebnis der Vor-Ziel CRISPR / Cas9 Änderung im Gegensatz zu einem potenziellen Off-Target werden Wirkung. Eine praktische Vorgehensweise würde sein, wenigstens zwei benachbarte, aber nicht überlappende sgRNA Paare zu entwerfen, so dass ein einzelner Satz von Screening-Primer (siehe Schritt 2) können für mehrere sgRNA Paaren (1A) verwendet werden. Darüber hinaus ergänzt eine Deletion Zelllinie durch Wiedereinführung der fehlende Sequenz und / oder gestört Gen kann einen kausalen Zusammenhang zwischen untermauerneine bestimmte genomische Deletion und Phänotyp. Für Biologen arbeiten mit zellulären Modellsystemen hat RNAi ein leistungsfähiges Werkzeug für die funktionale Genomforschung vertreten. 42 - haben jedoch Grenzen dieses Ansatzes unvollständige Reduktion der Ziel-mRNA-Transkript-Gehalte, Heterogenität der Effekt der unabhängigen Reagenzien zur Förderung der gleichen Gen, und bekannte Nebeneffekte einschließlich Saatgut-basierte und nicht-Sameneffekte 40 enthalten. Genome Bearbeitungsstrategien versprechen, viele dieser Probleme anzugehen und stellen eine spannende, komplementären Ansatz für zukünftige genetische Störung 8,36,37. Weiterhin ermöglicht die Untersuchung von nicht-codierenden genetischen Elementen in einer Weise durch RNAi nicht möglich und herausfordernde durch herkömmliche Targeting nähert 25 Genom Bearbeitung. Wir ermutigen Generation von genomischen Deletionen von CRISPR / Cas9 als robuste und spezifische Methode zur Herstellung und Charakterisierung loss-of-function-Allele.

Recent advances in genome engineering technology have allowed for unprecedented opportunities for site-specific modification of the genome. This technology may be utilized to investigate the function of genes and regulatory elements via prospective genetic perturbation. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription-activator like (TAL) effector nucleases (TALENs), and CRISPR/Cas9 RNA-guided nucleases each leverage customizable DNA specificity to localize a nuclease for the introduction of DSBs1&#8211;3. The resulting DSBs can be repaired by indel-forming NHEJ or by homology-directed repair (HDR) using a donor template4.
The CRISPR/Cas9 nuclease pathway, an adaptive immune system in prokaryotic cells5, has been recently adapted for mammalian genome engineering2,3. This tool has been demonstrated to be an inexpensive, efficient, and reliable genome engineering technique6. Briefly, a complex of Streptococcus pyogenes-derived Cas9 nuclease and a sgRNA achieve target recognition via Watson-Crick base-pairing with cognate genomic DNA sequences. sgRNAs include 20-mer sequences complementary to genomic sequences adjacent to an obligate protospacer adjacent motif (PAM) NGG. Cas9 induces a DSB at a predictable position within the target site. Additionally, variants of Cas9 with single-strand cleavage capacity or catalytic inactivity may be used to facilitate &#8220;nicking&#8221; or transcriptional regulation respectively7&#8211;9. CRISPR/Cas9 has been used for a wide range of applications including both knock-in and knockout10,11, large-scale genomic deletions12&#8211;14, pooled library screening for gene discovery15,16, genetic engineering of numerous model organisms10,11,17&#8211;21, as well as gene therapy22,23.
Here we describe a protocol for efficient deletion of desired genomic regions. The protocol includes CRISPR design, cloning, and delivery, as well as deletion, identification, and characterization. Genomic deletions can be generated by the introduction of two CRISPR sgRNAs with Cas9 to induce repair of the resultant two DSBs by NHEJ with deletion of the intervening segment. This strategy has been used to create deletions ranging from one kilobase to over one megabase12. Deletions can be informative for the study of genes and other genetic elements, either in isolation or in combination. There are several potential advantages of genomic deletions as compared to HDR or single-site small indel production. First, this method capitalizes on the high efficiency of NHEJ in many cellular contexts7. The high frequency of deletion limits the number of clones needed to be screened to identify informative clones. Deletion frequency is inversely related to deletion size. Biallelic deletion clones may be retrieved at frequencies at least as great as of probabilistic expectation12. Second, both monoallelic and biallelic deletions may be easily identified and distinguished by conventional PCR, simplifying the screening process. Strategies relying on small indels or point mutations may require RFLP, allele-specific PCR, T7EN1 cleavage assay, Sanger sequencing, RT-qPCR, or immunoblotting, which may be more laborious. Third, by removing a substantial portion of a gene or element of interest, a reliable loss-of-function allele may be obtained. In contrast, frameshift mutations in protein-coding sequences may not always induce nonsense-mediated decay, may produce a hypomorphic or neomorphic allele, or target an exon excluded from an alternate isoform24. Finally, deletions may be particularly revealing for the study of non-coding DNA such as regulatory elements since frameshift mutations as produced by single-site indels would not be relevant25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="842">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:388px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:168px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA Ligase (with associated ligation buffer)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA, Molecular Biology Grade</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BbsI Restriction Enzyme (with associated NEB Buffer 2.1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pSpCas9(BB) (pX330)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>42230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S.O.C. Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15544-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BTX ECM 830</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BTX Solution and 2mm Cuvettes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pmaxGFP Plasmid</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPA-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuickExtract DNA Extraction Solution</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HotStarTaq PCR Master Mix Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>203443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zero Blunt PCR Cloning Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K2700-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of genomic deletions in mammalian cell lines via crispr/cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

Das Ziel dieses Experiments war die Deletion Pim1 in MEL-Zellen. Die Verwendung von mehreren nicht überlappenden sgRNA Paare (dh unabhängig protospacer Sequenzen) können dazu beitragen, für die Off-Target-Effekte (Abbildung 1A) steuern. Eine konsequente Phänotyp würde eher von einer On-Target-Effekt im Gegensatz zu einer gemeinsamen Off-Target-Effekt, der durch mehrere unabhängige protospacer Sequenzen gemeinsam führen. Jedes Paar würde die Produktion eines einzigartigen Löschen Haltepunkt zu führen. Wenn nahe beieinander (das heißt, n weniger als ~ 150 bp) konnten die gleichen Screening-Primer verwendet, um Deletionen von jedem Satz von sgRNAs erzeugten detektieren. Genomische Deletionen können Gene durch Verwendung sgRNA Paare in verschiedenen Positionen bezüglich des Gens (1B) zu stören. Zum Beispiel kann die sgRNA Paar ein Gen für das Löschen des gesamten Gens Körper flankieren; das Paar konnte innerhalb von zwei Exons befinden, mit dem Potential, Aster indels schaffen, selbst wenn eine oder beide alleles wurden nicht gelöscht; oder das Paar kann eine spezifische Exon flankieren, um eine Unterbrechung eines bestimmten Isoform ermöglichen. Der Löschstrategie Pim1 eingesetzt war die Entwicklung flankierenden sgRNAs um das gesamte Gen Körper ein 8 kb-Deletion (Abbildung 2) zu löschen. Diese Strategie wurde in teilweise aufgrund der relativ kleinen Größe des Pim1 Gens ausgewählt. Dieses Beispiel zeigt eine PAM (grün) auf der Oberseite (Watson) Strang und einem PAM auf der Unterseite (Crick) Strang; jedoch DSB unabhängig von PAM Sequenz Lokalisation an den oberen oder unteren Strang. sgRNA Paare können beide PAM-Sequenzen auf dem Obertrum auf dem Untertrum besitzen, beide oder eine von jedem. Unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls wurden zwei sgRNA ausgelegt, in die pX330 Expressionsvektor kloniert, und MEL-Zellen durch Elektroporation zusammen mit einem GFP-Reporter (2A) geliefert. Die Top 3% der GFP + Zellen wurden zwei Tage, sortiert nach der Elektroporation und klonal bei Grenzverdünnung plattiert. Bildschirming Primer wurden konstruiert, wie in Schritt 2 beschrieben und wie in Fig. 2 gezeigt PCR-Bedingungen wurden unter Verwendung von gDNA Eltern MEL-Zellen und von &quot;Bulk&quot; sortierten Zellen isoliert optimiert. 10 Tage nach dem Plattieren wurde gDNA aus allen Klonen isoliert und zur Deletion mittels PCR, die nicht-Deletion, monoallelic und biallelischen Deletionsklone entsprechend den Mustern von nicht-Deletion (ND) und Löschen (D) Amplicons identifiziert gescreent (Figur 3) . Nicht Deletionsklone wurden als mit der Anwesenheit des nicht-Deletion Amplikon und die Abwesenheit der Deletion Amplikon identifiziert. Monoallelic Klone wurden als mit der Anwesenheit von sowohl dem nicht-Deletion und Löschung Amplikons identifiziert. Biallelischen Klone wurden als mit der Abwesenheit des nicht Deletion Amplikon und die Anwesenheit der Deletion Amplikon identifiziert. Aus diesem Löschvorgang wurden 400 Klone gescreent, die 126 monoallelic Deletionsklonen und 32 biallelischen delet identifiziert<html> Ionen-Klone (es ist wichtig zu beachten, dass das Löschen Frequenz variiert mit Lösch Größe 12). Biallelischen Deletionsklone wurden ausgewählt und bewegt werden, um mit 8 ml Medium Kolben. Nach Ablauf von 5 Tagen in Expansion, wurde jeder Klon durch PCR von gDNA erneut getestet, um zu bestätigen, biallelischen Deletion Deletion Amplicons wurden auf die Sanger-Sequenzierung unterzogen, um die genaue Deletion (2B) zu identifizieren. Heterogenität innerhalb der Lösch Amplikons spiegelt unvollkommen indel bild NHEJ Reparatur. Sequenzierung des nicht Deletionsallel in monoallelelic Deletionsklone deckt indels in der Mehrzahl der Fälle, die belegen, dass auch die nicht-deletierten Allele häufig durch CRISPR / Cas9 bearbeitet, die für Anwendungen geeignet sein können, wo sowohl monoallelic und biallelischen Deletionsklone erforderlichen . RNA wurde von biallelischen Deletionsklone isoliert und durch RT-qPCR analysiert, um den Verlust von Pim1 Expression zu bestätigen (Abbildung 4). Wegen &quot;&gt; <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52118/52118fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der möglichen Streichung Strategien. (A) Zwei Beispiel sgRNA Paare für genomische Deletionen (in schwarz und orange dargestellt, beziehungsweise). Die blauen Pfeile zeigen Primer, die nicht-Deletion Amplikon zu detektieren und roten Pfeile zeigen Primer, um die Löschung Amplikon zu detektieren. sgRNA Positionen 17 und 18 sind in rot und blau markiert auf sgRNA-Seiten-A 1 / A 2 und sind in lila und orange auf sgRNA-Seiten-B 1 / B 2 mit einer roten Linie, die die vorhergesagte Cas9 Spaltung zwischen den Positionen 17 markiert und 18 (B) CRISPR gerichteter Spaltungen als vertikale schwarze Linien dargestellt. Die blauen Pfeile zeigen Primer, um die Nicht-Lösch Amplikon erkennen und roten Pfeile zeigen Primer, um das Löschen Amplikon zu erkennen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52118/52118fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier zur Ansicht</a>eine größere Version dieser Figur. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52118/52118fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. Strategie zu produzieren und zu erkennen Löschung von Pim1 einschließlich Sequenzierung Löschung und Nicht Deletionsallelen. (A) Schematische Darstellung des PCR-basierte Screening-Strategie, um Pim1 Deletionsklonen identifizieren. Ein Primerpaar wird an den internen Deletion (blaue Pfeile) und einem Primerpaar befindet sich außerhalb der Deletion (rote Pfeile) lokalisiert. sgRNA Sequenzen (protospacer Sequenzen) in lila dargestellt. Die vertikalen roten Linien zeigen die vorhergesagte Cas9 Spaltung zwischen den Positionen 17 und 18 der sgRNA Sequenz. (B) Sanger Sequenzierung zeigt indel Bildung an der sgRNA-Erkennungsstelle. sgRNA Sequenzen sind in lila und PAM-Sequenzen in grün dargestellt. Löschereignisse sind shSelbst, indem eine äquivalente Anzahl von dash Marken und Insertionen sind blau markiert. Vertikale rote Linien weisen auf vorausgesagt Spaltstelle zwischen den Positionen 17 und 18 des sgRNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52118/52118fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52118/52118fig3highres.jpg" /> Abbildung 3. Vertreter Gel Identifizierung nicht-Löschung, monoallelic und biallelischen Klone. Für jeden Klon, die linke Spur stellt die Nicht-Lösch Amplikon (&quot;ND&quot; in blau) und die rechte Spur stellt das Löschen Amplikon (&quot;D&quot; in rot ). Einzelne Klone werden durch gestrichelte Linien getrennt. Die drei monoallelic Deletionsklone Klone 5, 6 und 2. Die drei biallelischen Deletionsklone Klone 15, 17 und 13. Wie in den Folgedaten gesehen, das Löschband für c<html> lone 13 hat eine kleinere Größe durch größere Deletionen am Deletionsverknüpfung. <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52118/52118fig4highres.jpg" /> Abbildung 4. Der Verlust der Pim1 Ausdruck in biallelischen Deletionsklonen. Pim1 Expression wurde für zwei biallelischen Deletionsklonen durch RT-qPCR berechnet. ACt Verfahren - Daten wurde mit der 2 bis GAPDH normalisiert. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Protospacer Sequence </td></tr><tr><td> sgRNA-A </td><td> 5&#39;-TAGGAAAATGACTCGTCACT-3 &#39; </td></tr><tr><td> sgRNA-B </td><td> 5&#39;-GTCTATCCTATCTCGATAAA-3 &#39; </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: 20-mer protospacer Sequenzen für zwei sgRNA für die Löschung der Pim1. 543 &quot;&gt; <tbody><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;width:101px;"></td><td style="width:443px;"> Reverse Komplement Protospacer Sequence </td></tr><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;"> sgRNA-A-rc </td><td> 5&#39;-AGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 &#39; </td></tr><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;"> sgRNA-B-rc </td><td> 5&#39;-TTTATCGAGATAGGATAGAC-3 &#39; </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. reverse Komplement der protospacer Sequenzen für die beiden sgRNA aus Tabelle 1. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Sequenzen </td></tr><tr><td> sgRNA-A </td><td> 5&#39;-CACCTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 &#39; </td></tr><tr><td> sgRNA-A-rc </td><td> 5&#39;-AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 &#39; </td></tr><tr><td> sgRNA-B </td><td> 5&#39;-CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 &#39; </td></tr><tr><td> sgRNA-B-rc </td><td> 5&#39;-AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 &#39; </td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Protospacer Sequenzen und ihre Rückwärts ergänzt mit &quot;CACC&quot; und &quot;AAAC&quot; hinzugefügt zur Klonierung in den Vektor unter Verwendung von pX330 BbsI Restriktionsenzym. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Sequenzen </td></tr><tr><td> sgRNA-A </td><td> 5&#39;- CACCGTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 &#39; </td></tr><tr><td> sgRNA-A-rc </td><td> 5&#39;- AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTAC-3 &#39; </td></tr><tr><td> sgRNA-B </td><td> 5&#39;- CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 &#39; </td></tr><tr><td> sgRNA-B-rc </td><td> 5&#39;- AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 &#39; </td></tr></tbody></table> Tabelle 4. sgRNA Expression vom U6-Promotor des pX330 Vektor wird durch Zugabe eines G-Nucleotid nach CACC-Sequenz und bevor das verstärkte20-mer. Die Zugabe eines zusätzlichen Nukleotids G erfordert die Zugabe eines C Nukleotid am 3&#39;-Ende des reversen Komplement Oligo (zB sgRNA-A). Allerdings, wenn die erste Stellung des 20-mer (protospacer Sequenz) ist bereits ein G-Nucleotid, besteht keine Notwendigkeit, eine andere G hinzuzufügen (zB sgRNA-B) und keine Notwendigkeit, C in die Endposition der reversen Komplement fügen Oligo.

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Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

Generierung von Genomic Löschungen in Säugerzelllinien über CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

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