We thank Dr. Gaudenz Danuser and members of his lab for creating the plusTipTracker software and for helpful discussion regarding using the software, in particular Maria Bagonis and Sebastien Besson. We especially thank the Boston College Media Center for their assistance and support in the creation and editing of the video. We also thank members of the Lowery Lab for useful discussions and constructive criticism, and Abigail Antoine for proof-reading the manuscript. This work was funded by an NIH R00 MH095768 award to LAL.

הפרוטוקול והסרטון הזה נועדו לשמש כבן לוויה למאמר המקורי המתאר את חבילת התוכנה בפירוט רב יותר 4, כמו גם את הדוח הטכני שמגיע עם תוכנות להורדה באתר האינטרנט של המעבדה Danuser. קוראים מוזמנים לעיין במסמכים אלה בזהירות אם יש שאלות נוספות בנוגע לשימוש בתוכנה. .1 לפני ניתוח תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיר כל סרט הזמן לשגות לתוך רצף של TIFF (פורמט קובץ תמונה שתייגת) קבצי תמונה. אם יש קונוסים צמיחה מרובים / תאים בסרט נתון, יבול ראשון כל חרוט צמיחה / תא כדי ליצור תמונה ברצף משלה. הערה: זה אינו הכרחי, כפי שניתן לבחור אזורים של ריבית בודדים (ROI) בתוך plusTipTracker. עם זאת, שימוש בממדי תמונה קטנים יותר מגדיל את המהירות של העיבוד חישוביים, כך שלב זה מומלץ אם יש שטח ריק משמעותי בתמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציל את כל סדרת TIFF משלותיקייה בשם &quot;תמונות&quot; בתוך נתיב שMATLAB מוגדר גישה (שים לב כי &quot;תמונות&quot; היא תלויות רישיות). כדי להוסיף לדרך חדשה, לנווט לספריית קבצים הרלוונטית בחלון &quot;התיקייה הנוכחית&quot;, לחץ לחיצה ימנית, על סמל הספרייה, ובחר באפשרות &quot;הוסף לנתיב - תיקיות נבחרות ותת תיקיות&quot;. חשובה שתיקיית תוכנת plusTipTracker תתווסף לנתיב, כמו גם. </li></ol> .2 PlusTipGetTracks הערה: הצעד הראשון בניתוח תמונה היא לזהות את כוכבי שביט EB1-GFP, לקשר שביטים למסלולים, ולקבוע את הפרמטרים של דינמיקת microtubule. זה שהושג עם &quot;plusTipGetTracks&quot; הפקודה 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל ניתוח, יישום MATLAB פתוח והקלד &quot;plusTipGetTracks&quot; לתוך החלון הפקודה. זה יגרום תיבת הדו שיח חדשה להופיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;הגדרת פרויקטים חדשים&quot; ובחר באחת (או מורה) של סדרת תמונת TIFF הקודמת על ידי בחירה &quot;תמונות&quot; המתאימות תיקייה (או ספריות המכילות &quot;דימויים&quot; תיקיות). עם השלמת שלב זה, ספריית קבצים (roi_1) ייווצר (באותה התיקייה שמכילה &quot;תמונות&quot;) שיכילו את קבצי נתונים העתידיים. הערה: ניתן להשלים את הצעד &quot;פרויקטים חדשים שהוקם&quot; לפני הזמן, במהלך נפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלון חדש יופיע: &quot;בחר מצולע, לחץ לחיצה ימנית על הנקודה האחרונה, ולחץ על &#39;צור מסכה&#39;&quot;. לחץ על &quot;אישור&quot;. התמונה הראשונה בסדרת התמונה שנבחרה לאחר מכן ניתן תהיה מוצג. השתמש בעכבר כדי ללחוץ וליצור מצולע המקיף את מכלול חרוט הצמיחה. לחץ לחיצה כפולה על העכבר כדי לסגור את המצולע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהמצולע סגור, תיבת הדו שיח תופיע: &quot;האם אתה רוצה לבחור את ההחזר על ההשקעה אחרת?&quot; אם התמונה יש חרוט צמיחה אחר לנתח, בחר &quot;כן&quot;; אחרת זההנבחר &quot;לא&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הפרויקטים שינותחו באופן מיידי. לחץ על &quot;בחרו פרויקטים&quot; ובחר את התיקייה (roi_X) כדי לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך listSelectGUI יופיע. בחר את הפרויקט (ים) מהצד השמאלי של המסך ולהעביר אותן לצד ימין של המסך. לחץ על &quot;אישור&quot;. בחר מיקום לשמירת רשימת הפרויקט ולחץ על &quot;שמור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;איתור&quot;, &quot;מעקב&quot;, ו &quot;לאחר עיבוד&quot;. ברגע שבחירות אלה נעשו, בצד ימין של תיבת הדו שיח יהפוך להגדרה. קביעת תצורה של כל אופציה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרמטרים אלה משמשים כדי לקשר שביטים זוהו במסלולי MT. פרטים עבור בחירת הפרמטרים שליטה אלה למעקב כלולים בדפי 9-10 של טכני דווח PDF המלווה את הורדת חבילת תוכנה; לקרוא דוח זה בזהירות אם בעיות הם נתקלו. לצורך מעקב אחר השביטים EB1-GFP בXenopשלנו laevis קונוסים צמיחה, להשתמש בהגדרות המעקב הבאות: חפש טווח רדיוס (פיקסלים) 5-12, אורך תת מסלול מינימאלי (מסגרות) 3; אורך מקסימאלי גאפ (מסגרות) 8; מקס כיווץ פקטור 0.8, זווית מקס קדימה 50, זווית מקס אחורה 10, תנודות רדיוס 2.5. הגדרות אלה שמוצגים באיור 1. </li></ol> הערה: מקס כיווץ פקטור מוגדר לצמצם את מספר &quot;הפערים לאחור&quot; מזוהים, כמו &quot;פערים אחורה&quot; אינם מועילים לניתוח בהקשר של קונוסים צמיחה, בהתחשב בתנאים הצפופים וצפויות השגיאות בקשרי מסלול. בנוסף, שניהם זווית מקס קדימה, כמו גם שינויי הרדיוס מוגדר גבוהה יחסית, כMTs חרוט צמיחת תערוכת טרנסלוקציות תכופה קטנה בנוסף לגידולים וshrinkages, וחיזוק הגדרות שליטה אמורה, מאפשר תנועה מוגברת במהלך שלב ההצמדה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את פוסט עיבוד הגדרות בהתאם להגדרות רכישת תמונה הספציפיות הרצויות. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שההגדרות הוגדרו, לחץ על &quot;התחל&quot;. התוכנה תפעל לפי הגדרות שנבחרו. פעולה זו עשויה להימשך דקות עד שעות, תלוי במספר פרויקטים שנבחרו והגדלים שלהם. Command Window מציג הזמן המשוער שנותר לכל פונקציה. כאשר צעד plusTipGetTracks הושלם, החלון הפקודה יציג את &quot;סיים!&quot; הערה: רשימה של פרמטרים ספציפיים של דינמיקת MT יש עכשיו כבר מחושבים על ידי תוכנה זו ארוכה (ראה 4 קוד לפרטים נוספים), אבל לניתוח של דינמיקת MT בקונוסים צמיחה, הפרמטרים השימושיים ביותר לבחינה הן מהירות מסלול של צמיחת MT (במיקרון / דקה), חיים במסלול צמיחה (בשניות), ואורך מסלול של צמיחה (במיקרון). </li></ol> .3 PlusTipSeeTracks הערה: כעת, לאחר שמסלולי microtubule הוגדרו, &quot;plustipSeeTracks&quot; הפונקציה משמש להדמיה מסלול 4. פונקציה זויכול לספק במספר יציאות להדמיה, כוללים מפות דינמיקת MT במרחב ובסרטים במהירות, אבל כאן, הדגש הוא אך ורק על שימוש ב&quot; סרטי מסלול &quot;כדי להציג מסלולי MT על גבי התמונות חרוטים צמיחה. בעוד plusTipGetTracks יכול לנתח סרטים מרובים בו זמנית, plusTipSeeTracks יכול רק לנתח סרט אחד בכל פעם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלד &quot;plusTipSeeTracks&quot; לתוך החלון הפקודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר טעינת תיבת הדו שיח, לחץ על &quot;בחר פרויקט&quot;. בחר את ספריית האב המכילה את הפרויקט לדמיין ולחץ על &quot;בחר תיקייה&quot;. חלון חדש יופיע: &quot;בחר בפרויקט שאתה רוצה לדמיין&quot;. בחר את הקובץ לדמיין ולחץ על &quot;אישור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לחץ על &quot;בחר שמורים את ההחזר על ההשקעה&quot;. נווט לאותה התיקייה roi_X כאחד שנבחר בשלב הקודם ובחר את הקובץ בשם &quot;roiYX&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;בחר ספריית פלט&quot; לייעד wכאן MATLAB יחסוך קבצי ההדמיה המסלול. שים לב: אנו ממליצים על שימוש באותה התיקייה שמכילה את שאר הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;הפוך מסלול סרט&quot; ומסך יופיע בו מוצגות כל plusTipGetTracks המסלולים מחושב משביטי עצה +. פעולה זו תשמור את סדרת זמן במעקב בפורמט סרט, בקובץ &quot;allTracks_X_X_X&quot;. יש אפשרות לשמירת הסרט כAVI, אחרת פורמט ברירת המחדל הוא כקובץ Quicktime.mov. </li></ol> .4 PlusTipGroupAnalysis הערה: הפונקציה אחרונה זו משמשת ליצירת קבוצות של סרטים לניתוח והשוואה של הפרמטרים מסלול MT שלהם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלד &quot;plusTipGroupAnalysis&quot; לתוך החלון הפקודה. כדי לבחור באופן ידני את הקבוצות להשוואה, הראשון דה בחר &quot;קבוצה אוטומטית מהיררכיה&quot;. לאחר מכן, לחץ על &quot;פרויקטים בחרו&quot;. נווט אל ספריות אב המכילות את כל תיקיות roi_Xכדי לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך listSelectGUI יופיע. בחר את כל הפרויקטים שייכללו בקבוצות מהצד השמאלי של המסך ולהעביר אותן לצד ימין של המסך. לחץ על &quot;אישור&quot;. בחר מיקום לשמירת רשימת הפרויקט ולחץ על &quot;שמור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יופיע חלון: &quot;אנא בחר קבוצה ראשונה מהרשימה&quot;. לחץ על &quot;אישור&quot;. חלון listSelectGUI יציג שוב. הפעם, בחרו רק את קבצים שמתאימים לקבוצה הראשונה שצריך להיות ויקווה יחד. לחץ על &quot;אישור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, הזן את שם הקבוצה, ולחץ על &quot;אישור&quot;. יופיע חלון: &quot;בחר בקבוצה אחרת?&quot; תשובה בהתאם, ולהמשיך בחירת קבוצות. יופיע חלון: &quot;בחר מיקום לשמירת רשימת הקבוצות שלך&quot;. נווט אל המיקום ולחץ על &quot;שמור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;מדריך פלט בחר&quot; לבחור בי תיקיות הפלט תהיהמאוחסן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר איזה סוג של ניתוח קבוצה לנהל - אם מסלולי MT יש ייקוו לכל קבוצה או לניתוח תא צריכה להתבצע. המבחנים הסטטיסטיים המומלצים כבר מיועדים. כדי לכלול את כל המסלולים בניתוח, בטל את הבחירה &quot;הסר מסלולים בתחילת / סיום של סרט&quot;. אחרת, יש תיבה זו נבחרה מסיר את כל מסלולי צמיחת MT שנמצאים בתהליך כסרט מתחיל או מסתיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בחירת ניתוח הקבוצה מורכבת, בחר &quot;השוואת קבוצות&quot;. </li></ol>

<ol>
	<li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+(end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein).">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule+plus+end+tracking+protein+Orbit/MAST/CLASP+acts+downstream+of+the+tyrosine+kinase+Abl+in+mediating+axon+guidance.">The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance.</a> Neuron. , 913-926 (2004).</li><li>Purro, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+regulates+axon+behavior+through+changes+in+microtubule+growth+directionality:+a+new+role+for+adenomatous+polyposis+coli.">Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).</li><li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=plusTipTracker:+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics.">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).</li><li>Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Explant+Cultures+from+Xenopus+laevis.">Neural Explant Cultures from Xenopus laevis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232 (2012).</li><li>Long, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+analysis+of+CLASP-interacting+protein+functions+during+interphase+microtubule+dynamics.">Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics.</a> Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).</li><li>Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+ECM+mechanosensing+pathways+regulate+microtubule+dynamics+to+control+endothelial+cell+branching+morphogenesis.">Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis.</a> The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).</li><li>Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+screening+of+microtubule+growth+dynamics+identifies+MARK2+as+a+regulator+of+leading+edge+microtubules+downstream+of+Rac1+in+migrating+cells.">Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells.</a> PLoS One. 7, e41413 (2012).</li><li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+ends:+a+dynamic+protein+network+controls+the+fate+of+microtubule+tips.">Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).</li><li>Schuyler, S. C., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+'plus-end-tracking+proteins':+The+end+is+just+the+beginning.">Microtubule 'plus-end-tracking proteins': The end is just the beginning.</a> Cell. 105, 421-424 (2001).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312, 237-242 (1984).</li><li>Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+behavior+of+the+APC-binding+protein+EB1+on+the+distal+ends+of+microtubules.">The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules.</a> Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).</li><li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+tracking+by+CLIP-170+requires+EB1.">Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EB1+promotes+microtubule+dynamics+by+recruiting+Sentin+in+Drosophila+cells.">EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells.</a> The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).</li><li>Maurer, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EB1+accelerates+two+conformational+transitions+important+for+microtubule+maturation+and+dynamics.">EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics.</a> Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).</li><li>Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+between+XMAP215+and+EB1+increases+microtubule+growth+rates+to+physiological+levels.">Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels.</a> Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).</li><li>Lowery, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone-specific+functions+of+XMAP215+in+restricting+microtubule+dynamics+and+promoting+axonal+outgrowth.">Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth.</a> Neural development. 8, 22 (2013).</li><li>Marx, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+cytoplasmic+linker-associated+protein+1+(XCLASP1)+promotes+axon+elongation+and+advance+of+pioneer+microtubules.">Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules.</a> Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

PlusTipTracker מספק ממשק משתמש פשוט, גרפי כדי לזהות במהירות ובאופן אוטומטי שביטים EB1-GFP כמעט כל גלויים בקונוס תא או צמיחה, לקשר שביטים למסלולים, ולחשב פרמטרים MT. פרסומים אחרים דיווחו העיצוב של סוגים דומים של תוכנה (לדוגמא, מרקס et al. ניתוח כמו גם מנוצל של דינמיקת EB1 מתויגת ב...

מטרתה של שיטה זו היא לקבל מידע כמוני אודות microtubule (MT) בתוספת-מעקב סוף החלבון (+ טיפ) דינמיקה בחיים קונוסים צמיחה. MT + טיפים מועילים בקבוצה של חלבונים הלמקם את התוספת-הקצוות של MTS 9,10. הם מבצעים מגוון רחב של פונקציות להסדיר פרמטרים של חוסר יציבות MT הדינמי 11, כוללים שיעורים של פילמור, קטסטרופה, והצלה. שיטה המשמשת היטב אחד לניתוח דינמיקת MT היא לעקוב אחר ההתנהגות של EB1 עצה +, אשר נקשר באופן ספציפי לMT גדל בתוספת-מסתיים 1,12. EB1 ידוע לגייס כמה חלבונים אחרים לMT גדל בתוספת-מסתיים 13,14, ולאחרונה כבר נקבע כגורם התבגרות MT 15, קידום שניהם צמיחת MT ותדירות אסון 15,16. מחקרים של דינמיקת MT בתוך קונוסים צמיחה רבים מנוצלים שיטות עבודת יד מעקב כדי למדוד שינויים בדינמיקת EB1-GFP לאורך הזמן 1-3, כlocalizati EB1לMT יכול לשמש תוספת מסתיימת כסמן לפילמור MT. יתרון עיקרי לבחינת שביטים EB1-GFP כמדד לצמיחת MT הוא שדינמיקת MT ניתן למדוד גם באזורים של החפיפה MT משמעותית. בעוד השיטה של שביטים EB1-GFP יד מעקב סיפקה תובנות שימושיות לMT התנהגויות 1-3, זה זמן רב ויכול להיות מוטה. בנוסף, כצמיחה חריגה התנהגויות קונוס עשויות התוצאה של משמרות דקות בדינמיקת cytoskeletal, ניתוח תת קבוצה קטנה בלבד של MTS (בדרך כלל נדרשות כאשר יד מעקב) עלול להחמיץ מידע משמעותי. לפיכך, אנו מודדים פרמטרים דינמיקת MT הגלובליים באמצעות חבילת התוכנה, 4 plusTipTracker, לאחר הרכישה של רזולוציה גבוהה, תמונות בשידור חיות של EB1 מתויג בקונוסים צמיחה עובריים בתרבית 5. תוכנה זו, שפותחה במעבדת Danuser, נעשתה שימוש במספר מחקרים המאפיינים את דינמיקת MT בסוגי תאים שונים 6-8. זה קוד פתוח,אה ידידותי, חבילה מבוססת MATLAB הכוללת זיהוי אוטומטי, מעקב, הדמיה, וניתוח לסרטים של + טיפים, שכותרתו fluorescently. רשימה של פרמטרים ספציפיים של דינמיקת MT מחושבים על ידי תוכנה זו ארוכה (ראה 4 קוד לפרטים נוספים), אבל לניתוח של דינמיקת MT בקונוסים צמיחה, הפרמטרים השימושיים ביותר הם מהירות מסלול של צמיחת MT (במיקרון / דקה), מסלול של צמיחה חיים (בשניות), ואורך מסלול של צמיחה (במיקרון). את התוכנה ניתן להוריד מאתר אינטרנט המעבדה Danuser ישירות (תחת &quot;תוכנה&quot;). בעוד המעבדה Danuser תומכת כעת ממשק חדש לניתוח מעקב עצה +, אשר שולב לתוך חבילת תוכנה בשם u-מסלול 2.0, התוכנה המקורית, עצמאית תישאר זמינה. האלגוריתמים הבסיסיים בין שתי התוכניות הם אותם (לפחות כמו של 2014), עם רק הבדל של תפוקות ממשק וניתוח. למשתמש המתחיל עם MATLAB הקטן ו / או התנסות אנליזה חישוביתence, יש plusTipTracker תכונות ידידותי למשתמש יותר, ובכלל זה תפוקות פרמטר סטטיסטיות אוטומטיות. כאן, אנו מתארים את השלבים לניתוח תמונות של דינמיקת EB1-GFP בקונוסים צמיחת laevis תרבותי צפרדעים. פרוטוקול זה נוצל בשנים האחרונה בעיתון בחינת דינמיקת MT 17. ראו גם אל אפלולי ואח. 2012 5 להוראות מפורטות לגבי קונוסים צמיחת culturing להביע EB1-GFP. בעוד מאמר זה התמקד בעיקר בבחינת דינמיקת EB1-GFP בקונוסים צמיחה, באותו הפרוטוקול יכול לשמש לסוגי תאים אחרים 17. לכל סוגי התאים, מרווח הזמן בין מסגרות צריך להיות בין 0.5-2 שניות למעקב עצה + אופטימלי. מרווח זמן של עד 4 שניות בין המסגרות אפשרי, אבל זה עלה תוצאות מרווח זמן בשגיאות מעקב נוספות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">plusTipTracker software</td>
			<td style="width:116px;">Danuser Lab</td>
			<td style="width:345px;"><a href="http://lccb.hms.harvard.edu/software.html">http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</a></td>
			<td style="width:172px;">This software may be hosted by another website in the future.&#160; If the listed site does not exist, search &#34;Danuser Lab Software&#34; on a web search engine to find the site.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Matlab software</td>
			<td style="width:116px;">Mathworks</td>
			<td><a href="http://www.mathworks.com/products/matlab/">http://www.mathworks.com/products/matlab/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using plustiptracker software to measure microtubule dynamics in xenopus laevis growth cones

Microtubule (MT) בתוספת-מעקב-end חלבונים (+ טיפים) בתרגום לתוספת-סיום הגדילה של MTS ולהסדיר דינמיקת MT 1,2. אחד הטיפים הידועים ביותר ושימוש נרחב + לניתוח דינמיקת MT הוא כריכה-End החלבון, EB1, הקושר את כל תוספת-קצות MT גדלו, ובכך, מהווה סמן לפילמור MT 1. מחקרים של EB1 התנהגות בתוך קונוסים צמיחה רבים השתמשו זמן רב ו, שיטות עבודת יד מעקב בעזרת מחשב מוטה לנתח פרט MTs 1-3. הגישה שלנו היא לכמת פרמטרים הגלובליים של דינמיקת MT שימוש בחבילת התוכנה, 4 plusTipTracker, בעקבות הרכישה של רזולוציה גבוהה, תמונות בשידור חיות של EB1 מתויג בקונוסים צמיחה עובריים בתרבית 5. תוכנה זו היא חבילה מבוססת MATLAB, קוד פתוח, ידידותי למשתמש, המשלבת איתור אוטומטי, מעקב, הדמיה, וניתוח לסרטים של + טיפים, שכותרתו fluorescently. כאן, אנו מציגים הפרוטוקול לשימוש plusTipTracker לניתוח השביטים עצה + fluorescently שכותרתו בקונוסים צמיחת laevis תרבותיים צפרדעים. עם זאת, תוכנה זו יכולה לשמש גם כדי לאפיין דינמיקת MT בסוגי תאים שונים 6-8.

שימוש בתוכנה זו, כמתואר כאן יספק כמה קבצי מידע שלכמת דינמיקת עצה + בתאים חיים. PlusTipGetTracks הפונקציה מזהה את הרצועות (באמצעות הגדרות דוגמא מוצגות באיור 1), ולאחר מכן מספק פרמטרים לגבי מסלולי עצה +. כדי להציג את המידע שהתוכנה קי?...

Watch this Scientific Journal Video about Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones at JoVE.com

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

המבוססת על MATLAB, חבילת תוכנות הקוד הפתוחה, plusTipTracker, ניתן להשתמש בו לסדרת תמונה של + טיפים, שכותרתו fluorescently לנתח לכמת דינמיקת microtubule.

באמצעות plusTipTracker תוכנה כדי למדוד microtubule Dynamics ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; קונוסים צמיחה

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

using-plustiptracker-software-to-measure-microtubule-dynamics-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

10.3K Views.  Boston College.  המבוססת על MATLAB, חבילת תוכנות הקוד הפתוחה, plusTipTracker, ניתן להשתמש בו לסדרת תמונה של + טיפים, שכותרתו fluorescently לנתח לכמת דינמיקת microtubule. 

Video: Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

פלסטיק הטבעת ואת חתך של עוברים Xenopus laevis

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information into directional movement towards the appropriate target cell. To fully understand how guidance information is transmitted from the cell surface to the underlying dynamic cytoskeletal networks, one needs a model system suitable for live cell imaging of protein dynamics at high temporal and spatial resolution. Typical vertebrate growth cones are too small to quantitatively analyze F-actin and microtubule dynamics. Neurons from the sea hare Aplysia californica are 5-10 times larger than vertebrate neurons, can easily be kept at room temperature and are very robust cells for micromanipulation and biophysical measurements. Their growth cones have very defined cytoplasmic regions and a well-described cytoskeletal system. The neuronal cell bodies can be microinjected with a variety of probes for studying growth cone motility and guidance. In the present protocol we demonstrate a procedure for dissection of the abdominal ganglion, culture of bag cell neurons and setting up an imaging chamber for live cell imaging of growth cones.

Aplysia californica neurons develop large growth cones in culture that are excellent for high-resolution imaging of growth cone motility and guidance. Here, we present a protocol for dissection and plating of Aplysia bag cell neurons as well as for setting up a chamber for live cell imaging.

תא תרבויות העצבית מ Aplysia עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של קונוסים צמיחה

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

קבלת ביצים Xenopus laevis נקבות

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

הכנה ההיפוך חלוקה של Xenopus laevis ביצה תמציות

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

רקמות קביעת שווי שימוש בבעלי חיים להשתלות (ACT) Assay ב Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

ייצור של<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; ביצה מחלץ לזהות RNAs microtubule הקשורים

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

השתלת פנים ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; עוברים

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.