We thank Dr. Gaudenz Danuser and members of his lab for creating the plusTipTracker software and for helpful discussion regarding using the software, in particular Maria Bagonis and Sebastien Besson. We especially thank the Boston College Media Center for their assistance and support in the creation and editing of the video. We also thank members of the Lowery Lab for useful discussions and constructive criticism, and Abigail Antoine for proof-reading the manuscript. This work was funded by an NIH R00 MH095768 award to LAL.

Ce protocole et vidéo sont destinés à servir de compagnon à l&#39;article original décrivant le logiciel plus en détail 4, ainsi que le rapport technique qui vient avec le téléchargement de logiciels sur le site Web Danuser Lab. Les lecteurs sont encouragés à examiner attentivement ces documents s&#39;il ya des questions supplémentaires concernant l&#39;utilisation du logiciel. 1 Avant l&#39;analyse d&#39;image <ol><li> Convertir chaque film en time-lapse en une séquence de TIFF (Tagged Image File Format) Les fichiers d&#39;image. S&#39;il ya plusieurs cônes de croissance / cellules dans un film donné, première récolte chaque cône de croissance / cellule pour créer sa propre séquence d&#39;image. Remarque: Ce n&#39;est pas nécessaire, à titre individuel régions-de-intérêt (ROI) peuvent être sélectionnés dans plusTipTracker. Cependant, l&#39;utilisation de plus petites dimensions de l&#39;image augmente la vitesse du traitement de calcul, de sorte que cette étape est recommandée si l&#39;espace blanc significatif dans l&#39;image. </li><li> Enregistrez chaque série TIFF dans son propredossier &quot;images&quot; dans un chemin que MATLAB est réglé sur l&#39;accès (à noter que &quot;images&quot; est sensible à la casse). Pour ajouter un nouveau chemin, accédez au répertoire du fichier concerné dans la fenêtre &quot;Current Folder&quot;, faites un clic droit sur l&#39;icône du répertoire, et sélectionnez &quot;Ajouter à Chemin - Dossiers sélectionnés et sous-dossiers&quot;. Il est important que le dossier du logiciel plusTipTracker être ajoutée à la voie, ainsi. </li></ol> 2. plusTipGetTracks Note: La première étape de l&#39;analyse d&#39;image est de détecter les comètes EB1-GFP, le lien entre les comètes en pistes, et de déterminer les paramètres de la dynamique des microtubules. Ceci est obtenu avec la commande &quot;plusTipGetTracks&quot; 4. <ol><li> Pour commencer l&#39;analyse, l&#39;application de MATLAB ouvert et tapez &quot;plusTipGetTracks&quot; dans la fenêtre de commande. Cela entraînera une nouvelle boîte de dialogue apparaît. </li><li> Cliquez sur &quot;créer de nouveaux projets&quot; et choisir un (ou more) de l&#39;image TIFF série précédente en sélectionnant les &quot;images&quot; appropriées dossier (ou répertoires contenant des &quot;images&quot; dossiers). À l&#39;issue de cette étape, un répertoire de fichiers (roi_1) sera créé (dans le même dossier qui contient des &quot;images&quot;) qui contiendra les futurs fichiers de données. Remarque: l&#39;étape &quot;Installer de nouveaux projets» peut être complété à l&#39;avance, au cours d&#39;une session distincte. </li><li> Une nouvelle fenêtre apparaît: &quot;Sélectionner un polygone, faites un clic droit sur ce dernier point, et cliquez sur« Créer un masque &quot;. Cliquez sur &quot;OK&quot;. La première image de la série d&#39;images sélectionnée sera alors affiché. Utilisez la souris pour cliquer et de créer un polygone qui englobe l&#39;ensemble du cône de croissance. Double-cliquez sur la souris pour fermer le polygone. </li><li> Une fois le polygone a été fermé, une boîte de dialogue apparaît: «Voulez-vous sélectionner un autre retour sur investissement?&quot; Si l&#39;image a un autre cône de croissance à analyser, sélectionnez «Oui»; s autrementélu «Non». </li><li> Sélectionnez les projets qui seront immédiatement analysés. Cliquez sur &quot;Sélectionner projets&quot; et sélectionnez le dossier (roi_X) à analyser. </li><li> Un écran de listSelectGUI apparaît. Sélectionnez le projet (s) sur le côté gauche de l&#39;écran et de les déplacer sur le côté droit de l&#39;écran. Cliquez sur &quot;OK&quot;. Choisissez un emplacement pour enregistrer la liste de projets et cliquez sur &quot;Enregistrer&quot;. </li><li> Sélectionnez &quot;détection&quot;, &quot;Suivi&quot;, et &quot;post-traitement&quot;. Une fois ces sélections ont été effectuées, le côté droit de la boîte de dialogue sera configurable. Configurez chaque option. <ol><li> Ces paramètres sont utilisés pour relier les comètes détectées en pistes de MT. Détails pour le choix de ces paramètres de contrôle pour le suivi sont inclus sur les pages 9-10 du rapport technique PDF qui accompagne le téléchargement du logiciel; lire attentivement ce rapport en cas de problèmes. Aux fins de suivi des comètes EB1-GFP dans Xenopnous laevis cônes de croissance, utilisez les paramètres de suivi suivantes: un rayon de recherche Range (pixels) 5-12, la longueur minimale Sous-Track (frames) 3; Max Gap Longueur (cadres) 8; Max Factor retrait de 0,8, angle maximum avant 50, angle arrière Max 10, Fluctuation Rayon 2,5. Ces paramètres sont représentés sur la figure 1. </li></ol> Remarque: Facteur de retrait maximum est fixé à réduire le nombre de «lacunes détectées en retard», comme des «lacunes en arrière&quot; ne sont pas utiles à analyser dans le cadre de cônes de croissance, compte tenu des conditions de surpeuplement et des erreurs probables dans les liens de la piste. En outre, les deux angle Max Forward, ainsi que la fluctuation rayon sont définis relativement élevé, comme MT cône de croissance présentent de petites translocations fréquentes dans plus de croissances et des retraits, et l&#39;augmentation de ces paramètres de contrôle permet à ce mouvement augmenté au cours de l&#39;étape de liaison. <ol><li> Remplissez les paramètres de post-traitement en fonction des paramètres d&#39;acquisition d&#39;image spécifiques souhaitées. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Une fois que les paramètres ont été configurés, cliquez sur &quot;Démarrer&quot;. Le logiciel fonctionne selon les paramètres ont été sélectionnés. Cela peut prendre quelques minutes à quelques heures, en fonction du nombre de projets sélectionnés et de leurs tailles. La fenêtre de commande affiche le temps restant estimé pour chaque fonction. Lorsque l&#39;étape de plusTipGetTracks est terminée, la fenêtre de commande affiche &quot;Terminé!&quot; Remarque: Une longue liste de paramètres spécifiques de la dynamique MT ont été calculés par ce logiciel (voir référence 4 pour plus de détails), mais pour l&#39;analyse de la dynamique MT dans les cônes de croissance, les paramètres les plus utiles à examiner sont MT vitesse de voie de la croissance (en microns / minute), la voie de la croissance de vie (en secondes), et la longueur de la piste de croissance (en microns). </li></ol> 3. plusTipSeeTracks Note: Maintenant que les pistes de microtubules ont été définis, la fonction &quot;plustipSeeTracks» est utilisé pour la piste visualisation 4. Cette fonctionpeuvent fournir des multiples sorties pour la visualisation, y compris la dynamique de MT spatiales des cartes et des films de vitesse, mais ici, l&#39;accent est mis uniquement sur l&#39;utilisation «Track Films&quot; pour afficher les pistes MT superposées sur les images de cône de croissance. Alors que plusTipGetTracks peuvent analyser plusieurs films à la fois, plusTipSeeTracks ne peuvent analyser un film à la fois. <ol><li> Tapez &quot;plusTipSeeTracks&quot; dans la fenêtre de commande. </li><li> Après le chargement de la boîte de dialogue, cliquez sur &quot;Select Project&quot;. Sélectionnez le répertoire parent contenant le projet de visualiser et cliquez sur &quot;Sélectionner un dossier&quot;. Une nouvelle fenêtre apparaît: &quot;Sélectionnez le projet que vous souhaitez visualiser&quot;. Choisissez le fichier à visualiser et cliquez sur &quot;OK&quot;. </li><li> Ensuite, cliquez sur &quot;Select Saved ROI&quot;. Naviguez dans le même dossier roi_X que celle sélectionnée à l&#39;étape précédente et sélectionnez le fichier nommé &quot;roiYX&quot;. </li><li> Cliquez sur &quot;Sélectionner le répertoire de sortie&quot; pour désigner wici MATLAB enregistrer les fichiers de visualisation de la piste. Note: Nous vous recommandons d&#39;utiliser le même dossier qui contient le reste des données. </li><li> Sélectionnez &quot;Faire piste Movie&quot; et un écran apparaît affichant toutes les pistes plusTipGetTracks calculées à partir des comètes TIP +. Cette étape permet d&#39;économiser la série de temps suivis dans un format film, dans le fichier &quot;allTracks_X_X_X&quot;. Il ya une option pour enregistrer le film au format AVI, sinon le format par défaut est le fichier Quicktime.mov. </li></ol> 4. plusTipGroupAnalysis Remarque: Cette fonction finale est utilisée pour créer des groupes de films pour l&#39;analyse et la comparaison de leurs paramètres de piste de MT. <ol><li> Tapez &quot;plusTipGroupAnalysis&quot; dans la fenêtre de commande. Pour sélectionner manuellement les groupes à comparer, d&#39;abord de-sélectionner &quot;groupe Auto de la hiérarchie&quot;. Ensuite, cliquez sur &quot;Sélectionner des projets&quot;. Accédez aux répertoires parents contenant tous les dossiers roi_Xà analyser. </li><li> Un écran de listSelectGUI apparaît. Sélectionnez tous les projets à inclure dans les groupes à partir du côté gauche de l&#39;écran et de les déplacer sur le côté droit de l&#39;écran. Cliquez sur &quot;OK&quot;. Choisissez un emplacement pour enregistrer la liste de projets et cliquez sur &quot;Enregistrer&quot;. </li><li> Une fenêtre s&#39;affiche: &quot;S&#39;il vous plaît sélectionner premier groupe de la liste&quot;. Cliquez sur &quot;OK&quot;. La fenêtre listSelectGUI s&#39;affiche à nouveau. Cette fois-ci, sélectionner uniquement les fichiers qui correspondent au premier groupe qui devrait être mis en commun. Cliquez sur &quot;OK&quot;. </li><li> Ensuite, entrez le nom du groupe, puis cliquez sur &quot;OK&quot;. Une fenêtre s&#39;affiche: &quot;Choisissez un autre groupe?&quot; Réponse en conséquence et continuer à sélectionner des groupes. Une fenêtre s&#39;affiche: &quot;Choisissez un emplacement pour enregistrer votre liste de groupe&quot;. Accédez à l&#39;emplacement et cliquez sur &quot;Enregistrer&quot;. </li><li> Cliquez sur &quot;Sélectionner le répertoire de sortie&quot; pour choisir l&#39;endroit où les dossiers de sortie serontstocké. </li><li> Sélectionnez le type de l&#39;analyse du groupe de mener - si les pistes de MT devraient être mises en commun pour chaque groupe ou par l&#39;analyse cellulaire doit être effectuée. Les tests statistiques recommandées sont déjà désignés. Pour inclure toutes les pistes dans l&#39;analyse, dé-sélectionnez «Supprimer les pistes au début / fin de film&quot;. Sinon, ayant cette case sélectionnée supprime toutes les pistes de croissance de MT qui sont en processus que le film commence ou se termine. </li><li> Après la sélection Groupe d&#39;analyse est faite, sélectionnez «Comparer les groupes&quot;. </li></ol>

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	<li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+(end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein).">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule+plus+end+tracking+protein+Orbit/MAST/CLASP+acts+downstream+of+the+tyrosine+kinase+Abl+in+mediating+axon+guidance.">The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance.</a> Neuron. , 913-926 (2004).</li><li>Purro, S. 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C., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+'plus-end-tracking+proteins':+The+end+is+just+the+beginning.">Microtubule 'plus-end-tracking proteins': The end is just the beginning.</a> Cell. 105, 421-424 (2001).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312, 237-242 (1984).</li><li>Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+behavior+of+the+APC-binding+protein+EB1+on+the+distal+ends+of+microtubules.">The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules.</a> Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).</li><li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+tracking+by+CLIP-170+requires+EB1.">Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EB1+promotes+microtubule+dynamics+by+recruiting+Sentin+in+Drosophila+cells.">EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells.</a> The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).</li><li>Maurer, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EB1+accelerates+two+conformational+transitions+important+for+microtubule+maturation+and+dynamics.">EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics.</a> Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).</li><li>Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+between+XMAP215+and+EB1+increases+microtubule+growth+rates+to+physiological+levels.">Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels.</a> Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).</li><li>Lowery, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone-specific+functions+of+XMAP215+in+restricting+microtubule+dynamics+and+promoting+axonal+outgrowth.">Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth.</a> Neural development. 8, 22 (2013).</li><li>Marx, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+cytoplasmic+linker-associated+protein+1+(XCLASP1)+promotes+axon+elongation+and+advance+of+pioneer+microtubules.">Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules.</a> Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

PlusTipTracker fournit une interface utilisateur simple, graphique pour détecter rapidement et automatiquement la quasi-totalité visibles comètes EB1-GFP dans un cône de croissance cellulaire ou, le lien entre les comètes en pistes, et calculer les paramètres MT. Autres publications ont rapporté la conception de types de logiciels similaires (par exemple, Marx et al. Analyse quantitative a également utilisé des dynamiques EB1 marqués dans les cônes de croissance 18). Mais, ce logiciel semb...

Le but de cette méthode est d&#39;obtenir des informations quantitatives sur les microtubules (MT) plus fin de suivi dynamique dans la vie des cônes de croissance protéines (+ TIP). MT + TIP sont un groupe de protéines qui localisent les plus-extrémités de MT 9,10. Ils effectuent une vaste gamme de fonctions pour régler les paramètres de MT instabilité dynamique 11, y compris les taux de polymérisation, catastrophe, et de sauvetage. Une méthode très utilisée pour l&#39;analyse de la dynamique de la MT est de suivre le comportement du TIP EB1 +, qui se lie spécifiquement à la croissance de MT plus-ends 1,12. EB1 est connu pour recruter plusieurs autres protéines à la croissance de MT plus-ends 13,14, et a récemment été mis en place comme un facteur de maturation MT 15, la promotion de la croissance MT et la fréquence des catastrophes 15,16. De nombreuses études de la dynamique MT dans les cônes de croissance ont utilisé des méthodes de suivi de la main pour mesurer les changements dans la dynamique EB1-GFP au fil du temps 1-3, comme EB1 localizatià MT ainsi que les fins peuvent être utilisés en tant que marqueur pour la polymérisation MT. Un avantage clé de l&#39;examen de comètes EB1-GFP comme une approximation de la croissance MT est que la dynamique MT peuvent être mesurés même dans les régions de chevauchement significatif de MT. Bien que la méthode des comètes EB1-GFP suivi à la main a fourni des indications utiles sur les comportements MT 1-3, il est temps et peut être biaisée. En outre, la croissance aberrante comportements coniques sont probablement le résultat de changements minute à la dynamique du cytosquelette, en analysant seulement un petit sous-ensemble de MT (généralement nécessaire lorsque la main-tracking) peut manquer des informations importantes. Ainsi, nous mesurons la dynamique de MT mondiaux paramètres à l&#39;aide du logiciel, plusTipTracker 4, après l&#39;acquisition de haute résolution, les images en direct de EB1 marqué dans les cônes de croissance embryonnaires cultivées 5. Ce logiciel, développé dans le Danuser Lab, a été utilisé dans plusieurs études qui caractérisent la dynamique MT dans divers types de cellules 6-8. Il s&#39;agit d&#39;un open-source, nouser-amical, emballage à base de MATLAB qui inclut la détection automatique, le suivi, la visualisation et l&#39;analyse des films de + TIP marquées par fluorescence. Une longue liste de paramètres spécifiques de la dynamique MT sont calculées par ce logiciel (voir référence 4 pour plus de détails), mais pour l&#39;analyse de la dynamique MT dans les cônes de croissance, les paramètres les plus utiles sont MT vitesse de voie de la croissance (en microns / minute), chemin de la croissance durée de vie (en secondes), et la longueur de la piste de croissance (en microns). Le logiciel peut être téléchargé directement depuis le site Danuser Lab (sous «Logiciel»). Alors que le Danuser Lab prend actuellement en charge une interface nouvelle pour + analyse de suivi de TIP, qui est intégré dans un logiciel appelé u-piste 2.0, le logiciel d&#39;origine, autonome restera disponible. Les algorithmes sous-jacents entre les deux programmes sont les mêmes (au moins à partir de 2014), avec seulement une différence de l&#39;interface et d&#39;analyse des sorties. Pour l&#39;utilisateur novice avec peu de MATLAB et / ou l&#39;analyse computationnelle expérence, plusTipTracker a plus de fonctionnalités conviviales, y compris les sorties de paramètres statistiques automatisés. Ici, nous décrivons les étapes d&#39;analyse d&#39;images de la dynamique EB1-GFP en culture de Xenopus cônes de croissance laevis. Ce protocole a été utilisé dans une étude récente examinant la dynamique MT 17. Voir aussi Lowery et al. 2012 5 pour obtenir des instructions détaillées sur les cônes de croissance de la culture exprimant EB1-GFP. Bien que ce papier essentiellement porté sur l&#39;examen dynamique EB1-GFP dans les cônes de croissance, le même protocole peut être utilisé pour d&#39;autres types de cellules 17. Pour tous les types de cellules, l&#39;intervalle de temps entre les images doit être comprise entre 0,5-2 sec pour optimiser le suivi + TIP. Un intervalle d&#39;au plus 4 secondes de temps entre les images est possible, mais cette augmentation des résultats en temps d&#39;intervalle dans les erreurs de suivi supplémentaires.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">plusTipTracker software</td>
			<td style="width:116px;">Danuser Lab</td>
			<td style="width:345px;"><a href="http://lccb.hms.harvard.edu/software.html">http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</a></td>
			<td style="width:172px;">This software may be hosted by another website in the future.&#160; If the listed site does not exist, search &#34;Danuser Lab Software&#34; on a web search engine to find the site.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Matlab software</td>
			<td style="width:116px;">Mathworks</td>
			<td><a href="http://www.mathworks.com/products/matlab/">http://www.mathworks.com/products/matlab/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using plustiptracker software to measure microtubule dynamics in xenopus laevis growth cones

Microtubules (MT) plus-fin-suivi protéines (+ TIP) se localisent à la plus-extrémités croissantes de MT et régulent la dynamique MT 1,2. Un des conseils les plus connus et largement utilisés-+ pour analyser la dynamique de MT est la Fin-binding protein, EB1, qui lie tous les MT ainsi que les fins de croissance, et donc, c&#39;est un marqueur de MT polymérisation 1. De nombreuses études sur le comportement des EB1 dans les cônes de croissance ont utilisé beaucoup de temps et, les méthodes de suivi de la main assistée par ordinateur biaisées pour analyser individu MT 1-3. Notre approche consiste à quantifier les paramètres globaux de la dynamique MT en utilisant le logiciel, plusTipTracker 4, suite à l&#39;acquisition de haute résolution, les images en direct de EB1 marqué dans les cônes de croissance embryonnaires cultivées 5. Ce logiciel est un open-source package convivial basé sur MATLAB, qui allie la détection automatique, le suivi, la visualisation et l&#39;analyse des films de + TIP marquées par fluorescence. Ici, nous présentons le protocole d&#39;utilisation plusTipTRâtelier pour l&#39;analyse des comètes marquées par fluorescence TIP + en culture de Xenopus cônes de croissance laevis. Toutefois, ce logiciel peut également être utilisée pour caractériser la dynamique de MT dans divers types de cellules 8.6.

Grâce à ce logiciel, comme décrit ici fournira plusieurs fichiers d&#39;informations qui permettent de quantifier la dynamique + TIP dans les cellules vivantes. La fonction plusTipGetTracks identifie les pistes (en utilisant par exemple les paramètres présentés dans la figure 1), puis fournit des paramètres concernant les pistes TIP +. Pour afficher les informations que le logiciel a obtenu, allez dans le répertoire roi_X qui a été créé à l&#39;étape 2.2. Le do...

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Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

L&#39;, logiciel basé sur MATLAB open source, plusTipTracker, peut être utilisé pour analyser une série d&#39;images de fluorescence marqué + conseils pour quantifier la dynamique des microtubules.

Utilisation plusTipTracker Software mesurer microtubules Dynamics<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Cônes de croissance

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

using-plustiptracker-software-to-measure-microtubule-dynamics-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

10.3K vues.  Boston College.  L', logiciel basé sur MATLAB open source, plusTipTracker, peut être utilisé pour analyser une série d'images de fluorescence marqué + conseils pour quantifier la dynamique des microtubules. 

Vidéo: Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Plastique Embedding et le sectionnement des embryons de Xenopus laevis

Recherche

Biologie

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Obtention des oeufs de Xenopus laevis femelles

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Préparation et fractionnement de Xenopus laevis oeufs Extraits

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection d&#39;ovocytes de Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Détermination des tissus Utilisation de la transplantation Cap animale (ACT) Dosage dans<em&gt; Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Imagerie des cellules vivantes et de l&#39;analyse quantitative des cellules embryonnaires épithéliales Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

Production d&#39;<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Œuf Extraits pour identifier les ARN associée aux microtubules

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Transplantations faciales<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryons

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

Dissection de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Crête neurale pour<em&gt; In vitro</em&gt; Culture explantation ou<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis comme un modèle pour identifier traduction Dépréciation

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Utilisation plusTipTracker Software mesurer microtubules Dynamics

Résumé

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Chapitres dans cette vidéo

Plastique Embedding et le sectionnement des embryons de Xenopus laevis

Obtention des oeufs de Xenopus laevis femelles

Préparation et fractionnement de Xenopus laevis oeufs Extraits

Microinjection d'ovocytes de Xenopus laevis

Détermination des tissus Utilisation de la transplantation Cap animale (ACT) Dosage dans

Imagerie des cellules vivantes et de l'analyse quantitative des cellules embryonnaires épithéliales Xenopus laevis

Production d'

Transplantations faciales

Dissection de

Xenopus laevis comme un modèle pour identifier traduction Dépréciation