We thank Dr. Gaudenz Danuser and members of his lab for creating the plusTipTracker software and for helpful discussion regarding using the software, in particular Maria Bagonis and Sebastien Besson. We especially thank the Boston College Media Center for their assistance and support in the creation and editing of the video. We also thank members of the Lowery Lab for useful discussions and constructive criticism, and Abigail Antoine for proof-reading the manuscript. This work was funded by an NIH R00 MH095768 award to LAL.

Questo protocollo e il video hanno lo scopo di servire come un compagno per la carta originale che descrive il pacchetto software in modo più dettagliato 4, così come la relazione tecnica che accompagna il download del software sul sito web di Danuser Lab. I lettori sono invitati a rivedere questi documenti con attenzione se ci sono domande supplementari per quanto riguarda l&#39;utilizzo del software. 1 Prima di Image Analysis <ol><li> Convertire ogni filmato time-lapse in una sequenza di TIFF (Tagged Image File Format) file di immagine. Se ci sono più coni di crescita / cellule in un determinato film, primo raccolto ogni cono di crescita / cellulare per creare la propria sequenza di immagini. Nota: Questo non è necessario, in quanto possono essere selezionati singole regioni-di-interesse (ROI) entro plusTipTracker. Tuttavia, utilizzando dimensioni immagine inferiori aumenta la velocità del trattamento computazionale, quindi questo passaggio è consigliata in caso di notevole spazio vuoto nell&#39;immagine. </li><li> Salva ogni serie TIFF nel propriocartella chiamata &quot;images&quot; all&#39;interno di un percorso che MATLAB è impostato su Accesso (notare che &quot;le immagini&quot; è case-sensitive). Per aggiungere un nuovo percorso, passare alla directory del file corrispondente nella finestra &quot;Current Folder&quot;, fare clic destro sull&#39;icona della cartella e selezionare &quot;Aggiungi a Path - Cartelle selezionate e sottocartelle&quot;. E &#39;importante che la cartella del software plusTipTracker essere aggiunta al Sentiero, pure. </li></ol> 2. plusTipGetTracks Nota: Il primo passo per l&#39;analisi delle immagini è quello di individuare le comete EB1-GFP, collegare le comete in tracce, e determinare i parametri della dinamica dei microtubuli. Questo si ottiene con il comando &quot;plusTipGetTracks&quot; 4. <ol><li> Per iniziare l&#39;analisi, applicazioni MATLAB aperto e digitare &quot;plusTipGetTracks&quot; nella finestra di comando. Ciò causerà una nuova finestra di dialogo deve. </li><li> Clicca su &quot;Imposta nuovi progetti&quot; e selezionare uno (o more), della precedente serie di immagini TIFF selezionando il &quot;immagini&quot; appropriate cartella (o directory contenenti &quot;immagini&quot; cartelle). Al termine di questa fase, una directory di file (roi_1) verrà creato (nella stessa cartella che contiene &quot;immagini&quot;) che conterrà i file di dati futuri. Nota: la fase di &quot;creare nuovi progetti&quot; può essere completato prima del tempo, nel corso di una sessione separata. </li><li> Una nuova finestra apparirà: &quot;Seleziona un poligono, fare clic destro su quest&#39;ultimo punto, e fare clic su &#39;Create Mask&#39;&quot;. Fare clic su &quot;OK&quot;. Verrà visualizzata la prima immagine della serie dell&#39;immagine selezionata. Usa il mouse per fare clic e creare un poligono che racchiude la totalità del cono di crescita. Fare doppio clic con il mouse per chiudere il poligono. </li><li> Una volta che il poligono è stato chiuso, una finestra di dialogo apparirà: &quot;Vuoi selezionare un altro ROI?&quot; Se l&#39;immagine ha un altro cono di crescita per analizzare, selezionare &quot;Sì&quot;; altrimenti seletti &quot;No&quot;. </li><li> Selezionare i progetti che verranno immediatamente analizzati. Clicca su &quot;Seleziona Projects&quot; e selezionare la cartella (roi_X) analizzare. </li><li> Viene visualizzata una schermata listSelectGUI. Selezionare il progetto (s) dal lato sinistro dello schermo e spostarli sul lato destro dello schermo. Fare clic su &quot;OK&quot;. Scegliere un percorso per salvare l&#39;elenco di progetti e fare clic su &quot;Salva&quot;. </li><li> Selezionare &quot;Detection&quot;, &quot;monitoraggio&quot;, e &quot;Post-Processing&quot;. Una volta effettuate queste selezioni, il lato destro della finestra di dialogo sarà configurabile. Configurare ogni opzione. <ol><li> Questi parametri vengono utilizzati per collegare le comete rilevati in tracce MT. Dettagli per la scelta di questi parametri di controllo per il monitoraggio sono inclusi nelle pagine 9-10 della relazione tecnica in formato PDF che accompagna il pacchetto di download del software; leggere questo rapporto con attenzione se si verificano problemi. Ai fini del monitoraggio comete EB1-GFP in Xenopci laevis coni di crescita, utilizzare le seguenti impostazioni di rilevamento: Cerca Raggio Gamma (5-12 pixel), lunghezza minima Sub-Track (frame) 3; Max Gap Lunghezza (fotogrammi) 8; Max Factor Ritiro 0.8, angolo di andata massima 50, angolo di Max indietro 10, Fluctuation Radius 2.5. Queste impostazioni sono mostrate nella Figura 1. </li></ol> Nota: Max Factor Il restringimento è impostato per ridurre il numero di &quot;lacune arretrate&quot; rilevati, come &quot;lacune arretrati&quot; non sono utili per analizzare nel contesto di coni di crescita, date le condizioni di sovraffollamento e le probabili errori nei collegamenti della pista. Inoltre, sia l&#39;angolo di andata massima ed anche cambiamenti Radius sono impostati relativamente alta, come MTS cono di crescita presentano piccoli traslocazioni frequenti oltre alle crescite e ritiri, e aumentando le impostazioni di controllo permette di questa maggiore movimento durante la fase di collegamento. <ol><li> Compilare i post-elaborazione delle impostazioni a seconda delle impostazioni di acquisizione di immagini specifiche desiderate. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Una volta configurate le impostazioni, fare clic su &quot;Start&quot;. Il software verrà eseguito a seconda delle impostazioni sono stati selezionati. Questo può richiedere minuti o ore, a seconda del numero di progetti selezionati e le loro dimensioni. La Finestra di comando visualizza il tempo residuo stimato per ogni funzione. Quando il passo plusTipGetTracks è completata, la finestra di comando visualizzerà &quot;Finito!&quot; Nota: Una lunga lista di parametri specifici della dinamica MT sono ora calcolato da questo software (vedi riferimento 4 per i dettagli), ma per l&#39;analisi delle dinamiche di MT in coni di crescita, i parametri più utili per esaminare sono la velocità pista crescita MT (in micron / minuto), durata percorso di crescita (in secondi), e la lunghezza della traccia crescita (in micron). </li></ol> 3. plusTipSeeTracks Nota: Ora che le tracce microtubuli sono state definite, la funzione &quot;plustipSeeTracks&quot; viene utilizzato per la visualizzazione traccia 4. Questa funzionein grado di fornire le uscite multiple per la visualizzazione, tra cui dinamica MT spaziali mappe e filmati di velocità, ma qui, l&#39;attenzione è rivolta esclusivamente sull&#39;utilizzo di &quot;Movies Track&quot; per visualizzare i brani MT sovrapposte le immagini cono di crescita. Mentre plusTipGetTracks possono analizzare più filmati alla volta, plusTipSeeTracks possono analizzare solo un film alla volta. <ol><li> Digitare &quot;plusTipSeeTracks&quot; nella finestra di comando. </li><li> Dopo il caricamento della finestra di dialogo, cliccare su &quot;Select Progetto&quot;. Selezionare la directory principale che contiene il progetto per visualizzare e clicca su &quot;Seleziona cartella&quot;. Una nuova finestra apparirà: &quot;Selezionare il progetto che si desidera visualizzare&quot;. Scegliere il file da visualizzare e fare clic su &quot;OK&quot;. </li><li> Avanti, fare clic su &quot;Select Saved ROI&quot;. Passare alla stessa cartella roi_X come quello selezionato nel passo precedente e selezionare il file denominato &quot;roiYX&quot;. </li><li> Clicca su &quot;Seleziona directory di output&quot; per designare wqui MATLAB salverà i file di visualizzazione delle tracce. Nota: si consiglia di utilizzare la stessa cartella che contiene il resto dei dati. </li><li> Selezionare &quot;Crea Traccia di un film&quot; e apparirà una schermata che visualizza tutte le tracce plusTipGetTracks calcolati dalle comete TIP +. Questo passaggio consente di risparmiare la serie storica rintracciato in un formato video, nel file &quot;allTracks_X_X_X&quot;. C&#39;è un&#39;opzione per salvare il filmato come AVI, altrimenti il ​​formato predefinito è come un file Quicktime.mov. </li></ol> 4. plusTipGroupAnalysis Nota: Questa funzione finale è utilizzata per creare gruppi di film per l&#39;analisi e il confronto dei parametri di traccia MT. <ol><li> Digitare &quot;plusTipGroupAnalysis&quot; nella finestra di comando. Per selezionare manualmente i gruppi per confrontare, prima de-selezionare &quot;gruppo di Auto da gerarchia&quot;. Quindi, fare clic su &quot;Seleziona progetti&quot;. Passare alla directory superiori che contengono tutte le cartelle roi_Xanalizzare. </li><li> Viene visualizzata una schermata listSelectGUI. Selezionare tutti i progetti da includere nei gruppi dal lato sinistro dello schermo e spostarli sul lato destro dello schermo. Fare clic su &quot;OK&quot;. Scegliere un percorso per salvare l&#39;elenco di progetti e fare clic su &quot;Salva&quot;. </li><li> Apparirà una finestra: &quot;Si prega di selezionare primo gruppo dall&#39;elenco&quot;. Fare clic su &quot;OK&quot;. La finestra listSelectGUI mostrerà di nuovo. Questa volta, selezionare solo i file che corrispondono al primo gruppo che dovrebbe essere raggruppate. Fare clic su &quot;OK&quot;. </li><li> Quindi, immettere il nome del gruppo e fare clic su &quot;OK&quot;. Apparirà una finestra: &quot;Selezionare un altro gruppo?&quot; Risposta di conseguenza e continuare a selezionare gruppi. Apparirà una finestra: &quot;Selezionare una posizione per salvare la lista del gruppo&quot;. Passare alla posizione e fare clic su &quot;Salva&quot;. </li><li> Clicca su &quot;Select Output Directory&quot; per scegliere dove le cartelle di output sarannomemorizzato. </li><li> Selezionare il tipo di analisi di gruppo per condurre - se le tracce MT devono essere raggruppati per ciascun gruppo o per l&#39;analisi delle cellule dovrebbe essere eseguita. I test statistici raccomandati sono già designati. Per includere tutti i brani nell&#39;analisi, de-selezionare &quot;Rimuovi le tracce a inizio / fine del film&quot;. In caso contrario, avendo questa casella selezionata rimuove eventuali tracce di crescita MT che sono in corso come il film inizia o termina. </li><li> Una volta effettuata la selezione Analysis Group, selezionare &quot;Confronta i gruppi&quot;. </li></ol>

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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EB1+accelerates+two+conformational+transitions+important+for+microtubule+maturation+and+dynamics.">EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics.</a> Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).</li><li>Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+between+XMAP215+and+EB1+increases+microtubule+growth+rates+to+physiological+levels.">Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels.</a> Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).</li><li>Lowery, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone-specific+functions+of+XMAP215+in+restricting+microtubule+dynamics+and+promoting+axonal+outgrowth.">Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth.</a> Neural development. 8, 22 (2013).</li><li>Marx, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+cytoplasmic+linker-associated+protein+1+(XCLASP1)+promotes+axon+elongation+and+advance+of+pioneer+microtubules.">Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules.</a> Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

PlusTipTracker fornisce una semplice interfaccia grafica per rilevare rapidamente e automaticamente quasi tutti visibili comete EB1-GFP in un cono di cellulare o di crescita, collegare le comete in tracce, e calcolare i parametri MT. Altre pubblicazioni hanno riportato la progettazione di simili tipi di software (per esempio, Marx et al. Analisi quantitativa anche utilizzato delle dinamiche EB1 taggati in coni di crescita 18). Ma, questo software sembra essere unico nella sua facilità di accesso, in...

L&#39;obiettivo di questo metodo è quello di ottenere informazioni quantitative in materia di microtubuli (MT) più--end inseguimento dinamica a vivere coni di crescita di proteine ​​(+ TIP). MT + TIP sono un gruppo di proteine ​​che localizzano ai più-end di MTS 9,10. Essi svolgono una serie di funzioni per regolare i parametri di instabilità dinamica MT 11, compresi i tassi di polimerizzazione, catastrofe, e soccorso. Un metodo ben utilizzato per analizzare le dinamiche MT è quello di monitorare il comportamento del EB1 TIP +, che si lega specificamente alla crescente MT plus-conclude 1,12. EB1 è conosciuto per reclutare diverse altre proteine ​​per crescere MT plus-conclude 13,14, ed è stato recentemente istituito come un fattore di maturazione MT 15, MT promuovere sia la crescita e la frequenza catastrofe 15,16. Molti studi di dinamica MT all&#39;interno di coni di crescita hanno utilizzato metodi di mano-tracking per misurare i cambiamenti nelle dinamiche EB1-GFP nel tempo 1-3, come EB1 localizatia MT, più-end possono essere usati come marker per MT polimerizzazione. Uno dei principali vantaggi per l&#39;esame comete EB1-GFP come proxy per la crescita MT è che la dinamica MT possono essere misurati anche nelle regioni di sovrapposizione significativa MT. Mentre il metodo di tracciamento a mano comete EB1-GFP ha fornito indicazioni utili in MT comportamenti 1-3, è che richiede tempo e può essere prevenuto. Inoltre, come la crescita aberrante comportamenti cono sono probabilmente il risultato di cambiamenti minute dinamica del citoscheletro, analizzando solo un piccolo sottoinsieme di MTS (di solito necessario quando la mano-tracking) possono perdere informazioni significative. Così, misuriamo globali parametri delle dinamiche MT utilizzando il pacchetto software, plusTipTracker 4, dopo l&#39;acquisizione ad alta risoluzione, immagini in diretta di EB1 taggato in coltura coni di crescita embrionali 5. Questo software, sviluppato in Danuser Lab, è stata utilizzata in diversi studi che caratterizzano dinamiche MT in vari tipi di cellule 6-8. Si tratta di un open-source, cier-amichevole, pacchetto basato su MATLAB, che comprende il rilevamento automatico, il monitoraggio, la visualizzazione e l&#39;analisi per i film di fluorescenza marcata + TIP. Una lunga lista di parametri specifici della dinamica MT sono calcolati da questo software (vedi riferimento 4 per i dettagli), ma per l&#39;analisi delle dinamiche MT in coni di crescita, i parametri più utili sono la velocità pista crescita MT (in micron / minuto), traccia la crescita durata (in secondi), e la lunghezza della traccia crescita (in micron). Il software può essere scaricato direttamente dal sito web Danuser Lab (sotto &quot;Software&quot;). Mentre il Danuser Lab supporta attualmente una nuova interfaccia per il monitoraggio TIP + analisi, che è integrata in un pacchetto software chiamato u-track 2.0, l&#39;originale, software stand-alone rimarrà disponibile. Gli algoritmi sottostanti tra i due programmi sono uguali (almeno dal 2014), con solo una differenza di uscite dell&#39;interfaccia e di analisi. Per l&#39;utente inesperto con poco MATLAB e / o l&#39;analisi computazionale esperimentiza, plusTipTracker ha più caratteristiche user-friendly, tra cui le uscite dei parametri statistici automatizzati. Qui, descriviamo la procedura per l&#39;analisi di immagini dinamiche EB1-GFP in coltura Xenopus laevis coni di crescita. Questo protocollo è stato utilizzato in un recente documento esamina le dinamiche MT 17. Per istruzioni dettagliate relative coni di crescita coltura esprimono EB1-GFP Vedi anche Lowery et al. 2012 5. Anche se questo documento è concentrata principalmente sull&#39;esame dinamiche EB1-GFP in coni di crescita, lo stesso protocollo può essere utilizzato per altri tipi di cellule 17. Per tutti i tipi di cellule, l&#39;intervallo di tempo tra i fotogrammi deve essere compresa tra 0,5-2 sec per il monitoraggio ottimale + TIP. Un intervallo di tempo di fino a 4 secondi tra i frame è possibile, ma questo aumento risultati in tempo intervallo di tracking error supplementari.

<table><tbody><tr><td>plusTipTracker software</td><td>Danuser Lab</td><td>&lt;a href=&quot;http://lccb.hms.harvard.edu/software.html&quot;&gt;http://lccb.hms.harvard.edu/software.html&lt;/a&gt;</td><td>This software may be hosted by another website in the future.&amp;nbsp; If the listed site does not exist, search &quot;Danuser Lab Software&quot; on a web search engine to find the site.</td></tr><tr><td>MATLAB software</td><td>Mathworks</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mathworks.com/products/matlab/&quot;&gt;http://www.mathworks.com/products/matlab/&lt;/a&gt;</td><td></td></tr></tbody></table>

using plustiptracker software to measure microtubule dynamics in xenopus laevis growth cones

Microtubuli (MT) più-end-tracking proteine ​​(+ TIP) localizzano alle crescenti più-estremità di MTS e regolano le dinamiche MT 1,2. Uno dei suggerimenti più noti e ampiamente utilizzati + per l&#39;analisi dinamica MT è l&#39;End-binding protein, EB1, che lega tutte le crescenti MT plus-end, e, quindi, è un marker per MT polimerizzazione 1. Molti studi del comportamento EB1 entro coni di crescita hanno utilizzato in termini di tempo e di parte assistita da computer, i metodi a mano-tracking per analizzare singoli MT 1-3. Il nostro approccio è quello di quantificare i parametri globali della dinamica MT utilizzando il pacchetto software, plusTipTracker 4, a seguito dell&#39;acquisizione di alta risoluzione, immagini in diretta di EB1 taggato in coltura coni di crescita embrionali 5. Questo software è un basato su MATLAB, open-source, pacchetto user-friendly che combina il rilevamento automatico, il monitoraggio, la visualizzazione e l&#39;analisi per i film di fluorescenza marcata + TIP. Qui, vi presentiamo il protocollo per l&#39;utilizzo di plusTipTRacker per l&#39;analisi delle comete fluorescenza marcata + TIP in colture di Xenopus laevis coni di crescita. Tuttavia, questo software può anche essere utilizzato per caratterizzare la dinamica MT in vari tipi di cellule 6-8.

Usando questo software, come descritto qui fornirà diversi file di informazioni che quantificano + dinamiche TIP nelle cellule viventi. I plusTipGetTracks funzione identifica le tracce (con esempio impostazioni mostrate nella figura 1), e quindi fornisce parametri relativi alle tracce TIP +. Per visualizzare le informazioni che il software ha ottenuto, andare nella directory roi_X creata nel passaggio 2.2. La cartella &quot;impresa&quot; contiene &quot;overlayImages&quot;, ...

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Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Il pacchetto software basato su MATLAB open source, plusTipTracker, può essere utilizzato per analizzare serie di immagini di + TIP fluorescenza marcata per quantificare la dinamica dei microtubuli.

Utilizzo plusTipTracker software per misurare Microtubulo Dynamics in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; coni di crescita

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

using-plustiptracker-software-to-measure-microtubule-dynamics-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

10.3K Views.  Boston College.  Il pacchetto software basato su MATLAB open source, plusTipTracker, può essere utilizzato per analizzare serie di immagini di + TIP fluorescenza marcata per quantificare la dinamica dei microtubuli. 

Video: Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane resistance in cancerous cells drastically reduces the effectiveness of the drugs' long-term usage. Accumulated evidence suggests that the mechanisms underlying taxane resistance include both general mechanisms, such as the development of multidrug resistance due to the overexpression of drug-efflux proteins, and taxane-specific mechanisms, such as those that involve microtubule dynamics. 
Because taxanes target cell microtubules, measuring microtubule dynamic instability is an important step in determining the mechanisms of taxane resistance and provides insight into how to overcome this resistance. In the experiment, an in vivo method was used to measure microtubule dynamic instability. GFP-tagged &#945;-tubulin was expressed and incorporated into microtubules in MCF-7 cells, allowing for the recording of the microtubule dynamics by time lapse using a sensitive camera. The results showed that, as opposed to the non-resistant parental MCF-7CC cells, the microtubule dynamics of docetaxel-resistant MCF-7TXT cells are insensitive to docetaxel treatment, which causes the resistance to docetaxel-induced mitotic arrest and apoptosis. This paper will outline this in vivo method of measuring microtubule dynamic instability.

In this paper, we report a protocol describing an in vivo method to measure microtubule dynamic instability in docetaxel-resistant breast cancer cells (MCF-7TXT). In this method, a deconvolution microscopy imaging system is used to detect the expression of GFP-tubulin in target cells.

Immagini dal vivo per studiare Microtubulo instabilità dinamica nei tumori al seno taxani resistente

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and networks often contain subsets of microtubule arrays that differ in their dynamic properties. For example, in dividing cells, stable bundles of crosslinked microtubules coexist in close proximity to dynamic non-crosslinked microtubules. TIRF-microscopy-based in vitro reconstitution studies enable the simultaneous visualization of the dynamics of these different microtubule arrays. In this assay, an imaging chamber is assembled with surface-immobilized microtubules, which are either present as single filaments or organized into crosslinked&#160;bundles. Introduction of tubulin, nucleotides, and protein regulators allows direct visualization of associated proteins and of dynamic properties of single and crosslinked microtubules. Furthermore, changes that occur as dynamic single microtubules organize into bundles can be monitored in real-time. The method described here allows for a systematic evaluation of the activity and localization of individual proteins, as well as synergistic effects of protein regulators on two different microtubule subsets under identical experimental conditions, thereby providing mechanistic insights that are inaccessible by other methods.

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Here, a TIRF microscopy-based in vitro reconstitution assay is presented to simultaneously quantify and compare the dynamics of two microtubule populations. A method is described to simultaneously view the collective activity of multiple microtubule-associated proteins on crosslinked microtubule bundles and single microtubules.

Visualizzazione simultanea della dinamica di microtubuli reticolati e singoli in vitro mediante microscopia TIRF

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Biochimica

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopy has a high signal-to-background ratio, but it suffers from photobleaching and photodamage of the fluorescent proteins. Label-free techniques such as interference reflection microscopy (IRM) and interferometric scattering microscopy (iSCAT) circumvent the problem of photobleaching but cannot readily visualize single molecules. This paper presents a protocol for combining IRM with a commercial TIRF microscope for the simultaneous imaging of microtubule-associated proteins (MAPs) and dynamic microtubules in vitro. This protocol allows for high-speed observation of MAPs interacting with dynamic microtubules. This improves on existing two-color TIRF setups by eliminating both the need for microtubule labeling and the need for several additional optical components, such as a second excitation laser. Both channels are imaged on the same camera chip to avoid image registration and frame synchronization problems. This setup is demonstrated by visualizing single kinesin molecules walking on dynamic microtubules.

We present a protocol for implementing interference-reflection microscopy and total-internal-reflection-fluorescence microscopy for the simultaneous imaging of dynamic microtubules and fluorescently labeled microtubule-associated proteins.

Microscopia a fluorescenza a riflessione interna simultanea e riflessione interna totale per l'imaging di microtubuli dinamici e proteine associate

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the dynamic properties of the cytoskeleton. This protocol offers a technique for human primary fibroblast transfection, which can be difficult because of the specifics of primary cell cultivation conditions. Additionally, cytoskeleton dynamic property maintenance requires a low level of transfection to obtain a good signal-to-noise ratio without causing microtubule stabilization. It is important to take measures to protect the cells from light-induced stress and fluorescent dye fading. In the course of our work, we tested different transfection methods and protocols as well as different vectors to select the best combination of conditions suitable for human primary fibroblast studies. We analyzed the resulting time-lapse videos and calculated microtubule dynamics using ImageJ. The dynamics of microtubules' plus-ends in the different cell parts are not similar, so we divided the analysis into subgroups - the centrosome region, the lamella, and the tail of fibroblasts. Notably, this protocol can be used for in vitro analysis of cytoskeleton dynamics in patient samples, enabling the next step towards understanding the dynamics of the various disease development.

This protocol is dedicated to the microtubule plus-end visualization by EB3 protein transfection to study their dynamic properties in primary cell culture. The protocol was implemented on human primary skin fibroblasts obtained from Huntington's disease patients.

Visualizzazione dinamica plus-end dei microtubuli nel modello della malattia di Huntington basato sui fibroblasti cutanei primari umani

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the ...

Bioingegneria

Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are thought to play a vital role in the microtubule-dependent chromosome motions during cell division, but the relevant proteins and their exact roles are ill-defined. Thus, there is a growing need to develop assays with which to study such motility in vitro using purified components and defined biochemical milieu. Microtubules, however, are inherently unstable polymers; their switching between growth and shortening is stochastic and difficult to control. The protocols we describe here take advantage of the segmented microtubules that are made with the photoablatable stabilizing caps. Depolymerization of such segmented microtubules can be triggered with high temporal and spatial resolution, thereby assisting studies of motility at the disassembling microtubule ends. This technique can be used to carry out a quantitative analysis of the number of molecules in the fluorescently-labeled protein complexes, which move processively with dynamic microtubule ends. To optimize a signal-to-noise ratio in this and other quantitative fluorescent assays, coverslips should be treated to reduce nonspecific absorption of soluble fluorescently-labeled proteins. Detailed protocols are provided to take into account the unevenness of fluorescent illumination, and determine the intensity of a single fluorophore using equidistant Gaussian fit. Finally, we describe the use of segmented microtubules to study microtubule-dependent motions of the protein-coated microbeads, providing insights into the ability of different motor and nonmotor proteins to couple microtubule depolymerization to processive cargo motion.

Microtubules are inherently unstable polymers, and their switching between growth and shortening is stochastic and difficult to control. Here we describe protocols using segmented microtubules with photoablatable stabilizing caps. Depolymerization of segmented microtubules can be triggered with high temporal and spatial resolution, thereby assisting analysis of motions with the disassembling microtubule ends.

Preparazione di segmentate microtubuli allo Studio Proposte guidato dal Smontaggio microtubuli Ends

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are ...

Biologia

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes depend on the advances of growth cones that located at the tips of neurites. Axonal growth cones generate driving forces by sensing their local microenvironment and modulating cytoskeletal dynamics and actin-adhesion coupling (clutch coupling). Decades of research have led to the identification of guidance molecules, their receptors, and downstream signaling cascades for regulating neuronal migration and axonal guidance; however, the molecular machineries required for generating forces to drive growth cone advance and navigation are just beginning to be elucidated. At the leading edge of neuronal growth cones, actin filaments undergo retrograde flow, which is powered by actin polymerization and actomyosin contraction. A clutch coupling between F-actin retrograde flow and adhesive substrate generates traction forces for growth cone advance. The present study describes a detailed protocol for monitoring F-actin retrograde flow by single speckle imaging. Importantly, when combined with an F-actin marker Lifeact, this technique can quantify 1) the F-actin polymerization rate and 2) the clutch coupling efficiency between F-actin retrograde flow and the adhesive substrate. Both are critical variables for generating forces for growth cone advance and navigation. In addition, the present study describes a detailed protocol of traction force microscopy, which can quantify 3) traction force generated by growth cones. Thus, by coupling the analyses of&#160;single speckle imaging and traction force microscopy, investigators can monitor the molecular mechanics underlying growth cone advance and navigation.

To advance, growth cones must exert traction forces against the external environment. The generation of traction forces is dependent on actin dynamics and clutch coupling. The present study describes methods for analyzing actin dynamics, clutch coupling and traction forces for growth cone advance.

Analisi della dinamica dell'actina, dell'accoppiamento della frizione e della forza di trazione per l'avanzamento del cono di crescita

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...

Neuroscienze

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Ad alta risoluzione Time-lapse imaging e analisi automatizzata dei microtubuli Dynamics in Living ombelicale umano cellule endoteliali Vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Ad alta risoluzione Imaging e analisi dei singoli microtubuli astrali Dynamics in germogliamento lievito

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Un&#39;interfaccia utente grafica per il monitoraggio assistito della concentrazione di proteine ​​in protrusioni cellulari dinamiche

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a genetically encoded marker for the positive ends of microtubules (EB3 labelled with tdTomato fluorescent protein) and high-speed, high-resolution, live-cell imaging using spinning disk confocal microscopy. Cell cycle synchronization and increased density of microtubules are achieved by inhibiting centrosomal separation in mitotic cells, and analysis of growth is performed using open-source U-Track software. The use of a bright and red-shifted fluorescent protein, in combination with the lower laser power and reduced exposure time required for spinning disk microscopy reduce phototoxicity and the probability of light-induced artifacts. This allows for imaging a larger number of cells in the same preparation while maintaining the cells in a growth medium under standard culture conditions. Because the analysis is performed in a supervised automatic fashion, the results are statistically robust and reproducible.

Here we present a robust and detailed method of microtubule dynamics analysis in cells synchronized in prometaphase using live-cell spinning disk confocal microscopy and MATLAB-based image processing.

Misurazione della microtubule Dynamics mediante microscopia disco rotante in spindle mitotici monopolari

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a ...

Utilizzo plusTipTracker software per misurare Microtubulo Dynamics in

Riepilogo

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Immagini dal vivo per studiare Microtubulo instabilità dinamica nei tumori al seno taxani resistente

Visualizzazione simultanea della dinamica di microtubuli reticolati e singoli in vitro mediante microscopia TIRF

Microscopia a fluorescenza a riflessione interna simultanea e riflessione interna totale per l'imaging di microtubuli dinamici e proteine associate

Visualizzazione dinamica plus-end dei microtubuli nel modello della malattia di Huntington basato sui fibroblasti cutanei primari umani

Preparazione di segmentate microtubuli allo Studio Proposte guidato dal Smontaggio microtubuli Ends

Analisi della dinamica dell'actina, dell'accoppiamento della frizione e della forza di trazione per l'avanzamento del cono di crescita

Ad alta risoluzione Time-lapse imaging e analisi automatizzata dei microtubuli Dynamics in Living ombelicale umano cellule endoteliali Vena

Ad alta risoluzione Imaging e analisi dei singoli microtubuli astrali Dynamics in germogliamento lievito

Un'interfaccia utente grafica per il monitoraggio assistito della concentrazione di proteine in protrusioni cellulari dinamiche

Misurazione della microtubule Dynamics mediante microscopia disco rotante in spindle mitotici monopolari

Utilizzo plusTipTracker software per misurare Microtubulo Dynamics in

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Visualizzazione simultanea della dinamica di microtubuli reticolati e singoli in vitro mediante microscopia TIRF

Microscopia a fluorescenza a riflessione interna simultanea e riflessione interna totale per l'imaging di microtubuli dinamici e proteine associate

Visualizzazione dinamica plus-end dei microtubuli nel modello della malattia di Huntington basato sui fibroblasti cutanei primari umani

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Un'interfaccia utente grafica per il monitoraggio assistito della concentrazione di proteine ​​in protrusioni cellulari dinamiche

Misurazione della microtubule Dynamics mediante microscopia disco rotante in spindle mitotici monopolari

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