We thank Dr. Gaudenz Danuser and members of his lab for creating the plusTipTracker software and for helpful discussion regarding using the software, in particular Maria Bagonis and Sebastien Besson. We especially thank the Boston College Media Center for their assistance and support in the creation and editing of the video. We also thank members of the Lowery Lab for useful discussions and constructive criticism, and Abigail Antoine for proof-reading the manuscript. This work was funded by an NIH R00 MH095768 award to LAL.

Este protocolo e vídeo são destinados a servir como um companheiro para o artigo original que descreve o pacote de software mais detalhadamente 4, bem como o Relatório Técnico que acompanha o download do software no site da Danuser Lab. Os leitores são encorajados a rever estes documentos cuidadosamente se há mais perguntas sobre a utilização do software. 1 Antes de Análise de Imagem <ol><li> Converta cada filme de lapso de tempo em uma seqüência de TIFF (Tagged Image File Format) arquivos de imagem. Se houver vários cones de crescimento / células em um determinado filme, a primeira colheita de cada cone de crescimento / célula para criar a sua própria sequência de imagens. Nota: Isso não é necessário, como regiões de interesse individuais (ROI) pode ser selecionado dentro plusTipTracker. No entanto, utilizando-se as dimensões da imagem menores aumenta a velocidade de processamento computacional, de modo que este passo é recomendável, se houver espaço vazio significativo na imagem. </li><li> Salve cada série TIFF em seu própriopasta chamada &quot;imagens&quot; dentro de um caminho que MATLAB é definido para o acesso (note que &quot;imagens&quot; é sensível a maiúsculas). Para adicionar um novo caminho, navegue até o diretório do arquivo relevante na janela &quot;pasta atual&quot;, clique com o botão direito sobre o ícone do diretório, e selecione &quot;Adicionar ao trajeto - pastas selecionadas e Sub-pastas&quot;. É importante que a pasta do software plusTipTracker ser adicionado ao caminho, como bem. </li></ol> 2. plusTipGetTracks Nota: O primeiro passo na análise de imagens é detectar os cometas EB1-GFP, vincular os cometas em faixas, e determinar os parâmetros da dinâmica dos microtúbulos. Isto é obtido com o comando &quot;plusTipGetTracks&quot; 4. <ol><li> Para começar a análise, aplicação MATLAB aberta e digite &quot;plusTipGetTracks&quot; na janela de comando. Isso fará com que uma nova caixa de diálogo aparecer. </li><li> Clique em &quot;Definir novos projetos&quot; e selecione um (ou more) do TIFF imagem série anterior, selecionando as &quot;imagens&quot; apropriadas pasta (ou pastas que contenham &quot;imagens&quot; pastas). Após a conclusão desta etapa, um diretório de arquivos (roi_1) será criada (na mesma pasta que contém &quot;imagens&quot;) que irá conter os arquivos de dados futuros. Nota: o passo &quot;Configurar Novos Projetos&quot; pode ser concluída antes do tempo, durante uma sessão separada. </li><li> Uma nova janela será exibida: &quot;Selecione um polígono, clique com o botão direito no último ponto, e clique em&quot; Criar máscara &#39;&quot;. Clique em &quot;OK&quot;. A primeira imagem da série imagem selecionada será exibida. Use o mouse para clicar e criar um polígono que abrange a totalidade do cone de crescimento. Dê um duplo clique com o mouse para fechar o polígono. </li><li> Uma vez que o polígono foi fechado, uma caixa de diálogo será exibida: &quot;Você quer selecionar outro ROI?&quot; Se a imagem tem um outro cone de crescimento para analisar, selecione &quot;Sim&quot;; caso contrário, éeleitos &quot;Não&quot;. </li><li> Selecione os projetos que serão imediatamente analisados. Clique em &quot;Selecionar Projetos&quot; e selecione a pasta (roi_X) analisar. </li><li> Uma tela listSelectGUI aparecerá. Selecione o projeto (s) a partir do lado esquerdo da tela e movê-los para o lado direito da tela. Clique em &quot;OK&quot;. Escolha um local para salvar a lista de projeto e clique em &quot;Salvar&quot;. </li><li> Selecione &quot;Detection&quot;, &quot;Rastreio&quot;, e &quot;Pós-Processamento&quot;. Uma vez que essas seleções foram feitas, o lado direito da caixa de diálogo vai se tornar configurável. Configure cada opção. <ol><li> Estes parâmetros são usados ​​para ligar os cometas detectados em faixas MT. Detalhes para a escolha desses parâmetros de controle para monitoramento são incluídos em páginas 9-10 do Relatório Técnico PDF que acompanha o download do pacote de software; Leia o relatório cuidadosamente se forem encontrados problemas. Para efeitos de acompanhamento de cometas EB1-GFP em Xenoplaevis nos cones de crescimento, use as seguintes configurações de Rastreamento: Pesquisar Raio Gama (pixels) 5-12, mínima Sub-Track Comprimento (frames) 3; Max Gap Comprimento (quadros) 8; Max Fator Encolhimento 0,8, ângulo de Max Atacante 50, ângulo de Max para trás 10, Flutuação Radius 2.5. Estas configurações são mostradas na Figura 1. </li></ol> Nota: Max Fator Encolhimento é ajustado para reduzir o número de &quot;atrasados&quot; lacunas detectadas, como &quot;lacunas para trás&quot; não são úteis para analisar no contexto dos cones de crescimento, dadas as condições de superlotação e erros prováveis ​​em ligações de pista. Além disso, tanto ângulo Max Atacante, bem como Flutuação Radius são definidas relativamente alto, como MTs cone de crescimento apresentam pequenas translocações freqüentes, além de crescimentos e retrações, e aumentando a essas configurações de controle permite a este aumento de movimento durante a etapa de ligação. <ol><li> Preencha os pós-processamento configurações, dependendo das configurações específicas de aquisição de imagem desejados. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Uma vez que as configurações tenham sido configuradas, clique em &quot;Iniciar&quot;. O software será executado conforme as configurações foram selecionados. Isso pode levar minutos ou horas, dependendo do número de projetos selecionados e seus tamanhos. A janela de comando exibe o tempo restante estimado para cada função. Quando a etapa plusTipGetTracks estiver concluída, a janela de comando exibirá &quot;Concluído!&quot; Nota: Uma longa lista de parâmetros específicos da dinâmica MT agora foram calculados por este software (ver referência 4 para mais detalhes), mas para a análise da dinâmica de MT em cones de crescimento, os parâmetros mais úteis a serem examinados são MT velocidade pista crescimento (em microns / minuto), tempo de vida pista crescimento (em segundos) e duração da faixa de crescimento (em microns). </li></ol> 3. plusTipSeeTracks Nota: Agora que as faixas de microtúbulos têm sido definidos, a função &quot;plustipSeeTracks&quot; é utilizado para o controle de visualização 4. Esta funçãopode fornecer várias saídas para visualização, incluindo a dinâmica MT espaciais mapas e filmes de velocidade, mas aqui, o foco é apenas sobre o uso de &quot;Filmes faixa&quot; para exibir faixas MT sobrepostas nas imagens cone de crescimento. Enquanto plusTipGetTracks pode analisar vários filmes de uma vez, plusTipSeeTracks só pode analisar um filme de cada vez. <ol><li> Digite &quot;plusTipSeeTracks&quot; na janela de comando. </li><li> Após o carregamento da caixa de diálogo, clique em &quot;Select Project&quot;. Selecione o diretório pai que contém o projeto de visualizar e clique em &quot;Selecionar Pasta&quot;. Uma nova janela será exibida: &quot;Selecione o projeto que deseja visualizar&quot;. Escolha o arquivo para visualizar e clique em &quot;OK&quot;. </li><li> Em seguida, clique em &quot;Select ROI Saved&quot;. Navegue para a mesma pasta roi_X que o selecionado na etapa anterior e selecione o arquivo com o nome &quot;roiYX&quot;. </li><li> Clique em &quot;Selecionar Output Directory&quot; para designar waqui MATLAB irá salvar os arquivos de visualização de pista. Nota: Recomenda-se utilizar a mesma pasta que contém o resto dos dados. </li><li> Selecione &quot;Make Movie Track&quot; e aparecerá uma tela mostrando todas as faixas plusTipGetTracks calculadas a partir dos cometas PONTA +. Esta etapa salva a série temporal rastreado em um formato de filme, no arquivo &quot;allTracks_X_X_X&quot;. Há uma opção para salvar o filme como um AVI, caso contrário, o formato padrão é como um arquivo Quicktime.mov. </li></ol> 4. plusTipGroupAnalysis Nota: Esta última função é usada para criar grupos de filmes para análise e comparação dos seus parâmetros de trilha MT. <ol><li> Digite &quot;plusTipGroupAnalysis&quot; na janela de comando. Para selecionar manualmente os grupos de comparar, primeiro de-selecionar &quot;grupo Auto de hierarquia&quot;. Em seguida, clique em &quot;Selecionar projetos&quot;. Navegue até o diretório pai contendo todas as pastas roi_Xanalisar. </li><li> Uma tela listSelectGUI aparecerá. Selecione todos os projectos a incluir nos grupos a partir do lado esquerdo da tela e movê-los para o lado direito da tela. Clique em &quot;OK&quot;. Escolha um local para salvar a lista de projeto e clique em &quot;Salvar&quot;. </li><li> Uma janela irá aparecer: &quot;Por favor, selecione primeiro grupo da lista&quot;. Clique em &quot;OK&quot;. A janela listSelectGUI irá exibir novamente. Desta vez, selecione apenas os arquivos que correspondem ao primeiro grupo que devem ser reunidos. Clique em &quot;OK&quot;. </li><li> Em seguida, digite o nome do grupo e clique em &quot;OK&quot;. Uma janela irá aparecer: &quot;Selecione um outro grupo?&quot; Resposta de acordo e continuar selecionando grupos. Uma janela irá aparecer: &quot;Selecione um local para salvar a sua lista de grupos&quot;. Navegue até o local e clique em &quot;Salvar&quot;. </li><li> Clique em &quot;Escolher saída&quot; para escolher o local onde as pastas de saída seráarmazenado. </li><li> Selecione o tipo de análise de grupo para conduzir - se as faixas de MT devem ser combinadas para cada grupo ou por análise de células deve ser realizada. Os testes estatísticos recomendados já são designados. Para incluir todas as faixas na análise, de-selecione &quot;Remover faixas no início / fim do filme&quot;. Caso contrário, ter esta caixa selecionada remove quaisquer faixas de crescimento MT que estão em processo de como o filme começa ou termina. </li><li> Após a seleção Grupo de Análise é feita, selecione &quot;Compare grupos&quot;. </li></ol>

<ol><li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+%28end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).</li>
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<li>Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+between+XMAP215+and+EB1+increases+microtubule+growth+rates+to+physiological+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels.</a> Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).</li>
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</ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

PlusTipTracker fornece uma interface gráfica de usuário simples para detectar de forma rápida e automaticamente cometas EB1-GFP praticamente todos visíveis em um cone ou crescimento celular, ligar os cometas em faixas, e calcular os parâmetros MT. Outras publicações relataram o desenho de tipos similares de software (por exemplo, Marx et al. Análise quantitativa utilizou também da dinâmica EB1 marcados em cones de crescimento 18). Mas, este software parece ser único em sua facilidade de ac...

O objetivo deste método é a obtenção de informações quantitativas sobre microtúbulos (MT) mais-final rastreamento dinâmica em cones de crescimento vivendo proteína (+ TIP). MT + dicas são um grupo de proteínas que localizam as mais-ends de MTs 9,10. Eles executam uma série de funções para regular os parâmetros de MT instabilidade dinâmica 11, incluindo taxa de polimerização, catástrofe, e de resgate. Um método bem utilizado para analisar dinâmica MT é para controlar o comportamento da EB1 PONTA +, que se liga especificamente a crescimento mais MT-termina 1,12. EB1 é conhecido por recrutar várias outras proteínas para o crescimento de MT plus-termina 13,14, e, recentemente, foi estabelecida como um fator de maturação MT 15, promovendo o crescimento MT e frequência catástrofe 15,16. Muitos estudos de dinâmica de MT em cones de crescimento têm utilizado métodos de mão-de monitoramento para medir as mudanças na dinâmica EB1-GFP ao longo do tempo 1-3, como EB1 localizatipara além de MT-extremidades pode ser utilizado como um marcador para a polimerização de MT. Um dos principais benefícios para a análise cometas EB1-GFP como um proxy para o crescimento MT é que a dinâmica de MT pode ser medida, mesmo em regiões de sobreposição MT significativo. Enquanto o método de cometas EB1-GFP-tracking mão contribuiu positivamente em MT comportamentos 1-3, é demorado e pode ser tendenciosa. Além disso, como o crescimento anormal comportamentos cone são provavelmente o resultado de mudanças de hora em dinâmica do citoesqueleto, analisando apenas um pequeno subconjunto de MTs (geralmente necessário quando a mão-tracking) pode perder informações importantes. Assim, podemos medir parâmetros de dinâmica MT globais usando o pacote de software, plusTipTracker 4, após a aquisição de alta resolução, imagens ao vivo de EB1 com etiquetas em cultura cones de crescimento embrionárias 5. Este software, desenvolvido no Laboratório de Danuser, tem sido usado em vários estudos que caracterizam a dinâmica MT em vários tipos de células 6-8. É um open-source, noser-friendly, pacote baseado em MATLAB, que inclui detecção automática, rastreamento, visualização e análise de filmes de + TIPs fluorescente marcado. Uma longa lista de parâmetros específicos da dinâmica de MT são calculados por este software (ver referência 4 para mais detalhes), mas para a análise da dinâmica de MT em cones de crescimento, os parâmetros mais úteis são MT velocidade pista crescimento (em microns / minuto), a trilha de crescimento vida (em segundos) e duração da faixa de crescimento (em microns). O software pode ser baixado diretamente do site da Danuser Lab (em &quot;Software&quot;). Enquanto o Lab Danuser atualmente suporta uma interface mais recente para + análise de rastreamento TIP, que está incorporado em um pacote de software chamado u-track 2.0, o software original, autônomo continuará disponível. Os algoritmos subjacentes entre os dois programas são os mesmos (pelo menos a partir de 2014), com apenas uma diferença de interface e análise de resultados. Para o usuário iniciante com pouca MATLAB e / ou computacional experi análisecia, plusTipTracker tem características mais user-friendly, incluindo saídas automatizadas de parâmetros estatísticos. Aqui, descrevemos os passos para a análise de imagens da dinâmica EB1-GFP em cultura cones de crescimento Xenopus laevis. Este protocolo foi utilizado em um artigo recente que examina MT dinâmica 17. Veja também Lowery et al. 2.012 5 para instruções detalhadas sobre cones de crescimento cultura expressando EB1-GFP. Embora este artigo focado principalmente na análise dinâmica EB1-GFP em cones de crescimento, o mesmo protocolo pode ser utilizado para outros tipos de células 17. Para todos os tipos de células, o intervalo de tempo entre os quadros deverão ser entre 0,5-2 seg para o rastreamento + TIP óptima. Um intervalo de tempo de até 4 segundos entre os quadros é possível, mas este aumento do tempo de intervalo resulta em erros de rastreio adicionais.

<table><tbody><tr><td>plusTipTracker software</td><td>Danuser Lab</td><td>&lt;a href=&quot;http://lccb.hms.harvard.edu/software.html&quot;&gt;http://lccb.hms.harvard.edu/software.html&lt;/a&gt;</td><td>This software may be hosted by another website in the future.&amp;nbsp; If the listed site does not exist, search &quot;Danuser Lab Software&quot; on a web search engine to find the site.</td></tr><tr><td>MATLAB software</td><td>Mathworks</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mathworks.com/products/matlab/&quot;&gt;http://www.mathworks.com/products/matlab/&lt;/a&gt;</td><td></td></tr></tbody></table>

using plustiptracker software to measure microtubule dynamics in xenopus laevis growth cones

Microtúbulos (MT), além de rastreamento de-finais proteínas (+ TIPs) localizar às crescentes mais-extremidades de MTs e regular MT dinâmica 1,2. Uma das dicas mais conhecidos e amplamente utilizados + para analisar a dinâmica de MT é a de Ligação End proteína, EB1, que vincula todos os crescentes MT plus-fins, e, portanto, é um marcador de MT polimerização 1. Muitos estudos de comportamento EB1 dentro cones de crescimento usaram demorado e assistidas por computador, métodos de mão-de rastreamento tendenciosas para analisar indivíduo MTs 1-3. Nossa abordagem é quantificar os parâmetros globais da dinâmica MT utilizando o pacote de software, plusTipTracker 4, após a aquisição de alta resolução, imagens ao vivo de EB1 com etiquetas em cultura cones de crescimento embrionárias 5. Este software é um open-source, o pacote user-friendly baseada em MATLAB que combina detecção automática, rastreamento, visualização e análise de filmes de + TIPs fluorescente marcado. Aqui, apresentamos o protocolo para o uso plusTipTracker para a análise dos cometas PONTA + fluorescente marcado na cultura cones de crescimento Xenopus laevis. No entanto, este software também pode ser utilizado para caracterizar a dinâmica MT em vários tipos de células 6-8.

Usando este software, conforme descrito aqui irá fornecer vários arquivos de informações que quantificam + dinâmica TIP em células vivas. Os plusTipGetTracks função identifica as faixas (usando as configurações de exemplo mostrado na Figura 1) e, em seguida, fornece parâmetros para as faixas PONTA +. Para visualizar a informação de que o software tenha obtido, vá para o diretório roi_X que foi criado no passo 2.2. A pasta &quot;façanha&quot; contém &quot;ove...

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Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

A, pacote de código aberto baseado em software MATLAB, plusTipTracker, pode ser usado para análise de séries de imagem + TIPs marcados com fluorescência para quantificar dinâmica dos microtúbulos.

Usando plusTipTracker software para medir Microtubule Dynamics em<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Cones de Crescimento

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

using-plustiptracker-software-to-measure-microtubule-dynamics-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

10.3K visualizações.  Boston College.  A, pacote de código aberto baseado em software MATLAB, plusTipTracker, pode ser usado para análise de séries de imagem + TIPs marcados com fluorescência para quantificar dinâmica dos microtúbulos. 

Vídeo: Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and networks often contain subsets of microtubule arrays that differ in their dynamic properties. For example, in dividing cells, stable bundles of crosslinked microtubules coexist in close proximity to dynamic non-crosslinked microtubules. TIRF-microscopy-based in vitro reconstitution studies enable the simultaneous visualization of the dynamics of these different microtubule arrays. In this assay, an imaging chamber is assembled with surface-immobilized microtubules, which are either present as single filaments or organized into crosslinked&#160;bundles. Introduction of tubulin, nucleotides, and protein regulators allows direct visualization of associated proteins and of dynamic properties of single and crosslinked microtubules. Furthermore, changes that occur as dynamic single microtubules organize into bundles can be monitored in real-time. The method described here allows for a systematic evaluation of the activity and localization of individual proteins, as well as synergistic effects of protein regulators on two different microtubule subsets under identical experimental conditions, thereby providing mechanistic insights that are inaccessible by other methods.

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Here, a TIRF microscopy-based in vitro reconstitution assay is presented to simultaneously quantify and compare the dynamics of two microtubule populations. A method is described to simultaneously view the collective activity of multiple microtubule-associated proteins on crosslinked microtubule bundles and single microtubules.

Visualização Simultânea da Dinâmica dos Microtúbulos Cruzados e Únicos In Vitro pela Microscopia TIRF

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Bioquímica

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopy has a high signal-to-background ratio, but it suffers from photobleaching and photodamage of the fluorescent proteins. Label-free techniques such as interference reflection microscopy (IRM) and interferometric scattering microscopy (iSCAT) circumvent the problem of photobleaching but cannot readily visualize single molecules. This paper presents a protocol for combining IRM with a commercial TIRF microscope for the simultaneous imaging of microtubule-associated proteins (MAPs) and dynamic microtubules in vitro. This protocol allows for high-speed observation of MAPs interacting with dynamic microtubules. This improves on existing two-color TIRF setups by eliminating both the need for microtubule labeling and the need for several additional optical components, such as a second excitation laser. Both channels are imaged on the same camera chip to avoid image registration and frame synchronization problems. This setup is demonstrated by visualizing single kinesin molecules walking on dynamic microtubules.

We present a protocol for implementing interference-reflection microscopy and total-internal-reflection-fluorescence microscopy for the simultaneous imaging of dynamic microtubules and fluorescently labeled microtubule-associated proteins.

Reflexão de Interferência Simultânea e Microscopia de Fluorescência De Reflexão Interna Total para Microtúbulos Dinâmicos de Imagem e Proteínas Associadas

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the dynamic properties of the cytoskeleton. This protocol offers a technique for human primary fibroblast transfection, which can be difficult because of the specifics of primary cell cultivation conditions. Additionally, cytoskeleton dynamic property maintenance requires a low level of transfection to obtain a good signal-to-noise ratio without causing microtubule stabilization. It is important to take measures to protect the cells from light-induced stress and fluorescent dye fading. In the course of our work, we tested different transfection methods and protocols as well as different vectors to select the best combination of conditions suitable for human primary fibroblast studies. We analyzed the resulting time-lapse videos and calculated microtubule dynamics using ImageJ. The dynamics of microtubules' plus-ends in the different cell parts are not similar, so we divided the analysis into subgroups - the centrosome region, the lamella, and the tail of fibroblasts. Notably, this protocol can be used for in vitro analysis of cytoskeleton dynamics in patient samples, enabling the next step towards understanding the dynamics of the various disease development.

This protocol is dedicated to the microtubule plus-end visualization by EB3 protein transfection to study their dynamic properties in primary cell culture. The protocol was implemented on human primary skin fibroblasts obtained from Huntington's disease patients.

Visualização da dinâmica plus-end de microtúbulo no modelo de doença de Huntington baseado em fibroblastos de pele primárias humanas

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the ...

Bioengenharia

3D Particle Tracking for Noninvasive In Vivo Analysis of Synaptic Microtubule Dynamics in Dendrites and Neuromuscular Junctions of Drosophila

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. Furthermore, despite progress in understanding postsynaptic MTs, much less is known about the contributions of presynaptic MTs to neuronal morphogenesis. In particular, studies of in vivo MT dynamics in Drosophila sensory dendrites yielded significant insights into polymer-level behavior. However, the technical and analytical challenges associated with live imaging of the fly neuromuscular junction (NMJ) have limited comparable studies of presynaptic MT dynamics. Moreover, while there are many highly effective software strategies for automated analysis of MT dynamics in vitro and ex vivo, in vivo data often necessitate significant operator input or entirely manual analysis due to inherently inferior signal-to-noise ratio in images and complex cellular morphology. &#160;To address this, this study optimized a new software platform for automated and unbiased in vivo particle detection. Multiparametric analysis of live time-lapse confocal images of EB1-GFP labeled MTs was performed in both dendrites and the NMJ of Drosophila larvae and found striking differences in MT behaviors. MT dynamics were furthermore analyzed following knockdown of the MT-associated protein (MAP) dTACC, a key regulator of Drosophila synapse development, and identified statistically significant changes in MT dynamics compared to wild type. These results demonstrate that this novel strategy for the automated multiparametric analysis of both pre- and postsynaptic MT dynamics at the polymer-level significantly reduces human-in-the-loop criteria. The study furthermore shows the utility of this method in detecting distinct MT behaviors upon dTACC-knockdown, indicating a possible future application for functional screens of factors that regulate MT dynamics in vivo. Future applications of this method may also focus on elucidating cell type and/or compartment-specific MT behaviors, and multicolor correlative imaging of EB1-GFP with other cellular and subcellular markers of interest.&#160;

<meta charset="utf8"></head><body>Rastreamento de partículas 3D para análise in vivo não invasiva da dinâmica dos microtúbulos sinápticos em dendritos e junções neuromusculares de Drosophila

This study presents a noninvasive intravital neuronal imaging strategy combined with a new software strategy to achieve automated, unbiased tracking and analysis of in vivo microtubule (MT) plus-end dynamics in the sensory dendrites and the neuromuscular junctions of Drosophila.

Rastreamento de partículas 3D para análise in vivo não invasiva da dinâmica dos microtúbulos sinápticos em dendritos e junções neuromusculares de Drosophila

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. ...

Neurociência

Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are thought to play a vital role in the microtubule-dependent chromosome motions during cell division, but the relevant proteins and their exact roles are ill-defined. Thus, there is a growing need to develop assays with which to study such motility in vitro using purified components and defined biochemical milieu. Microtubules, however, are inherently unstable polymers; their switching between growth and shortening is stochastic and difficult to control. The protocols we describe here take advantage of the segmented microtubules that are made with the photoablatable stabilizing caps. Depolymerization of such segmented microtubules can be triggered with high temporal and spatial resolution, thereby assisting studies of motility at the disassembling microtubule ends. This technique can be used to carry out a quantitative analysis of the number of molecules in the fluorescently-labeled protein complexes, which move processively with dynamic microtubule ends. To optimize a signal-to-noise ratio in this and other quantitative fluorescent assays, coverslips should be treated to reduce nonspecific absorption of soluble fluorescently-labeled proteins. Detailed protocols are provided to take into account the unevenness of fluorescent illumination, and determine the intensity of a single fluorophore using equidistant Gaussian fit. Finally, we describe the use of segmented microtubules to study microtubule-dependent motions of the protein-coated microbeads, providing insights into the ability of different motor and nonmotor proteins to couple microtubule depolymerization to processive cargo motion.

Microtubules are inherently unstable polymers, and their switching between growth and shortening is stochastic and difficult to control. Here we describe protocols using segmented microtubules with photoablatable stabilizing caps. Depolymerization of segmented microtubules can be triggered with high temporal and spatial resolution, thereby assisting analysis of motions with the disassembling microtubule ends.

Preparação de Segmentadas Microtubules para estudar Moções impulsionado pela desmontagem de microtúbulos Termina

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are ...

Biologia

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes depend on the advances of growth cones that located at the tips of neurites. Axonal growth cones generate driving forces by sensing their local microenvironment and modulating cytoskeletal dynamics and actin-adhesion coupling (clutch coupling). Decades of research have led to the identification of guidance molecules, their receptors, and downstream signaling cascades for regulating neuronal migration and axonal guidance; however, the molecular machineries required for generating forces to drive growth cone advance and navigation are just beginning to be elucidated. At the leading edge of neuronal growth cones, actin filaments undergo retrograde flow, which is powered by actin polymerization and actomyosin contraction. A clutch coupling between F-actin retrograde flow and adhesive substrate generates traction forces for growth cone advance. The present study describes a detailed protocol for monitoring F-actin retrograde flow by single speckle imaging. Importantly, when combined with an F-actin marker Lifeact, this technique can quantify 1) the F-actin polymerization rate and 2) the clutch coupling efficiency between F-actin retrograde flow and the adhesive substrate. Both are critical variables for generating forces for growth cone advance and navigation. In addition, the present study describes a detailed protocol of traction force microscopy, which can quantify 3) traction force generated by growth cones. Thus, by coupling the analyses of&#160;single speckle imaging and traction force microscopy, investigators can monitor the molecular mechanics underlying growth cone advance and navigation.

To advance, growth cones must exert traction forces against the external environment. The generation of traction forces is dependent on actin dynamics and clutch coupling. The present study describes methods for analyzing actin dynamics, clutch coupling and traction forces for growth cone advance.

Análises da Actin Dynamics, Clutch Coupling e Força de Tração para o Avanço do Cone de Crescimento

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Imagens de alta resolução e Análise de individuais Astral microtúbulos Dynamics em brotamento Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Uma interface de usuário gráfica para rastreamento assistido por software da concentração de proteínas em protrusões celulares dinâmicas

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Usando plusTipTracker software para medir Microtubule Dynamics em

Resumo

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Visualização Simultânea da Dinâmica dos Microtúbulos Cruzados e Únicos In Vitro pela Microscopia TIRF

Reflexão de Interferência Simultânea e Microscopia de Fluorescência De Reflexão Interna Total para Microtúbulos Dinâmicos de Imagem e Proteínas Associadas

Visualização da dinâmica plus-end de microtúbulo no modelo de doença de Huntington baseado em fibroblastos de pele primárias humanas

Rastreamento de partículas 3D para análise in vivo não invasiva da dinâmica dos microtúbulos sinápticos em dendritos e junções neuromusculares de Drosophila

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Preparação de Segmentadas Microtubules para estudar Moções impulsionado pela desmontagem de microtúbulos Termina

Análises da Actin Dynamics, Clutch Coupling e Força de Tração para o Avanço do Cone de Crescimento

De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

Imagens de alta resolução e Análise de individuais Astral microtúbulos Dynamics em brotamento Yeast

Uma interface de usuário gráfica para rastreamento assistido por software da concentração de proteínas em protrusões celulares dinâmicas