Name: using plustiptracker software to measure microtubule dynamics in xenopus laevis growth cones
Uploaded: 2014-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones at JoVE.com

We thank Dr. Gaudenz Danuser and members of his lab for creating the plusTipTracker software and for helpful discussion regarding using the software, in particular Maria Bagonis and Sebastien Besson. We especially thank the Boston College Media Center for their assistance and support in the creation and editing of the video. We also thank members of the Lowery Lab for useful discussions and constructive criticism, and Abigail Antoine for proof-reading the manuscript. This work was funded by an NIH R00 MH095768 award to LAL.

Este protocolo e vídeo são destinados a servir como um companheiro para o artigo original que descreve o pacote de software mais detalhadamente 4, bem como o Relatório Técnico que acompanha o download do software no site da Danuser Lab. Os leitores são encorajados a rever estes documentos cuidadosamente se há mais perguntas sobre a utilização do software. 1 Antes de Análise de Imagem <ol><li> Converta cada filme de lapso de tempo em uma seqüência de TIFF (Tagged Image File Format) arquivos de imagem. Se houver vários cones de crescimento / células em um determinado filme, a primeira colheita de cada cone de crescimento / célula para criar a sua própria sequência de imagens. Nota: Isso não é necessário, como regiões de interesse individuais (ROI) pode ser selecionado dentro plusTipTracker. No entanto, utilizando-se as dimensões da imagem menores aumenta a velocidade de processamento computacional, de modo que este passo é recomendável, se houver espaço vazio significativo na imagem. </li><li> Salve cada série TIFF em seu própriopasta chamada &quot;imagens&quot; dentro de um caminho que MATLAB é definido para o acesso (note que &quot;imagens&quot; é sensível a maiúsculas). Para adicionar um novo caminho, navegue até o diretório do arquivo relevante na janela &quot;pasta atual&quot;, clique com o botão direito sobre o ícone do diretório, e selecione &quot;Adicionar ao trajeto - pastas selecionadas e Sub-pastas&quot;. É importante que a pasta do software plusTipTracker ser adicionado ao caminho, como bem. </li></ol> 2. plusTipGetTracks Nota: O primeiro passo na análise de imagens é detectar os cometas EB1-GFP, vincular os cometas em faixas, e determinar os parâmetros da dinâmica dos microtúbulos. Isto é obtido com o comando &quot;plusTipGetTracks&quot; 4. <ol><li> Para começar a análise, aplicação MATLAB aberta e digite &quot;plusTipGetTracks&quot; na janela de comando. Isso fará com que uma nova caixa de diálogo aparecer. </li><li> Clique em &quot;Definir novos projetos&quot; e selecione um (ou more) do TIFF imagem série anterior, selecionando as &quot;imagens&quot; apropriadas pasta (ou pastas que contenham &quot;imagens&quot; pastas). Após a conclusão desta etapa, um diretório de arquivos (roi_1) será criada (na mesma pasta que contém &quot;imagens&quot;) que irá conter os arquivos de dados futuros. Nota: o passo &quot;Configurar Novos Projetos&quot; pode ser concluída antes do tempo, durante uma sessão separada. </li><li> Uma nova janela será exibida: &quot;Selecione um polígono, clique com o botão direito no último ponto, e clique em&quot; Criar máscara &#39;&quot;. Clique em &quot;OK&quot;. A primeira imagem da série imagem selecionada será exibida. Use o mouse para clicar e criar um polígono que abrange a totalidade do cone de crescimento. Dê um duplo clique com o mouse para fechar o polígono. </li><li> Uma vez que o polígono foi fechado, uma caixa de diálogo será exibida: &quot;Você quer selecionar outro ROI?&quot; Se a imagem tem um outro cone de crescimento para analisar, selecione &quot;Sim&quot;; caso contrário, éeleitos &quot;Não&quot;. </li><li> Selecione os projetos que serão imediatamente analisados. Clique em &quot;Selecionar Projetos&quot; e selecione a pasta (roi_X) analisar. </li><li> Uma tela listSelectGUI aparecerá. Selecione o projeto (s) a partir do lado esquerdo da tela e movê-los para o lado direito da tela. Clique em &quot;OK&quot;. Escolha um local para salvar a lista de projeto e clique em &quot;Salvar&quot;. </li><li> Selecione &quot;Detection&quot;, &quot;Rastreio&quot;, e &quot;Pós-Processamento&quot;. Uma vez que essas seleções foram feitas, o lado direito da caixa de diálogo vai se tornar configurável. Configure cada opção. <ol><li> Estes parâmetros são usados ​​para ligar os cometas detectados em faixas MT. Detalhes para a escolha desses parâmetros de controle para monitoramento são incluídos em páginas 9-10 do Relatório Técnico PDF que acompanha o download do pacote de software; Leia o relatório cuidadosamente se forem encontrados problemas. Para efeitos de acompanhamento de cometas EB1-GFP em Xenoplaevis nos cones de crescimento, use as seguintes configurações de Rastreamento: Pesquisar Raio Gama (pixels) 5-12, mínima Sub-Track Comprimento (frames) 3; Max Gap Comprimento (quadros) 8; Max Fator Encolhimento 0,8, ângulo de Max Atacante 50, ângulo de Max para trás 10, Flutuação Radius 2.5. Estas configurações são mostradas na Figura 1. </li></ol> Nota: Max Fator Encolhimento é ajustado para reduzir o número de &quot;atrasados&quot; lacunas detectadas, como &quot;lacunas para trás&quot; não são úteis para analisar no contexto dos cones de crescimento, dadas as condições de superlotação e erros prováveis ​​em ligações de pista. Além disso, tanto ângulo Max Atacante, bem como Flutuação Radius são definidas relativamente alto, como MTs cone de crescimento apresentam pequenas translocações freqüentes, além de crescimentos e retrações, e aumentando a essas configurações de controle permite a este aumento de movimento durante a etapa de ligação. <ol><li> Preencha os pós-processamento configurações, dependendo das configurações específicas de aquisição de imagem desejados. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Uma vez que as configurações tenham sido configuradas, clique em &quot;Iniciar&quot;. O software será executado conforme as configurações foram selecionados. Isso pode levar minutos ou horas, dependendo do número de projetos selecionados e seus tamanhos. A janela de comando exibe o tempo restante estimado para cada função. Quando a etapa plusTipGetTracks estiver concluída, a janela de comando exibirá &quot;Concluído!&quot; Nota: Uma longa lista de parâmetros específicos da dinâmica MT agora foram calculados por este software (ver referência 4 para mais detalhes), mas para a análise da dinâmica de MT em cones de crescimento, os parâmetros mais úteis a serem examinados são MT velocidade pista crescimento (em microns / minuto), tempo de vida pista crescimento (em segundos) e duração da faixa de crescimento (em microns). </li></ol> 3. plusTipSeeTracks Nota: Agora que as faixas de microtúbulos têm sido definidos, a função &quot;plustipSeeTracks&quot; é utilizado para o controle de visualização 4. Esta funçãopode fornecer várias saídas para visualização, incluindo a dinâmica MT espaciais mapas e filmes de velocidade, mas aqui, o foco é apenas sobre o uso de &quot;Filmes faixa&quot; para exibir faixas MT sobrepostas nas imagens cone de crescimento. Enquanto plusTipGetTracks pode analisar vários filmes de uma vez, plusTipSeeTracks só pode analisar um filme de cada vez. <ol><li> Digite &quot;plusTipSeeTracks&quot; na janela de comando. </li><li> Após o carregamento da caixa de diálogo, clique em &quot;Select Project&quot;. Selecione o diretório pai que contém o projeto de visualizar e clique em &quot;Selecionar Pasta&quot;. Uma nova janela será exibida: &quot;Selecione o projeto que deseja visualizar&quot;. Escolha o arquivo para visualizar e clique em &quot;OK&quot;. </li><li> Em seguida, clique em &quot;Select ROI Saved&quot;. Navegue para a mesma pasta roi_X que o selecionado na etapa anterior e selecione o arquivo com o nome &quot;roiYX&quot;. </li><li> Clique em &quot;Selecionar Output Directory&quot; para designar waqui MATLAB irá salvar os arquivos de visualização de pista. Nota: Recomenda-se utilizar a mesma pasta que contém o resto dos dados. </li><li> Selecione &quot;Make Movie Track&quot; e aparecerá uma tela mostrando todas as faixas plusTipGetTracks calculadas a partir dos cometas PONTA +. Esta etapa salva a série temporal rastreado em um formato de filme, no arquivo &quot;allTracks_X_X_X&quot;. Há uma opção para salvar o filme como um AVI, caso contrário, o formato padrão é como um arquivo Quicktime.mov. </li></ol> 4. plusTipGroupAnalysis Nota: Esta última função é usada para criar grupos de filmes para análise e comparação dos seus parâmetros de trilha MT. <ol><li> Digite &quot;plusTipGroupAnalysis&quot; na janela de comando. Para selecionar manualmente os grupos de comparar, primeiro de-selecionar &quot;grupo Auto de hierarquia&quot;. Em seguida, clique em &quot;Selecionar projetos&quot;. Navegue até o diretório pai contendo todas as pastas roi_Xanalisar. </li><li> Uma tela listSelectGUI aparecerá. Selecione todos os projectos a incluir nos grupos a partir do lado esquerdo da tela e movê-los para o lado direito da tela. Clique em &quot;OK&quot;. Escolha um local para salvar a lista de projeto e clique em &quot;Salvar&quot;. </li><li> Uma janela irá aparecer: &quot;Por favor, selecione primeiro grupo da lista&quot;. Clique em &quot;OK&quot;. A janela listSelectGUI irá exibir novamente. Desta vez, selecione apenas os arquivos que correspondem ao primeiro grupo que devem ser reunidos. Clique em &quot;OK&quot;. </li><li> Em seguida, digite o nome do grupo e clique em &quot;OK&quot;. Uma janela irá aparecer: &quot;Selecione um outro grupo?&quot; Resposta de acordo e continuar selecionando grupos. Uma janela irá aparecer: &quot;Selecione um local para salvar a sua lista de grupos&quot;. Navegue até o local e clique em &quot;Salvar&quot;. </li><li> Clique em &quot;Escolher saída&quot; para escolher o local onde as pastas de saída seráarmazenado. </li><li> Selecione o tipo de análise de grupo para conduzir - se as faixas de MT devem ser combinadas para cada grupo ou por análise de células deve ser realizada. Os testes estatísticos recomendados já são designados. Para incluir todas as faixas na análise, de-selecione &quot;Remover faixas no início / fim do filme&quot;. Caso contrário, ter esta caixa selecionada remove quaisquer faixas de crescimento MT que estão em processo de como o filme começa ou termina. </li><li> Após a seleção Grupo de Análise é feita, selecione &quot;Compare grupos&quot;. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

PlusTipTracker fornece uma interface gráfica de usuário simples para detectar de forma rápida e automaticamente cometas EB1-GFP praticamente todos visíveis em um cone ou crescimento celular, ligar os cometas em faixas, e calcular os parâmetros MT. Outras publicações relataram o desenho de tipos similares de software (por exemplo, Marx et al. Análise quantitativa utilizou também da dinâmica EB1 marcados em cones de crescimento 18). Mas, este software parece ser único em sua facilidade de acesso, uma vez que pode ser baixado gratuitamente a partir do site do Laboratório de Danuser, que é especializada na concepção de código aberto, turn-key software útil para a comunidade biológica celular. Embora o acesso ao MATLAB é necessária, a pessoa não precisa estar totalmente familiarizados com o programa de computador para utilizar o software. No entanto, existem alguns pontos que precisam ser abordadas para facilidade de uso. Primeiro de tudo, um dos problemas mais comuns que surgem quando se usa o software e aplicação informática para o primeiro tempo é relacionada com o caminho de arquivo. Se este erro ocorrer (com o aviso de &quot;Erro usando cd -. Argumento deve conter uma seqüência de erros em formatPath ...&quot;), então a solução mais fácil é para garantir que o software plusTipTracker, bem como o diretório com todas as &quot;imagens&quot; subdiretórios, são ambos da mesma &quot;MATLAB&quot; caminho do arquivo. É melhor se estes não estão no diretório &quot;Arquivos de Programas&quot;, como tem sido sugerido que o espaço no nome &quot;Arquivos de Programas&quot; pode ser um problema. Relacionado a isso, é importante notar que plusTipTracker salva o caminho do arquivo que foi utilizado quando o primeiro calcular a análise plusTipGetTracks e, como tal, este caminho do arquivo deve ser mantida quando esses dados são acessados ​​e utilizados por outro componente do software. As funções plusTipGetTracks, plusTipSeeTracks e plusTipGroupAnalysis todos usam o caminho do arquivo salvo original e, portanto, tentando ctodas essas funções para um determinado filme, depois de mover os arquivos para outro caminho, irá resultar em um erro. Outro erro comum que ocorra durante a análise é quando Rastreamento falhar durante a etapa plusTipGetTracks. Isso ocorrerá se um quadro na série de imagens não contém cometas detectáveis. Isto irá parar completamente a análise e não de pós-processamento irá ocorrer. Uma solução simples para contornar este problema e permitir a análise a seguir, é a criação de um cometa simulada na imagem em uma área onde ele não será incorretamente ligada a quaisquer pistas reais. Isto não terá impacto sobre os parâmetros da faixa finais, como qualquer cometa que não existe em uma quantidade mínima de estruturas consecutivas irá ser filtrados da análise final. Um outro problema que pode surgir é a detecção de cometa com defeito. Isso geralmente pode ser corrigido através da melhoria da selecção região de interesse na etapa 2.3. É importante chamar a região de interesse de perto ao redor da célula e não chamar a awregião IDER do que o necessário. O software usa essa área para determinar o plano de fundo usado durante a detecção de cometa. Se a detecção de cometa ainda é sub-óptima com as configurações padrão, as configurações podem ser ajustadas na janela plusTipGetTracks (durante o passo 2.7). Depois de uma análise, é fundamental para validar as ligações trilha automatizadas por olho, usando plusTipSeeTracks. Configurações de rastreamento podem precisar ser modificados para reduzir o número de falsos vínculos positivos ou falsos negativos cometa. Consulte a documentação plusTipTracker 4 original, bem como o Relatório Técnico PDF que acompanha o download do software para obter mais informações sobre como otimizar as configurações. O desempenho deste software em relação a mão-de monitoramento foi previamente testado em células não-neuronais 4. Os cones de crescimento constitui um desafio ligeiramente diferente, no entanto, como o crescimento de cone MT exibem translocações frequentes em todas as direcções 17, em adição ao crescimento MT e encolhimento. Uma issue que não foi encontrado para ser uma grande preocupação é se as MTs hermeticamente embalados em cones de crescimento apresentam dificuldades de rastreamento 17. Como apenas um subconjunto de MTs estão em fase de crescimento, com EB1-GFP nas extremidades, resolver e acompanhar cometas EB1-GFP individuais não era problemático. No entanto, deve notar-se que estes estudos anteriores utilizados Xenopus laevis cones de crescimento, os quais foram especificamente escolhidas devido ao seu tamanho relativamente grande do cone de crescimento (cerca de 10 micrómetros), em comparação com outros cones de crescimento de vertebrados. Usando esses cones de crescimento maiores permite a análise cometa EB1-GFP mais precisa. Para avaliar a utilidade e precisão deste software para a análise de faixas EB1-GFP em Xenopus laevis cones de crescimento, comparou a experiência de usar plusTipTracker com mão-de rastreamento de uma série de dados idênticos (dados não mostrados). O tempo que levou para a mão-de pista cometas EB1-GFP em um cone de crescimento médio de 39 faixas de cometas (em 1 minuto seri time-lapsees, com 2 segundos entre cada quadro) foi mais de duas horas, em relação a dois minutos, com o software. Os parâmetros obtidos com os dois métodos foram semelhantes para velocidade de crescimento MT (7.4 microns por minuto para automático de controle contra 7,0 microns por minuto para mão-tracking). No entanto, para a vida de crescimento e comprimento, análise de software leva às pistas significativamente mais curtos (por cerca de metade do tempo e distância). Isto é devido ao crescimento faixas sendo dividido pelo software se um cometa entra e sai de foco ao longo do tempo. Enquanto o olho humano pode identificar facilmente que é o mesmo cometa, o software não faz. Esta questão não é problemática, porém, se a pessoa está usando o software, a fim de comparar várias condições. Uma vez que os parâmetros de rastreamento idênticos são usados ​​para todas as condições (e partindo do princípio de que os cometas entrar e sair do foco com a mesma taxa em várias condições), então os tempos de vida relativos e comprimentos são ainda bastante úteis para medições de comparação. Como para análise automatizada de erro de ratoes, estes dependem muito da qualidade das imagens. Em altas filmes sinal-ruído, o percentual de faixas misjoined ou incorretas é de um dígito. Mesmo em filmes de baixa qualidade (onde cometas individuais ainda são claramente visíveis a olho nu, mas o ruído de fundo for maior), as taxas de erro ainda são baixos o suficiente (5-15%) que o tempo significativo salvo usando o software vale a pena o custos em erro. Este é especialmente o caso quando da análise de centenas de cones de crescimento (60-8 cones de crescimento por estado foram analisadas em um estudo anterior 17). É importante notar que este programa foi concebido para detectar + cometas TIP que apenas se ligam ao crescimento extremidades MT, tal como EB1-GFP. Tendo em conta que a articulação e acompanhamento algoritmos esperar que os cometas só existem em polimerização de MTs, usando este software para analisar a dinâmica de um + TIP marcadas com fluorescência que se liga ao encolhimento MT termina além de extremidades em crescimento levará a informações incorretassobre as velocidades de crescimento MT calculados. Uma das características únicas deste software em relação a outros softwares de partícula-tracking único, é que ele leva em conta conhecido comportamentos MT para calcular não apenas parâmetros de polimerização, mas também parâmetros de contração. Ele faz isso através da ligação de um cometa EB1-GFP que desapareceu com um que tenha recém-formado logo atrás na mesma trajetória (isso é chamado de backgap ou faixa bgap). Embora este algoritmo funciona bem para alguns tipos de células, tais como células HeLa 4, que é uma característica menos eficaz quando se analisa dinâmica MT em cones de crescimento. Isto porque MT faixas freqüentemente seguem um ao outro ao longo das mesmas localizações exactas em cones de crescimento (muitas vezes seguintes, juntamente feixes F-actina), e por isso geralmente é impossível dizer se bgap ligações estão corretas. Por esta razão, não é recomendado utilizar as saídas de dados bgap em cones de crescimento. Apesar dessas ressalvas menores e questõesque deve ser levado em consideração quando se utiliza plusTipTracker (e mais qualquer programa de tratamento automático de imagens), este software pode ser uma ferramenta muito útil para a análise de milhares de cometas EB1-GFP em um período relativamente curto de tempo.

O objetivo deste método é a obtenção de informações quantitativas sobre microtúbulos (MT) mais-final rastreamento dinâmica em cones de crescimento vivendo proteína (+ TIP). MT + dicas são um grupo de proteínas que localizam as mais-ends de MTs 9,10. Eles executam uma série de funções para regular os parâmetros de MT instabilidade dinâmica 11, incluindo taxa de polimerização, catástrofe, e de resgate. Um método bem utilizado para analisar dinâmica MT é para controlar o comportamento da EB1 PONTA +, que se liga especificamente a crescimento mais MT-termina 1,12. EB1 é conhecido por recrutar várias outras proteínas para o crescimento de MT plus-termina 13,14, e, recentemente, foi estabelecida como um fator de maturação MT 15, promovendo o crescimento MT e frequência catástrofe 15,16. Muitos estudos de dinâmica de MT em cones de crescimento têm utilizado métodos de mão-de monitoramento para medir as mudanças na dinâmica EB1-GFP ao longo do tempo 1-3, como EB1 localizatipara além de MT-extremidades pode ser utilizado como um marcador para a polimerização de MT. Um dos principais benefícios para a análise cometas EB1-GFP como um proxy para o crescimento MT é que a dinâmica de MT pode ser medida, mesmo em regiões de sobreposição MT significativo. Enquanto o método de cometas EB1-GFP-tracking mão contribuiu positivamente em MT comportamentos 1-3, é demorado e pode ser tendenciosa. Além disso, como o crescimento anormal comportamentos cone são provavelmente o resultado de mudanças de hora em dinâmica do citoesqueleto, analisando apenas um pequeno subconjunto de MTs (geralmente necessário quando a mão-tracking) pode perder informações importantes. Assim, podemos medir parâmetros de dinâmica MT globais usando o pacote de software, plusTipTracker 4, após a aquisição de alta resolução, imagens ao vivo de EB1 com etiquetas em cultura cones de crescimento embrionárias 5. Este software, desenvolvido no Laboratório de Danuser, tem sido usado em vários estudos que caracterizam a dinâmica MT em vários tipos de células 6-8. É um open-source, noser-friendly, pacote baseado em MATLAB, que inclui detecção automática, rastreamento, visualização e análise de filmes de + TIPs fluorescente marcado. Uma longa lista de parâmetros específicos da dinâmica de MT são calculados por este software (ver referência 4 para mais detalhes), mas para a análise da dinâmica de MT em cones de crescimento, os parâmetros mais úteis são MT velocidade pista crescimento (em microns / minuto), a trilha de crescimento vida (em segundos) e duração da faixa de crescimento (em microns). O software pode ser baixado diretamente do site da Danuser Lab (em &quot;Software&quot;). Enquanto o Lab Danuser atualmente suporta uma interface mais recente para + análise de rastreamento TIP, que está incorporado em um pacote de software chamado u-track 2.0, o software original, autônomo continuará disponível. Os algoritmos subjacentes entre os dois programas são os mesmos (pelo menos a partir de 2014), com apenas uma diferença de interface e análise de resultados. Para o usuário iniciante com pouca MATLAB e / ou computacional experi análisecia, plusTipTracker tem características mais user-friendly, incluindo saídas automatizadas de parâmetros estatísticos. Aqui, descrevemos os passos para a análise de imagens da dinâmica EB1-GFP em cultura cones de crescimento Xenopus laevis. Este protocolo foi utilizado em um artigo recente que examina MT dinâmica 17. Veja também Lowery et al. 2.012 5 para instruções detalhadas sobre cones de crescimento cultura expressando EB1-GFP. Embora este artigo focado principalmente na análise dinâmica EB1-GFP em cones de crescimento, o mesmo protocolo pode ser utilizado para outros tipos de células 17. Para todos os tipos de células, o intervalo de tempo entre os quadros deverão ser entre 0,5-2 seg para o rastreamento + TIP óptima. Um intervalo de tempo de até 4 segundos entre os quadros é possível, mas este aumento do tempo de intervalo resulta em erros de rastreio adicionais.

<table><tbody><tr><td>plusTipTracker software</td><td>Danuser Lab</td><td>&lt;a href=&quot;http://lccb.hms.harvard.edu/software.html&quot;&gt;http://lccb.hms.harvard.edu/software.html&lt;/a&gt;</td><td>This software may be hosted by another website in the future.&amp;nbsp; If the listed site does not exist, search &quot;Danuser Lab Software&quot; on a web search engine to find the site.</td></tr><tr><td>MATLAB software</td><td>Mathworks</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mathworks.com/products/matlab/&quot;&gt;http://www.mathworks.com/products/matlab/&lt;/a&gt;</td><td></td></tr></tbody></table>

using plustiptracker software to measure microtubule dynamics in xenopus laevis growth cones

Microtúbulos (MT), além de rastreamento de-finais proteínas (+ TIPs) localizar às crescentes mais-extremidades de MTs e regular MT dinâmica 1,2. Uma das dicas mais conhecidos e amplamente utilizados + para analisar a dinâmica de MT é a de Ligação End proteína, EB1, que vincula todos os crescentes MT plus-fins, e, portanto, é um marcador de MT polimerização 1. Muitos estudos de comportamento EB1 dentro cones de crescimento usaram demorado e assistidas por computador, métodos de mão-de rastreamento tendenciosas para analisar indivíduo MTs 1-3. Nossa abordagem é quantificar os parâmetros globais da dinâmica MT utilizando o pacote de software, plusTipTracker 4, após a aquisição de alta resolução, imagens ao vivo de EB1 com etiquetas em cultura cones de crescimento embrionárias 5. Este software é um open-source, o pacote user-friendly baseada em MATLAB que combina detecção automática, rastreamento, visualização e análise de filmes de + TIPs fluorescente marcado. Aqui, apresentamos o protocolo para o uso plusTipTracker para a análise dos cometas PONTA + fluorescente marcado na cultura cones de crescimento Xenopus laevis. No entanto, este software também pode ser utilizado para caracterizar a dinâmica MT em vários tipos de células 6-8.

Usando este software, conforme descrito aqui irá fornecer vários arquivos de informações que quantificam + dinâmica TIP em células vivas. Os plusTipGetTracks função identifica as faixas (usando as configurações de exemplo mostrado na Figura 1) e, em seguida, fornece parâmetros para as faixas PONTA +. Para visualizar a informação de que o software tenha obtido, vá para o diretório roi_X que foi criado no passo 2.2. A pasta &quot;façanha&quot; contém &quot;overlayImages&quot;, que é uma série de imagens que mostram os cometas detectados. Examinando essas imagens utilizando o software de análise pode demonstrar a precisão da detecção de cometa. A pasta &quot;meta&quot; também contém informações detalhadas sobre as estatísticas de cometas + TIP, inclusive o arquivo &quot;projData&quot;, bem como o arquivo &quot;Estatísticas&quot;. Para visualizar o arquivo &quot;Estatísticas&quot;, arrastá-lo para uma planilha aberta de um aplicativo de planilha. Este arquivo contém a calculard parâmetros microtúbulos para cada filme (Figura 2). Como mencionado acima, uma longa lista de parâmetros específicos da dinâmica de MT são calculados por este software (ver referência 4 para mais detalhes), incluindo a velocidade de pista crescimento MT (em microns / minuto), tempo de vida pista crescimento (em segundos), eo crescimento duração da faixa (em microns). Os plusTipSeeTracks função salva um filme dos cometas controladas, que podem ser revistas, abrindo o arquivo &quot;allTracks_X_X_X&quot; (Figura 3). O plusTipGroupAnalysis função combina múltiplos conjuntos de dados individuais em grupos e cria pastas (chamado Percell ou pooledData, dependendo da análise é selecionado) que contêm dados de parâmetro do grupo, incluindo histogramas, gráficos e planilhas para comparar grupos e parâmetros individuais dentro de cada grupo (Figura 4). <img alt="Figura 1" fo:content-width = src &quot;6in&quot; = &quot;/ files / ftp_upload / 52138 / 52138fig1highres.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; Figura configurações 1. PlusTipGetTracks utilizados para cometas EB1-GFP em Xenopus laevis cones de crescimento. Esta figura mostra as configurações específicas para &quot;detecção&quot;, &quot;Rastreio&quot;, e &quot;Pós-Processamento&quot; passos que podem ser utilizados para a análise da EB1-GFP cometas em Xenopus laevis cones de crescimento. A ferramenta plusTipParamSweepGUI, disponível no pacote plusTipTracker, podem ser utilizados para otimizar as configurações de rastreamento de outros organismos modelo e / ou tipos de células 7. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52138/52138fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 tela de parâmetros MT obtidos através da análise plusTipGetTracks. A pasta &quot;meta&quot;, criado por plusTipGetTracks execução, contém informações relativas ao TIP + cEstatísticas Omet. Ao arrastar o arquivo &quot;Estatísticas&quot; em um aplicativo de planilha, os parâmetros de dinâmica dos microtúbulos podem ser examinados. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52138/52138fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3 tela de MT filme pista obtida a partir da análise plusTipSeeTracks. PlusTipSeeTracks não só permite a visualização de microtúbulos pista, mas também serve como uma ferramenta de verificação, permitindo que o usuário visualize a validade dos dados obtidos a partir de plusTipGetTracks. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52138/52138fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4 tela de parâmetros obtidos a partir MT plusTipGroupAnalysis. PlusTipGroupAnalysis oferece ao usuário um método simples para a comparação de grupos e parâmetros individuais between dentro de cada grupo, combinando vários conjuntos de dados individual e gerando uma estatística, que pode ser examinado em um aplicativo de planilha.

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Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

A, pacote de código aberto baseado em software MATLAB, plusTipTracker, pode ser usado para análise de séries de imagem + TIPs marcados com fluorescência para quantificar dinâmica dos microtúbulos.

Usando plusTipTracker software para medir Microtubule Dynamics em<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Cones de Crescimento

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

using-plustiptracker-software-to-measure-microtubule-dynamics-xenopus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

10.3K visualizações.  Boston College.  A, pacote de código aberto baseado em software MATLAB, plusTipTracker, pode ser usado para análise de séries de imagem + TIPs marcados com fluorescência para quantificar dinâmica dos microtúbulos. 

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Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and networks often contain subsets of microtubule arrays that differ in their dynamic properties. For example, in dividing cells, stable bundles of crosslinked microtubules coexist in close proximity to dynamic non-crosslinked microtubules. TIRF-microscopy-based in vitro reconstitution studies enable the simultaneous visualization of the dynamics of these different microtubule arrays. In this assay, an imaging chamber is assembled with surface-immobilized microtubules, which are either present as single filaments or organized into crosslinked&#160;bundles. Introduction of tubulin, nucleotides, and protein regulators allows direct visualization of associated proteins and of dynamic properties of single and crosslinked microtubules. Furthermore, changes that occur as dynamic single microtubules organize into bundles can be monitored in real-time. The method described here allows for a systematic evaluation of the activity and localization of individual proteins, as well as synergistic effects of protein regulators on two different microtubule subsets under identical experimental conditions, thereby providing mechanistic insights that are inaccessible by other methods.

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Here, a TIRF microscopy-based in vitro reconstitution assay is presented to simultaneously quantify and compare the dynamics of two microtubule populations. A method is described to simultaneously view the collective activity of multiple microtubule-associated proteins on crosslinked microtubule bundles and single microtubules.

Visualização Simultânea da Dinâmica dos Microtúbulos Cruzados e Únicos In Vitro pela Microscopia TIRF

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Bioquímica

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopy has a high signal-to-background ratio, but it suffers from photobleaching and photodamage of the fluorescent proteins. Label-free techniques such as interference reflection microscopy (IRM) and interferometric scattering microscopy (iSCAT) circumvent the problem of photobleaching but cannot readily visualize single molecules. This paper presents a protocol for combining IRM with a commercial TIRF microscope for the simultaneous imaging of microtubule-associated proteins (MAPs) and dynamic microtubules in vitro. This protocol allows for high-speed observation of MAPs interacting with dynamic microtubules. This improves on existing two-color TIRF setups by eliminating both the need for microtubule labeling and the need for several additional optical components, such as a second excitation laser. Both channels are imaged on the same camera chip to avoid image registration and frame synchronization problems. This setup is demonstrated by visualizing single kinesin molecules walking on dynamic microtubules.

We present a protocol for implementing interference-reflection microscopy and total-internal-reflection-fluorescence microscopy for the simultaneous imaging of dynamic microtubules and fluorescently labeled microtubule-associated proteins.

Reflexão de Interferência Simultânea e Microscopia de Fluorescência De Reflexão Interna Total para Microtúbulos Dinâmicos de Imagem e Proteínas Associadas

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

3D Particle Tracking for Noninvasive In Vivo Analysis of Synaptic Microtubule Dynamics in Dendrites and Neuromuscular Junctions of Drosophila

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. Furthermore, despite progress in understanding postsynaptic MTs, much less is known about the contributions of presynaptic MTs to neuronal morphogenesis. In particular, studies of in vivo MT dynamics in Drosophila sensory dendrites yielded significant insights into polymer-level behavior. However, the technical and analytical challenges associated with live imaging of the fly neuromuscular junction (NMJ) have limited comparable studies of presynaptic MT dynamics. Moreover, while there are many highly effective software strategies for automated analysis of MT dynamics in vitro and ex vivo, in vivo data often necessitate significant operator input or entirely manual analysis due to inherently inferior signal-to-noise ratio in images and complex cellular morphology. &#160;To address this, this study optimized a new software platform for automated and unbiased in vivo particle detection. Multiparametric analysis of live time-lapse confocal images of EB1-GFP labeled MTs was performed in both dendrites and the NMJ of Drosophila larvae and found striking differences in MT behaviors. MT dynamics were furthermore analyzed following knockdown of the MT-associated protein (MAP) dTACC, a key regulator of Drosophila synapse development, and identified statistically significant changes in MT dynamics compared to wild type. These results demonstrate that this novel strategy for the automated multiparametric analysis of both pre- and postsynaptic MT dynamics at the polymer-level significantly reduces human-in-the-loop criteria. The study furthermore shows the utility of this method in detecting distinct MT behaviors upon dTACC-knockdown, indicating a possible future application for functional screens of factors that regulate MT dynamics in vivo. Future applications of this method may also focus on elucidating cell type and/or compartment-specific MT behaviors, and multicolor correlative imaging of EB1-GFP with other cellular and subcellular markers of interest.&#160;

This study presents a noninvasive intravital neuronal imaging strategy combined with a new software strategy to achieve automated, unbiased tracking and analysis of in vivo microtubule (MT) plus-end dynamics in the sensory dendrites and the neuromuscular junctions of Drosophila.

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. ...

Neurociência

Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are thought to play a vital role in the microtubule-dependent chromosome motions during cell division, but the relevant proteins and their exact roles are ill-defined. Thus, there is a growing need to develop assays with which to study such motility in vitro using purified components and defined biochemical milieu. Microtubules, however, are inherently unstable polymers; their switching between growth and shortening is stochastic and difficult to control. The protocols we describe here take advantage of the segmented microtubules that are made with the photoablatable stabilizing caps. Depolymerization of such segmented microtubules can be triggered with high temporal and spatial resolution, thereby assisting studies of motility at the disassembling microtubule ends. This technique can be used to carry out a quantitative analysis of the number of molecules in the fluorescently-labeled protein complexes, which move processively with dynamic microtubule ends. To optimize a signal-to-noise ratio in this and other quantitative fluorescent assays, coverslips should be treated to reduce nonspecific absorption of soluble fluorescently-labeled proteins. Detailed protocols are provided to take into account the unevenness of fluorescent illumination, and determine the intensity of a single fluorophore using equidistant Gaussian fit. Finally, we describe the use of segmented microtubules to study microtubule-dependent motions of the protein-coated microbeads, providing insights into the ability of different motor and nonmotor proteins to couple microtubule depolymerization to processive cargo motion.

Microtubules are inherently unstable polymers, and their switching between growth and shortening is stochastic and difficult to control. Here we describe protocols using segmented microtubules with photoablatable stabilizing caps. Depolymerization of segmented microtubules can be triggered with high temporal and spatial resolution, thereby assisting analysis of motions with the disassembling microtubule ends.

Preparação de Segmentadas Microtubules para estudar Moções impulsionado pela desmontagem de microtúbulos Termina

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are ...

Biologia

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes depend on the advances of growth cones that located at the tips of neurites. Axonal growth cones generate driving forces by sensing their local microenvironment and modulating cytoskeletal dynamics and actin-adhesion coupling (clutch coupling). Decades of research have led to the identification of guidance molecules, their receptors, and downstream signaling cascades for regulating neuronal migration and axonal guidance; however, the molecular machineries required for generating forces to drive growth cone advance and navigation are just beginning to be elucidated. At the leading edge of neuronal growth cones, actin filaments undergo retrograde flow, which is powered by actin polymerization and actomyosin contraction. A clutch coupling between F-actin retrograde flow and adhesive substrate generates traction forces for growth cone advance. The present study describes a detailed protocol for monitoring F-actin retrograde flow by single speckle imaging. Importantly, when combined with an F-actin marker Lifeact, this technique can quantify 1) the F-actin polymerization rate and 2) the clutch coupling efficiency between F-actin retrograde flow and the adhesive substrate. Both are critical variables for generating forces for growth cone advance and navigation. In addition, the present study describes a detailed protocol of traction force microscopy, which can quantify 3) traction force generated by growth cones. Thus, by coupling the analyses of&#160;single speckle imaging and traction force microscopy, investigators can monitor the molecular mechanics underlying growth cone advance and navigation.

To advance, growth cones must exert traction forces against the external environment. The generation of traction forces is dependent on actin dynamics and clutch coupling. The present study describes methods for analyzing actin dynamics, clutch coupling and traction forces for growth cone advance.

Análises da Actin Dynamics, Clutch Coupling e Força de Tração para o Avanço do Cone de Crescimento

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Imagens de alta resolução e Análise de individuais Astral microtúbulos Dynamics em brotamento Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Uma interface de usuário gráfica para rastreamento assistido por software da concentração de proteínas em protrusões celulares dinâmicas

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a genetically encoded marker for the positive ends of microtubules (EB3 labelled with tdTomato fluorescent protein) and high-speed, high-resolution, live-cell imaging using spinning disk confocal microscopy. Cell cycle synchronization and increased density of microtubules are achieved by inhibiting centrosomal separation in mitotic cells, and analysis of growth is performed using open-source U-Track software. The use of a bright and red-shifted fluorescent protein, in combination with the lower laser power and reduced exposure time required for spinning disk microscopy reduce phototoxicity and the probability of light-induced artifacts. This allows for imaging a larger number of cells in the same preparation while maintaining the cells in a growth medium under standard culture conditions. Because the analysis is performed in a supervised automatic fashion, the results are statistically robust and reproducible.

Here we present a robust and detailed method of microtubule dynamics analysis in cells synchronized in prometaphase using live-cell spinning disk confocal microscopy and MATLAB-based image processing.

Medição da dinâmica do microtúbulo girando microscopia do disco em fusos mitocticos monopolares

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a ...

Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the construction and regeneration of tissues, and is critical in embryonic development, immunological responses, and wound healing. Dysregulation of cell motility contributes to pathological disorders, such as chronic inflammation and cancer metastasis. Cell migration, tissue invasion, axon, and dendrite outgrowth all initiate with actin polymerization-mediated cell-edge protrusions. Here, we describe a simple, efficient, time-saving method for the imaging and quantitative analysis of cell-edge protrusion dynamics during spreading. This method measures discrete features of cell-edge membrane dynamics, such as protrusions, retractions, and ruffles, and can be used to assess how manipulations of key actin regulators impact cell-edge protrusions in diverse contexts.

This protocol aims to measure the dynamic parameters (protrusions, retractions, ruffles) of protrusions at the edge of spreading cells.

Medindo a dinâmica de saliência da borda celular durante a disseminação usando microscopia de células vivas

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the ...

Usando plusTipTracker software para medir Microtubule Dynamics em

Resumo

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