We thank Dr. Gaudenz Danuser and members of his lab for creating the plusTipTracker software and for helpful discussion regarding using the software, in particular Maria Bagonis and Sebastien Besson. We especially thank the Boston College Media Center for their assistance and support in the creation and editing of the video. We also thank members of the Lowery Lab for useful discussions and constructive criticism, and Abigail Antoine for proof-reading the manuscript. This work was funded by an NIH R00 MH095768 award to LAL.

وتهدف هذا البروتوكول والفيديو لتكون بمثابة رفيق إلى الورقة الأصلية التي تصف مجموعة من البرامج في مزيد من التفاصيل 4، وكذلك التقرير الفني الذي يأتي مع تحميل البرمجيات على الموقع Danuser مختبر. ويتم تشجيع القراء لمراجعة هذه الوثائق بعناية إذا كانت هناك أسئلة إضافية بشأن استخدام البرنامج. 1. قبل تحليل الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل كل فيلم الوقت الفاصل في سلسلة من TIFF (تنسيق ملفات الصور ذات الكلمات الدلالية) ملفات الصور. إذا كان هناك مخاريط النمو متعددة / الخلايا في فيلم معين، المحصول الأول كل مخروط النمو / خلية لخلق تسلسل الصور الخاصة به. ملاحظة: هذا ليس من الضروري، كما يمكن اختيار مناطق من المصلحة الفردية (ROI) ضمن plusTipTracker. ومع ذلك، باستخدام أبعاد الصورة أصغر يزيد من سرعة المعالجة الحسابية، لذلك يوصى هذه الخطوة إذا كان هناك مساحة فارغة كبير في الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ كل سلسلة TIFF في تلقاء نفسهامجلد يسمى &quot;الصور&quot; ضمن مسار التي تم تعيينها MATLAB للوصول (لاحظ أن &quot;الصور&quot; حساس لحالة الأحرف). لإضافة مسار جديد، انتقل إلى الدليل الملفات ذات الصلة في الإطار &quot;المجلد الحالي&quot;، انقر بزر الماوس الأيمن على أيقونة دليل، وحدد &quot;إضافة إلى مسار - مختارة المجلدات والمجلدات الفرعية&quot;. من المهم أن يتم إضافة مجلد البرامج plusTipTracker إلى مسار، كذلك. </li></ol> 2. plusTipGetTracks ملاحظة: الخطوة الأولى في تحليل الصور هي للكشف عن المذنبات-EB1 GFP، ربط المذنبات في المسارات، وتحديد معايير ديناميات أنيبيب. يتم الحصول على هذا مع &quot;plusTipGetTracks&quot; القيادة 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لبدء تحليل، تطبيق مفتوح MATLAB واكتب &quot;plusTipGetTracks&quot; في إطار الأوامر. سيؤدي هذا إلى مربع حوار جديد لتظهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على &quot;إقامة مشروعات جديدة&quot; واختيار واحد (أو موره) من TIFF صورة سلسلة السابقة عن طريق اختيار &quot;الصور&quot; المناسبة مجلد (أو الدلائل التي تحتوي على &quot;صور&quot; المجلدات). عند الانتهاء من هذه الخطوة، دليل الملف (roi_1) سيتم إنشاء (في نفس المجلد الذي يحمل &quot;صور&quot;) التي سوف تحتوي على ملفات البيانات في المستقبل. ملاحظة: &quot;تعيين مشروعات جديدة&quot; خطوة يمكن أن تكتمل في وقت مبكر، خلال جلسة منفصلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سوف تظهر نافذة جديدة: &quot;تحديد المضلع، انقر بزر الماوس الأيمن على النقطة الأخيرة، وانقر على &#39;إنشاء قناع&quot;. انقر على &quot;OK&quot;. وبعد ذلك يتم عرض الصورة الأولى من سلسلة الصورة المحددة. استخدام الماوس للنقر وإنشاء المضلع الذي يشمل مجمل مخروط النمو. انقر نقرا مزدوجا فوق الماوس لإغلاق المضلع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة تم إغلاق المضلع، سوف تظهر مربع حوار: &quot;هل تريد تحديد العائد على الاستثمار أخرى؟&quot; إذا كانت الصورة لديه مخروط النمو لتحليل آخر، حدد &quot;نعم&quot;. ق غير ذلكالمنتخب &quot;لا&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد المشاريع التي سيتم تحليلها فورا. انقر على &quot;تحديد المشاريع&quot; وحدد المجلد (roi_X) لتحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ستظهر شاشة listSelectGUI. حدد المشروع (ق) من الجانب الأيسر من الشاشة ونقلها إلى الجانب الأيمن من الشاشة. انقر على &quot;OK&quot;. اختيار موقع لحفظ القائمة المشروع ثم انقر فوق &quot;حفظ&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد &quot;الكشف&quot;، &quot;تتبع&quot;، و &quot;ما بعد المعالجة&quot;. مرة واحدة تم إجراء هذه الاختيارات، فإن الجانب الأيمن من مربع الحوار أصبح شكلي. تكوين كل خيار. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتستخدم هذه المعايير لربط الكشف عن المذنبات في المسارات MT. وترد تفاصيل لاختيار هذه المعايير تحكم لتتبع على صفحات 9-10 من التقرير الفني PDF التي ترافق حزمة برامج التحميل؛ قراءة هذا التقرير بعناية إذا واجهت المشاكل. لأغراض تتبع المذنبات EB1-GFP في Xenopلنا المورق مخاريط النمو، واستخدام إعدادات تتبع التالية: ابحث عن أنصاف المدى المدى (بكسل) 5-12، الحد الأدنى للطول المسار الفرعية (إطارات) 3. أقصى طول الفجوة (إطارات) 8؛ ماكس فاكتور انكماش 0.8، ماكس زاوية الأمام 50، ماكس زاوية الخلف 10، تذبذب الشعاع 2.5. وتظهر هذه الإعدادات في الشكل 1. </li></ol> ملاحظة: يتم تعيين انكماش ماكس فاكتور للحد من عدد من &quot;الثغرات المتخلفة&quot; الكشف، إذ أن &quot;الثغرات المتخلفة&quot; ليست مفيدة لتحليل في سياق مخاريط النمو، نظرا للظروف مزدحمة والأخطاء المحتملة في الروابط المسار. بالإضافة إلى ذلك، يتم تعيين كل من زاوية ماكس الأمام وكذلك تذبذب الشعاع عالية نسبيا، والنظام التجاري المتعدد الأطراف مخروط النمو تظهر translocations صغيرة متكررة بالإضافة إلى معدلات النمو والإنكماش، وزيادة هذه إعدادات التحكم تسمح هذه الحركة المتزايدة خلال خطوة الربط. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء تجهيز بوست إعدادات تبعا لإعدادات محددة الحصول على الصور المطلوبة. </li></ol> &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد تكوين الإعدادات، انقر على &quot;ابدأ&quot;. سيتم تشغيل البرنامج أيهما إعدادات تم اختيارها. قد يستغرق هذا دقائق إلى ساعات، اعتمادا على عدد من المشاريع المختارة وأحجامها. يعرض إطار الأوامر الوقت المتبقي المقدر لكل وظيفة. عند اكتمال الخطوة plusTipGetTracks، وإطار الأوامر سيتم عرض &quot;انتهى!&quot; ملاحظة: هناك قائمة طويلة من الآن تم احتساب معايير محددة للديناميات MT بواسطة هذا البرنامج (انظر المرجع 4 لمزيد من التفاصيل)، ولكن لتحليل ديناميات MT في مخاريط النمو، المعلمات الأكثر فائدة لدراسة MT هي مسار النمو سرعة (في ميكرون / دقيقة)، عمر مسار النمو (في ثوان)، وطول مسار النمو (في ميكرون). </li></ol> 3. plusTipSeeTracks ملاحظة: الآن وبعد أن المسارات أنيبيب تم تحديدها، فإن وظيفة &quot;plustipSeeTracks&quot; يستخدم لمسار التصور 4. هذه الوظيفةيمكن أن توفر نواتج متعددة لتصور، بما في ذلك الخرائط الديناميكية MT المكانية والأفلام السرعة، ولكن هنا، يكون التركيز فقط على استخدام &quot;الأفلام المسار&quot; لعرض المسارات MT فرضه على الصور مخروط النمو. بينما يمكن plusTipGetTracks تحليل الأفلام متعددة في وقت واحد، يمكن plusTipSeeTracks تحليل فيلم واحد فقط في المرة الواحدة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اكتب &quot;plusTipSeeTracks&quot; في إطار الأوامر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تحميل مربع الحوار، انقر على &quot;المشروع أختر&quot;. حدد الدليل الأم يحتوي المشروع على تصور وانقر على &quot;تحديد المجلد&quot;. سوف تظهر نافذة جديدة: &quot;حدد المشروع الذي تريد تصور&quot;. اختيار ملف لتصور وانقر على &quot;OK&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ذلك، انقر على &quot;حدد المحفوظة العائد على الاستثمار&quot;. انتقل إلى نفس المجلد roi_X بوصفها واحدة المختارة في الخطوة السابقة ثم حدد الملف المسمى &quot;roiYX&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على &quot;تحديد دليل إخراج&quot; لتعيين ثهنا سوف MATLAB حفظ الملفات التصور المسار. ملاحظة: نوصي باستخدام نفس المجلد الذي يحتوي على بقية البيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد &quot;جعل المسار فيلم&quot; وسوف تظهر شاشة عرض كل plusTipGetTracks المسارات تحسب من المذنبات TIP +. هذه الخطوة يحفظ سلسلة زمنية تتبع في شكل فيلم، في ملف &quot;allTracks_X_X_X&quot;. هناك خيار لإنقاذ الفيلم باعتباره AVI، وإلا فإن التنسيق الافتراضي هو كملف Quicktime.mov. </li></ol> 4. plusTipGroupAnalysis ملاحظة: يتم استخدام هذه الدالة النهائية لإنشاء مجموعات من الأفلام لتحليل ومقارنة MT المعلمات مسارها. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اكتب &quot;plusTipGroupAnalysis&quot; في إطار الأوامر. لتحديد المجموعات يدويا للمقارنة، الأول دي حدد &quot;مجموعة السيارات من التسلسل الهرمي&quot;. ثم، انقر على &quot;تحديد المشاريع&quot;. انتقل إلى الدلائل الأصل تحتوي على جميع المجلدات roi_Xلتحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ستظهر شاشة listSelectGUI. تحديد كافة المشاريع التي تدرج في مجموعات من الجانب الأيسر من الشاشة ونقلها إلى الجانب الأيمن من الشاشة. انقر على &quot;OK&quot;. اختيار موقع لحفظ القائمة المشروع ثم انقر فوق &quot;حفظ&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سوف تظهر نافذة: &quot;الرجاء تحديد المجموعة الأولى من القائمة&quot;. انقر على &quot;OK&quot;. سوف نافذة listSelectGUI عرض مرة أخرى. هذا الوقت، حدد فقط تلك الملفات التي تتوافق مع المجموعة الأولى التي ينبغي تجميعها معا. انقر على &quot;OK&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم، أدخل اسم المجموعة، وانقر على &quot;OK&quot;. سوف تظهر نافذة: &quot;حدد مجموعة أخرى؟&quot; الإجابة وفقا لذلك وتستمر اختيار المجموعات. سوف تظهر نافذة: &quot;حدد موقعا لحفظ قائمة مجموعتك&quot;. انتقل إلى الموقع وانقر على &quot;حفظ&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على &quot;اختر الناتج دليل&quot; لاختيار المجلدات حيث الناتج ستكونالمخزنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد أي نوع من التحليل لإجراء مجموعة - سواء المسارات MT يجب تجميع لكل مجموعة أو لكل خلية التحليل يجب أن يتم تنفيذ. تم تعيينها بالفعل الاختبارات الإحصائية الموصى بها. لتشمل جميع المسارات في التحليل، وعدم اختيار &quot;إزالة المسارات في بداية / نهاية فيلم&quot;. خلاف ذلك، وجود هذا الإطار المحدد يزيل أي مسارات النمو MT التي هي في العملية حيث يبدأ الفيلم أو ينتهي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إجراء تحليل اختيار المجموعة، حدد &quot;قارن مجموعات&quot;. </li></ol>

<ol>
	<li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+(end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein).">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule+plus+end+tracking+protein+Orbit/MAST/CLASP+acts+downstream+of+the+tyrosine+kinase+Abl+in+mediating+axon+guidance.">The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance.</a> Neuron. , 913-926 (2004).</li><li>Purro, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+regulates+axon+behavior+through+changes+in+microtubule+growth+directionality:+a+new+role+for+adenomatous+polyposis+coli.">Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).</li><li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=plusTipTracker:+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics.">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).</li><li>Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Explant+Cultures+from+Xenopus+laevis.">Neural Explant Cultures from Xenopus laevis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232 (2012).</li><li>Long, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+analysis+of+CLASP-interacting+protein+functions+during+interphase+microtubule+dynamics.">Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics.</a> Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).</li><li>Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+ECM+mechanosensing+pathways+regulate+microtubule+dynamics+to+control+endothelial+cell+branching+morphogenesis.">Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis.</a> The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).</li><li>Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+screening+of+microtubule+growth+dynamics+identifies+MARK2+as+a+regulator+of+leading+edge+microtubules+downstream+of+Rac1+in+migrating+cells.">Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells.</a> PLoS One. 7, e41413 (2012).</li><li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+ends:+a+dynamic+protein+network+controls+the+fate+of+microtubule+tips.">Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).</li><li>Schuyler, S. C., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+'plus-end-tracking+proteins':+The+end+is+just+the+beginning.">Microtubule 'plus-end-tracking proteins': The end is just the beginning.</a> Cell. 105, 421-424 (2001).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312, 237-242 (1984).</li><li>Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+behavior+of+the+APC-binding+protein+EB1+on+the+distal+ends+of+microtubules.">The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules.</a> Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).</li><li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+tracking+by+CLIP-170+requires+EB1.">Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EB1+promotes+microtubule+dynamics+by+recruiting+Sentin+in+Drosophila+cells.">EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells.</a> The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).</li><li>Maurer, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EB1+accelerates+two+conformational+transitions+important+for+microtubule+maturation+and+dynamics.">EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics.</a> Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).</li><li>Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+between+XMAP215+and+EB1+increases+microtubule+growth+rates+to+physiological+levels.">Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels.</a> Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).</li><li>Lowery, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone-specific+functions+of+XMAP215+in+restricting+microtubule+dynamics+and+promoting+axonal+outgrowth.">Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth.</a> Neural development. 8, 22 (2013).</li><li>Marx, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+cytoplasmic+linker-associated+protein+1+(XCLASP1)+promotes+axon+elongation+and+advance+of+pioneer+microtubules.">Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules.</a> Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

يوفر PlusTipTracker واضحة، واجهة المستخدم الرسومية بسرعة وتلقائيا للكشف مرئية تقريبا جميع المذنبات EB1-GFP في زنزانة أو النمو مخروط، ربط المذنبات في المسارات، وحساب المعلمات MT. وذكرت وغيرها من المطبوعات تصميم أنواع مماثلة من البرامج (على سبيل المثال، ماركس وآخرون. تستخد...

الهدف من هذه الطريقة هو الحصول على المعلومات الكمية المتعلقة أنيبيب (MT)، بالإضافة إلى تتبع نهاية البروتين (+ TIP) ديناميات يعيشون في مخاريط النمو. MT + النصائح هي مجموعة من البروتينات التي لتوطين زائد الغايات من النظام التجاري المتعدد الأطراف 9،10. أنها تؤدي مجموعة من الوظائف لتنظيم المعلمات من عدم الاستقرار الديناميكي MT 11، بما في ذلك معدلات البلمرة، كارثة، والإنقاذ. واحد الطريقة المستخدمة جيدا لتحليل ديناميات MT هو تتبع سلوك EB1 TIP +، الذي يربط خصيصا لتزايد MT زائد 1،12 ينتهي. ومن المعروف EB1 لتجنيد عدة بروتينات أخرى لتزايد MT زائد ينتهي 13،14، ومؤخرا تم تأسيس كعامل MT النضج 15، وتعزيز كلا MT النمو وتردد كارثة 15،16. وقد استخدمت العديد من الدراسات ديناميات MT داخل مخاريط النمو طرق ناحية تتبع لقياس التغيرات في ديناميات EB1-GFP مع مرور الوقت 1-3، وEB1 localizatiإلى MT زائد نهايات يمكن أن تستخدم كعلامة للMT البلمرة. ومن المزايا الرئيسية لدراسة المذنبات EB1-GFP كبديل للنمو MT هي أن ديناميات MT يمكن قياسها حتى في مناطق التداخل MT كبير. في حين أن طريقة المذنبات EB1-GFP تتبع ناحية قدمت معلومات مفيدة إلى MT السلوكيات 1-3، فمن وقتا طويلا ويمكن أن يكون متحيزا. بالإضافة إلى ذلك، كما هي السلوكيات الشاذة النمو مخروط الأرجح نتيجة التحولات الدقيقة في ديناميات هيكل الخلية وتحليلها فقط مجموعة فرعية صغيرة من النظام التجاري المتعدد الأطراف (عادة اللازمة عند اليد تتبع) قد يغيب عن معلومات مهمة. وبالتالي، فإننا قياس المعلمات ديناميات MT العالمية باستخدام حزمة البرامج، plusTipTracker 4، بعد الحصول على عالية الدقة، والصور الحية من المعلمة EB1 في تربيتها مخاريط النمو الجنيني 5. هذا البرنامج، وضعت في مختبر Danuser، وقد استخدم في العديد من الدراسات التي تميز ديناميكية MT في مختلف أنواع الخلايا 6-8. وهو مفتوح المصدر، لنادية إيه، الحزمة استنادا MATLAB التي تشمل الكشف الآلي، وتتبع، والتصور، والتحليل للأفلام من fluorescently المسمى + النصائح. وهناك قائمة طويلة من تحسب معايير محددة للديناميات MT بواسطة هذا البرنامج (انظر المرجع 4 لمزيد من التفاصيل)، ولكن لتحليل ديناميات MT في مخاريط النمو، المعلمات الأكثر فائدة هي MT مسار النمو سرعة (في / ميكرون دقيقة)، مسار النمو عمر (ثانية)، وطول مسار النمو (في ميكرون). البرنامج يمكن تحميلها مباشرة من موقع Danuser مختبر (تحت &quot;البرنامج&quot;). في حين مختبر Danuser تدعم حاليا واجهة تعليقات أحدث ل + تحليل تتبع TIP، والتي يتم تضمينها في حزمة البرمجيات دعا يو المسار 2.0، ستبقى الأصلي، قائمة بذاتها البرمجيات المتاحة. خوارزميات الكامنة بين البرنامجين هي نفسها (على الأقل عام 2014)، مع وجود اختلاف في واجهة وتحليل النواتج. بالنسبة للمستخدم المبتدئ مع قليل MATLAB و / أو تحليل الحسابية جتربةسينعقد، plusTipTracker ديه المزيد من الميزات سهلة الاستخدام، بما في ذلك الآلية مخرجات المعلمة الإحصائية. هنا، نحن تصف الخطوات لتحليل الصور من ديناميات EB1-GFP في تربيتها القيطم المورق مخاريط النمو. تم استخدام هذا البروتوكول في ورقة حديثة دراسة ديناميات MT 17. انظر أيضا لوري وآخرون 2012 5 للحصول على تعليمات مفصلة عن مخاريط النمو زراعة معربا عن EB1-GFP. في حين أن هذه الورقة تركز في المقام الأول على دراسة ديناميات EB1-GFP في مخاريط النمو، نفس البروتوكول يمكن استخدامها لأنواع الخلايا الأخرى 17. لجميع أنواع الخلايا، يجب أن يكون الفاصل الزمني بين الإطارات بين 0.5-2 ثانية لتتبع الأمثل + TIP. فترة زمنية تصل إلى 4 ثواني بين الإطارات هو ممكن، ولكن هذه النتائج زيادة الفاصل الزمني في تتبع أخطاء إضافية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">plusTipTracker software</td>
			<td style="width:116px;">Danuser Lab</td>
			<td style="width:345px;"><a href="http://lccb.hms.harvard.edu/software.html">http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</a></td>
			<td style="width:172px;">This software may be hosted by another website in the future.&#160; If the listed site does not exist, search &#34;Danuser Lab Software&#34; on a web search engine to find the site.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Matlab software</td>
			<td style="width:116px;">Mathworks</td>
			<td><a href="http://www.mathworks.com/products/matlab/">http://www.mathworks.com/products/matlab/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using plustiptracker software to measure microtubule dynamics in xenopus laevis growth cones

أنيبيب (MT) زائد تتبع نهاية البروتينات (+ نصائح ل) تعريب لتزايد بالإضافة إلى الغايات من النظام التجاري المتعدد الأطراف وتنظيم ديناميات MT 1،2. واحدة من النصائح الأكثر معروفة وتستخدم على نطاق واسع + لتحليل ديناميات MT-ملزم هو نهاية البروتين، EB1، الذي يربط جميع MT زائد نهايات المتزايد، وبالتالي، هو علامة لMT البلمرة 1. وقد استخدمت العديد من الدراسات من السلوك EB1 داخل مخاريط النمو تستغرق وقتا طويلا وبمساعدة الحاسوب متحيزة وطرق ناحية تتبع لتحليل فردي النظام التجاري المتعدد الأطراف 1-3. نهجنا هو قياس المعلمات العالمية لديناميات MT باستخدام حزمة البرامج، plusTipTracker 4، بعد اكتساب عالية الدقة، والصور الحية من المعلمة EB1 في تربيتها مخاريط النمو الجنيني 5. هذا البرنامج هو ومفتوحة المصدر، حزمة سهلة الاستعمال تستند MATLAB الذي يجمع بين الكشف الآلي، وتتبع، والتصور، والتحليل للأفلام من fluorescently المسمى + النصائح. هنا، نقدم بروتوكول لاستخدام plusTipTracker لتحليل + المذنبات TIP fluorescently المسمى في تربيتها القيطم المورق مخاريط النمو. ومع ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم هذا البرنامج لوصف ديناميات MT في مختلف أنواع الخلايا 6-8.

باستخدام هذا البرنامج كما هو موضح هنا سيقدم عدة ملفات من المعلومات التي قياس ديناميكية TIP + في الخلايا الحية. وplusTipGetTracks ظيفة يحدد المسارات (باستخدام إعدادات سبيل المثال هو موضح في الشكل 1)، ثم تقدم المعلمات بشأن المسارات T...

Watch this Scientific Journal Video about Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones at JoVE.com

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

و، حزمة برمجيات المصدر المفتوح القائمة على MATLAB، plusTipTracker، ويمكن استخدامها لتحليل سلسلة صورة-fluorescently المسمى + نصائح لقياس ديناميات أنيبيب.

plusTipTracker باستخدام برنامج لقياس ديناميكية في أنيبيب<em&gt; القيطم المورق</em&gt; المخاريط النمو

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

using-plustiptracker-software-to-measure-microtubule-dynamics-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

10.3K Views.  Boston College.  و، حزمة برمجيات المصدر المفتوح القائمة على MATLAB، plusTipTracker، ويمكن استخدامها لتحليل سلسلة صورة-fluorescently المسمى + نصائح لقياس ديناميات أنيبيب. 

Video: Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

البلاستيك وتضمينها Sectioning الجنين المورق القيطم

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information into directional movement towards the appropriate target cell. To fully understand how guidance information is transmitted from the cell surface to the underlying dynamic cytoskeletal networks, one needs a model system suitable for live cell imaging of protein dynamics at high temporal and spatial resolution. Typical vertebrate growth cones are too small to quantitatively analyze F-actin and microtubule dynamics. Neurons from the sea hare Aplysia californica are 5-10 times larger than vertebrate neurons, can easily be kept at room temperature and are very robust cells for micromanipulation and biophysical measurements. Their growth cones have very defined cytoplasmic regions and a well-described cytoskeletal system. The neuronal cell bodies can be microinjected with a variety of probes for studying growth cone motility and guidance. In the present protocol we demonstrate a procedure for dissection of the abdominal ganglion, culture of bag cell neurons and setting up an imaging chamber for live cell imaging of growth cones.

Aplysia californica neurons develop large growth cones in culture that are excellent for high-resolution imaging of growth cone motility and guidance. Here, we present a protocol for dissection and plating of Aplysia bag cell neurons as well as for setting up a chamber for live cell imaging.

الخلية العصبية من الثقافات Aplysia عن التصوير عالية الدقة من المخاريط النمو

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

الحصول على البيض من الإناث المورق القيطم

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

إعداد والتقطير من البيض مقتطفات القيطم المورق

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection من البويضات المورق القيطم

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

تحديد الأنسجة باستخدام زرع رسملة الحيوان (ACT) في الفحص القيطم المورق</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

تعيش خلية التصوير والتحليل الكمي من الخلايا الظهارية في الجنينية القيطم المورق</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

إنتاج<em&gt; القيطم مداري</em&gt; البيض مقتطفات من التعرف على الرنا أنيبيب المرتبطة بها

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

زرع الوجه في<em&gt; القيطم المورق</em&gt; الأجنة

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.