אנו מודים לתסיסנית מרכז Stock Bloomington למתן מניות זבוב. אנו מודים גם לבנק התפתחותית המחקרים Hybridoma וד&quot;ר לין קולי (אוניברסיטת ייל) למתן נוגדנים. תודה מיוחדת לAhHyun Yoo על עזרתה בכתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה (קריגר), ויליאם ועדה איזבל פלדת הקרן (קריגר), והמכון הקנדי לחקר בריאות (הרדן).

1. גוף וול הכנה הערה: הכנת גוף זחל קירות instar השלישי (למחקר של NMJs שמעצבב את קיר שרירי גוף) בוצעה כפי שתואר בעבר ברנט ואח &#39;10, או Ramachandran וBudnik 11,12, אבל עם כמה שינויים.. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעלות מניות לטוס וצלבים על 25 מעלות צלזיוס במשך 5-6 ימים באמצעות נהלים סטנדרטיים 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר זוחל זחלי instar שלישיים מבקבוקונים או בקבוקים באמצעות מלקחיים בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הזחלים בצלחת פטרי קטנה המכילה פוספט הצפת מלוח (PBS) כדי להסיר כל חלקיקי מזון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח זחל יחיד על גבי דיסק sylgard ולטבול אותו בכמה טיפות של PBS קר כקרח. באמצעות PBS קר כקרח יעזור לי המם את הזחל שהופך אותו קל יותר לתמרן. לאורך לנתיחה, להבטיח כי ההכנה היא תמיד שקועה בPBS כדי למנוע את זה מהתייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את laRvA עם צד הגב שלה פונה כלפי מעלה, כך ששני קטעים לקנה הנשימה נראים תחת מיקרוסקופ לנתח (איור 2 א). שימוש במלקחיים כדי לתפוס סיכת minutien, להצמיד את הזחל בקצה האחורי ליד spiracles (איור 2). עם סיכה אחרת, לחדור מבעד לציפורן בקצה הקדמי ליד הפה הווים. בעדינות למתוח את הזחל מתוך אורך, אז להצמיד אותו (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת המספריים microdissection, לצבוט את הקצה האחורי ליד הסיכה כדי ליצור פתח קטן. החתך צריך להיות שטחי מספיק רק לעבור לציפורן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצבת קצה הלהב התחתון של המספריים לתוך החתך, לחתוך לאורך כל אורכו של קו האמצע הגב בין שני קטעים לקנה הנשימה (איור 2 ג). כוון את להבי מספריים מעט כלפי מעלה בעת החיתוך כדי למנוע נזק לשרירי קיר גוף הגחון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך אופקי קטן מעט קדמי לתפקידסיכת eriorly-הציבה (איור 2 ג). לעשות עוד חתך דומה מעט אחורי לפין anteriorly-הציב (איור 2 ג). החתכים צריכים רק לעבור לציפורן. הערה: שלושה חתכים מצעדים 1.1.7 ו1.1.8 בשילוב צריך להיות דומה &quot; <img fo:content-width="0.09in" src="/files/ftp_upload/52139/52139_letter_I.jpg" width="15px" /> &quot;כשסיים, כלומר, שמאל ויד ימין דש בצד הגב של גוף הזחל צריך להיות מיוצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות את זהירות את האיברים הפנימיים עם המלקחיים. הוספה כמה טיפות בכוח של PBS תעזור לתפוס את האיברים מחוץ לגוף הזחל, וכך קל יותר כדי להסיר אותם. הימנע תוקע גוף הזחל כפי שיגרום נזק לקיר שרירי גוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרוש גוף הזחל פתוח ולהצמיד את הפינות כלפי מטה (איור 2 ד). כאשר מצמיד, למתוח את קיר הגוף אופקי ואנכי כדי ליצור מלבן באופן שווה-מתוח (seדואר איור 2G לצורה), מטפל שלא לקרוע את קיר שרירי גוף בתהליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים הסרת כל איברים שנותרו פנימיים (איור 2E). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קיבעון וpermeabilization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את גוף הקירות תלו בכמה טיפות של התמיסה של Bouin. דגירה במשך 15 דקות על קרח. לחלופין, להשתמש paraformaldehyde 4% (PFA) כמקבע חלופי; דגירה למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים עם פוספט הצפת מלוח עם טריטון (PBT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בסדר, להסיר בזהירות את הסיכות ולהעביר את גוף הקירות בפינות שלהם לתוך צינור microcentrifuge siliconized 0.65 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את גוף הקירות בPBT ב 4 ° C עד מוכן לPLA. לקבלת תוצאות אופטימליות, להתחיל immunostaining גוף הקירות בתוך יום או ימים של נתיחה. הערה: כדי לחסוך בחומרים כימיים ועל מנת להבטיח כי הם התייחסו לכל הגוף באופן שווה במהלך קירות assay, ניתן להציב גנוטיפים שונים ליחידצינור. ניתן להבחין גנוטיפים על ידי חיתוך הפינות של קירות הגוף שונה (ראה תרשים 2F לדוגמאות). </li></ol></li></ol> 2. אימונוהיסטוכימיה הערה: Immunostaining של גוף זחל קירות instar השלישי בוצע כפי שתואר בעבר ברנט ואח &#39;14 וRamachandran ו -11 Budnik, אבל עם כמה שינויים 11,14.. הערה: בצע את כל השלבים בטמפרטורת חדר ועם תסיסה עדינה, אלא אם כן צוין אחרת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את גוף קירות עם PBT שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום עם 1% אלבומין סרום שור (BSA) במשך שעה 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה גוף הקירות עם נוגדני עכבר ועיקריים ארנב נגד שני החלבונים של עניין (בדילול מלא 1% BSA) לשעה 2 בטמפרטורת חדר, או הלילה ב 4 ° C. במקרה זה, להשתמש בעכבר 01:10 אנטי-DLG ו -1: 250 ארנבNTI-HtsM 15,16. נוגדנים כנגד סמנים שאינם נעשו בעכבר או ארנבת יכולים להיכלל גם - למשל, להשתמש 1: 200 עיזים אנטי-Hrp להתוות ממברנות עצביות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם PBT שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדנים משני fluorophore מצומדות כדי לזהות הסמנים (בדילול מלא BSA 1%) לשעה 2 בטמפרטורת חדר, או הלילה ב 4 ° C. כאות PLA מאוחר יותר דמיין עם fluorophore אדום, fluorophore אחר יש להשתמש כדי לזהות את הסמן - למשל, להשתמש 1: 200 אנטי-עז FITC- מצומדות כדי לזהות את הנוגדן אנטי Hrp העז. בשל השימוש בחומרים כימיים רגיש לאור, לשמור על הצינורות בחושך מנקודה זו ואילך. הערה: הערכה המשמשת מאפשרת לPLA להתבצע בין נוגדנים העיקריים שהועלו בעכבר וארנב, עם האות דמיין בערוץ האדום תחת מיקרוסקופ confocal. אם תרצה, ערכות אחרות זמינות המאפשרות assay להיעשות עם פרימהנוגדני ר&quot;י גדלו במינים אחרים, ואת האות דמיין בערוצים אחרים. </li></ol></li></ol> 3. סמיכות קשירת Assay הערה: בצע את כל השלבים בטמפרטורת חדר ועם תסיסה עדינה, אלא אם כן צוין אחרת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדיקות PLA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את גוף קירות עם PBT שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם בדיקות PLA (1: 5 דילול כל אחד בBSA 1%) לשעה 2 ב 37 ° C. במקרה זה, להשתמש 40 μl של מינוס אנטי עכבר הבדיקה PLA, 40 μl של PLUS נגד ארנב הבדיקה PLA ו -120 μl של BSA 1% על מנת להבטיח את הטבילה וערבוב הנכונים של 5-10 גוף קירות. עד דילול 01:25 של בדיקות PLA עדיין יכול לגרום ליחס הולם אות לרעש (כלומר, עבור ניסוי זה). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קשירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את גוף קירות עם הצפת לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם פתרון קשירת (01:40 דילול של אנזים במאגר קשירת) לשעה 1C ° 37 t. במקרה זה, להשתמש 5 μl של אנזים, 40 μl של חיץ 5 קשירת וμl 155 של מים טוהר גבוהים כדי להבטיח טבילה וערבוב הנכונים של 5-10 גוף קירות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את גוף קירות עם הצפת לשטוף פעמיים עבור 2 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם פתרון ההגברה (1:80 דילול של פולימראז במאגר הגברה) לשעה 2 ב 37 ° C. במקרה זה, להשתמש 2.5 μl של פולימראז, 40 μl של 5 חיץ הגברה ו157.5 μl מים טוהר גבוהים על מנת להבטיח את הטבילה וערבוב הנכונים של 5-10 גוף קירות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה להדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את גוף קירות עם הצפת לשטוף B פעמיים במשך 10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם 0.01x הצפת לשטוף B פעם 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן בכמה טיפות של תמיסת הרכבה לפחות 30 דקות לפני ההרכבה, או לאחסן לילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מלקחיים עדינים, להעביר בזהירות את קירות גוף לשקופית פלטפורמת wה- i הציפורניים שלהם פונות כלפי מטה. מקם את גוף הקירות בשורות ובאותו הכיוון בתוך טיפה או שתיים של mountant. מניחים coverslip x 40 מ&quot;מ 22 מ&quot;מ מעל מטפל הכנה לא ליצור בועות אוויר, ואז לאטום את השקופית עם לק ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את השקופיות בחושך ב -20 ° C עד מוכן להדמית confocal. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Woods, D. F., Bryant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discs-large+tumor+suppressor+gene+of+Drosophila+encodes+a+guanylate+kinase+homolog+localized+at+septate+junctions.">The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions.</a> Cell. 66, 451-464 (1991).</li><li>Yamanaka, T., Ohno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Lgl/Dlg/Scribble+in+the+regulation+of+epithelial+junction,+polarity+and+growth.">Role of Lgl/Dlg/Scribble in the regulation of epithelial junction, polarity and growth.</a> Front Biosci. 13, 6693-6707 (2008).</li><li>Humbert, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+tumourigenesis+by+the+Scribble/Dlg/Lgl+polarity+module.">Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module.</a> Oncogene. 27, 6888-6907 (2008).</li><li>Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X. X., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+dlg+is+required+for+normal+synaptic+bouton+structure.">The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure.</a> Neuron. 13, 823-835 (1994).</li><li>Ataman, B., Budnik, V., Thomas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffolding+proteins+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Scaffolding proteins at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Int Rev Neurobiol. 75, 181-216 (2006).</li><li>Thomas, U., Kobler, O., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+larval+neuromuscular+junction+as+a+model+for+scaffold+complexes+at+glutamatergic+synapses:+benefits+and+limitations.">The Drosophila larval neuromuscular junction as a model for scaffold complexes at glutamatergic synapses: benefits and limitations.</a> J Neurogenet. 24, 109-119 (2010).</li><li>Matsuoka, Y., Li, X., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adducin:+structure,+function+and+regulation.">Adducin: structure, function and regulation.</a> Cell Mol Life Sci. 57, 884-895 (2000).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+adducin+regulates+Dlg+phosphorylation+and+targeting+of+Dlg+to+the+synapse+and+epithelial+membrane.">Drosophila adducin regulates Dlg phosphorylation and targeting of Dlg to the synapse and epithelial membrane.</a> Dev Biol. 357, 392-403 (2011).</li><li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45, 227-232 (2008).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+dissection.">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li><li>Ramachandran, P., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+staining+of+Drosophila+larval+body-wall+muscles.">Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).</li><li>Ramachandran, P., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Drosophila+larval+body-wall+muscles.">Dissection of Drosophila larval body-wall muscles.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Laboratory Manual. , (1989).</li><li>Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+immunohistochemistry.">Drosophila larval NMJ immunohistochemistry.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+postsynaptic+structure+and+protein+localization+by+the+Rho-type+guanine+nucleotide+exchange+factor+dPix.">Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix.</a> Neuron. 32, 415-424 (2001).</li><li>Petrella, L. N., Smith-Leiker, T., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ovhts+polyprotein+is+cleaved+to+produce+fusome+and+ring+canal+proteins+required+for+Drosophila+oogenesis.">The Ovhts polyprotein is cleaved to produce fusome and ring canal proteins required for Drosophila oogenesis.</a> Development. 134, 703-712 (2007).</li><li>Pielage, J., Bulat, V., Zuchero, J. B., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hts/Adducin+controls+synaptic+elaboration+and+elimination.">Hts/Adducin controls synaptic elaboration and elimination.</a> Neuron. 69, 1114-1131 (2011).</li><li>Spradling, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Berkeley+Drosophila+Genome+Project+gene+disruption+project:+Single+P-element+insertions+mutating+25%+of+vital+Drosophila+genes.">The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes.</a> Genetics. 153, 135-177 (1999).</li><li>Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+p21-Activated+Kinases.">Biology of the p21-Activated Kinases.</a> Annu Rev Biochem. 72, 743-781 (2003).</li><li>Bahri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+leading+edge+during+dorsal+closure+as+a+model+for+epithelial+plasticity:+Pak+is+required+for+recruitment+of+the+Scribble+complex+and+septate+junction+formation.">The leading edge during dorsal closure as a model for epithelial plasticity: Pak is required for recruitment of the Scribble complex and septate junction formation.</a> Development. 137, 2023-2032 (2010).</li><li>Albin, S. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+structural+and+functional+synapse+development:+postsynaptic+p21-activated+kinase+independently+specifies+glutamate+receptor+abundance+and+postsynaptic+morphology.">Coordinating structural and functional synapse development: postsynaptic p21-activated kinase independently specifies glutamate receptor abundance and postsynaptic morphology.</a> J Neurosci. 24, 6871-6879 (2004).</li><li>Koles, K., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+in+neuromuscular+junction+development.">Wnt signaling in neuromuscular junction development.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li><li>Packard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+Wnt,+wingless,+provides+an+essential+signal+for+pre-+and+postsynaptic+differentiation.">The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation.</a> Cell. 111, 319-330 (2002).</li><li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays:+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox.">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Rev Proteomics. 7, 401-409 (2010).</li><li>Thymiakou, E., Episkopou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+signaling+effector-complexes+downstream+of+bmp4+using+PLA,+a+proximity+ligation+assay.">Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li><li>Maglione, M., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+forest+tree+by+tree:+super-resolution+light+microscopy+meets+the+neurosciences.">Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences.</a> Nat Neurosci. 16, 790-797 (2013).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biol. Open. 3 (12), 1196-1206 (2014).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

דו&quot;ח זה מדגים כיצד ניתן ליישם PLA לתסיסנית הזחל NMJ. Assay מבוצע על הכנות שריר קיר גוף זחל לצורך איתור אינטראקציות חלבון-חלבון אנדוגני נוכחים בNMJ. בעזרת טכניקה זו, DLG וHTS מוצגים להיות בסמיכות זה לזה, ובכך קיימים במתחם, במיוחד באזור postsynaptic 27. בתמיכה של תוצאה זו, מח?...

תסיסנית דיסקים גדולים (DLG) הוא חבר של המשפחה שמורה kinase guanylate קרום הקשורים פיגומי חלבונים המסייעים לתזמר את ההרכבה של קומפלקסי חלבונים גדולים באתרים ספציפיים של קרום הפלזמה. זוהה במקור כחלבון מדכא סרטן, DLG משמש כגורם חשוב 1,2,3 קוטביות apicobasal אפיתל. DLG משמש גם כמודול פיגומים גדול בצומת העצבית-שהרירית (NMJ) של הנוירונים מוטוריים glutamatergic במהלך התפתחות זחל 4. DLG משחק תפקידים מגוונים בNMJ הזחל, וpleiotropism מסתמך על יכולתו לקשר עם חלבונים מרובים 5,6. חלבון אחד כזה הוא שאו הו-לי טאי (HTS), homologue לadducins היונקים שתוארו בעיקר בכל הקשור לתפקידם בויסות תקטין spectrin שלד תא 7. זה בעבר הוכח כי DLG וHTS יכולים ליצור קומפלקס אחד עם השני על בסיס במבחנה </em&gt; שיתוף immunoprecipitation ניסויים מעורבים lysates לטוס כל המבוגר 8. חסרון אחד של תוצאות אלה, עם זאת, הוא שהם לא מציינים היכן צורות מורכבות זו. עם השימוש באימונוהיסטוכימיה, ההפצות של DLG וHTS הם נצפו לחפיפה בקרום postsynaptic של NMJs זחל, אבל הם במתחם באזור זה 8? כפי שניתן לראות לאחרונה ומפורט יותר כאן, הקירבה קשירת Assay (PLA) משמש כדי לחפש בשיתוף אתרו בין DLG וHTS במיוחד בNMJ זחל 27. PLA הוא טכניקה חדשה יחסית המשמשת בעיקר בתרבית תאים ורקמות שיכולות לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון באתר 9. ב assay זה, נוגדנים עיקריים נגד שני החלבונים של עניין מזוהים עם זוג של נוגדנים משני מינים ספציפיים, המכונה בדיקות PLA, אשר מצומדת לoligonucleotides (איור 1 א &#39;, ב&#39;). אם שני החלבוניםים נמצא בסמיכות זה לזה (כלומר בתוך כמה עשרות ננומטרים), ניתן לגשר על המרחק בין בדיקות PLA המצורפות באמצעות הכלאה של שני oligonucleotides נוסף מחבר (איור 1 ג). בקונפורמציה זו, מסתיימת ללא oligonucleotides המחבר קרוב מספיק כדי ליצור קשר אחד עם השני, ומולקולת DNA מעגלית סגורה יכולה להיווצר עליו בקשירה באתרו (1D איור). מולקולת ה- DNA המעגלית משמשת כתבנית באתר הגברה המעגל מתגלגל, אשר ערוכה על ידי אחד מoligonucleotides המוצמד לבדיקות PLA (איור 1E). רצפים בתוך מוגבר מוצר ה- DNA וכתוצאה מכך, concatemeric אז יכולים להיות דמיינו עם, בדיקות שכותרתו fluorescently משלימות oligonucleotide (איור 1F). מאז DNA המוגבר נשאר מחובר לאחד מבדיקות PLA, לוקליזציה subcellular של withi האינטראקציה בין חלבוניםרקמת na אפשר ללמוד בקלות. כמה שיטות משמשות בדרך כלל כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון כוללים בטכניקות חוץ גופית כגון שיתוף immunoprecipitation, הנפתח מבחני והקרנת שתי היברידית שמרים, ובטכניקות vivo כגון העברת פורסטר תהודה אנרגיה (סריג) וbimolecular פלואורסצנטי שלמה ( BiFC). מלכודת של הטכניקות במבחנה היא שהם אינם מזדהים בו האינטראקציה מתרחשת באופן אנדוגני, בעוד vivo טכניקות האמורות בלערב את הביטוי המלאכותי של חלבוני היתוך שעלול שלא לשקף התנהגות יליד עמיתי אנדוגני. אחד יתרונות עיקריים של PLA הוא שהוא מסוגל לקבוע בתוך רקמת לוקליזציה subcellular של interactors חלבון אנדוגני שנמצאים בסמיכות זה לזה, וסביר להניח להרכיב מורכב, עם מידת הקרבה הדרושה כדי ליצור אות להיות דומה לFRET וBiFC. PLA יכול לזהות אינטראקציות עם סגוליות גבוהות ורגישות בשל הצימוד של הכרת נוגדן והגברת DNA. לפיכך, assay יכול ליצור אותות בדידים, בהירים בצורה של puncta החושפות את עמדתה של האינטראקציה המדויקת. בנוסף, ניתן לאתר אנטיגנים בקושי נראים לעין. לבסוף, PLA הוא טכניקה פשוטה יחסית לביצוע, וזה לוקח לא יותר מהליך immunohistochemical סטנדרטי כדי להשלים. לכן, PLA מספק יתרון טכני על מבחני אינטראקציה אחרים חלבון-חלבון שלעתים קרובות נגועים בזמני הכנה ארוכים ופתרון בעיות נרחבות. פרוטוקול זה מדגים כיצד ניתן ליישם PLA לתסיסנית הזחל NMJ לצורך איתור אינטראקציות חלבון-חלבון אנדוגני באתר. כאן, PLA מבוצע על הכנות שריר זחל קיר גוף שבו DLG וHTS מוצגים לאכן מתקיימים במתחם באזור postsynaptic של NMJs. PLA לא היה בשימוש בעבר כדי ללמוד את NMJ הזחל, ויש כיום רק קומץ של מאמרים שפורסמו שהשתמשו assay זה ברקמת דרוזופילה. יש לקוות כי חשיפה נוספת של PLA לקהילת תסיסנית תגרום שימוש ככלי נוסף הגדיל אותו כדי להשלים את מבחני אחרים, נפוצים יותר חלבונים אינטראקציה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="630">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:211px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:120px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:191px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:211px;">Forceps (fine #5)</td>
			<td style="width:120px;">Almedic</td>
			<td>A10-704</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:211px;">Sylgard Disc</td>
			<td style="width:120px;">World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td style="width:191px;">Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60x15mm petri dish lid when dissecting.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter)</td>
			<td style="width:120px;">Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">Microdissection Scissors (ultra fine)</td>
			<td style="width:120px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:111px;">15200-00</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;width:211px;">Platform Slides</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Glue two 22x22mm coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a &#60;20mm gap in between for sample mounting.</td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;width:211px;">w1118</td>
			<td style="width:120px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:111px;">3605</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;width:211px;">hts01103</td>
			<td style="width:120px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:111px;">10989</td>
			<td style="width:191px;">Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal.</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7.0</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Bouin&#39;s Solution</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">HT10132</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="114">
			<td height="114" style="height:114px;width:211px;">4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">PFA (Anachemia Science - 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">BSA (Bioshop Canada - ALB001). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">mouse anti-Dlg (Discs large)</td>
			<td style="width:120px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>4F3</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:10 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao)</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">rabbit anti-Pak (p21-activated kinase)</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">mouse anti-Wg (Wingless)</td>
			<td style="width:120px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:111px;">4D4</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:5 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase)</td>
			<td style="width:120px;">Jackson&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ImmunoResearch</td>
			<td style="width:111px;">123-065-021</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">FITC-conjugated donkey anti-goat</td>
			<td style="width:120px;">Jackson&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ImmunoResearch</td>
			<td style="width:111px;">705-095-003</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO92004</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO92002</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ Detection Reagents Red</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92008</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">1x Wash Buffer A: 0.01M Tris, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82049</td>
			<td style="width:191px;">Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">1x Wash Buffer B: 0.2M Tris, 0.1M NaCl, pH 7.5</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82049</td>
			<td style="width:191px;">Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">0.01x Wash Buffer B: 2mM Tris, 1mM NaCl, pH 7.5</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82049</td>
			<td style="width:191px;">Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82040</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of in situ protein-protein complexes at the drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

בNMJs זחל instar השלישי wild-type, DLG נמצא ברובה בקרום postsynaptic של boutons glutamatergic אני סוג, עם רמות immunoreactivity DLG להיות בולטות יותר בboutons Ib סוג מהסוג האם boutons (איור 3 א) 4. HTS נוכח לאורך כל השרירים, אבל מתרכז באזור postsynaptic עם רמות immunoreactivity HTS מופיעות זהות בשני סוגים אני boutons, והו?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

פרוטוקול זה מדגים כיצד סמיכות קשירת Assay יכול לשמש כדי לזהות באינטראקציות חלבון-חלבון אתרו בצומת העצבית-שרירית זחל תסיסנית. בעזרת טכניקה זו, שאו טאי גדול והו-לי דיסקים מוצגים בצורה מורכבת באזור postsynaptic, עמותה זוהתה בעבר באמצעות שיתוף immunoprecipitation.

זיהוי של<em&gt; באתר</em&gt; מכלולי חלבון-חלבון ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuromuscular צומת שימוש סמיכות קשירת Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

detection-situ-protein-protein-complexes-at-drosophila-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

13.0K Views.  Simon Fraser University.  פרוטוקול זה מדגים כיצד סמיכות קשירת Assay יכול לשמש כדי לזהות באינטראקציות חלבון-חלבון אתרו בצומת העצבית-שרירית זחל תסיסנית. בעזרת טכניקה זו, שאו טאי גדול והו-לי דיסקים מוצגים בצורה מורכבת באזור postsynaptic, עמותה זוהתה בעבר באמצעו?...

Video: Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

תמונה רציפה-הלבנה להתוות תאי שווא יחידים בצומת Neuromuscular

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

ניתוח פונקציונלי של מעגל האכלת הזחל ב דרוזופילה</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. Structural changes at the NMJ can result in neurotransmission failure, resulting in weakness, atrophy and even death of the muscle fiber. Many studies have investigated how genetic modifications or disease can alter the structure of the mouse NMJ. Unfortunately, it can be difficult to directly compare findings from these studies because they often employed different parameters and analytical methods. Three protocols are described here. The first uses maximum intensity projection confocal images to measure the area of acetylcholine receptor (AChR)-rich postsynaptic membrane domains at the endplate and the area of synaptic vesicle staining in the overlying presynaptic nerve terminal. The second protocol compares the relative intensities of immunostaining for synaptic proteins in the postsynaptic membrane. The third protocol uses Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to detect changes in the packing of postsynaptic AChRs at the endplate. The protocols have been developed and refined over a series of studies. Factors that influence the quality and consistency of results are discussed and normative data are provided for NMJs in healthy young adult mice.

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

Neuromuscular צומת: גודל סינפסה מדידה, שינויי פיצול ובצפיפות חלבון Synaptic שימוש Confocal מיקרוסקופ פלואורסצנטי

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

למה כימות Matters: אפיון פנוטיפים בבית<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחל Neuromuscular צומת

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

מדידת פונקציונליות צומת עצב-שריר

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ), a well-established model for glutamatergic synapses, has been extensively studied for decades. Identification of mutations causing NMJ morphological defects revealed a repertoire of genes that regulate synapse development and function. Many of these were identified in large-scale studies that focused on qualitative approaches to detect morphological abnormalities of the Drosophila NMJ. A drawback of qualitative analyses is that many subtle players contributing to NMJ morphology likely remain unnoticed. Whereas quantitative analyses are required to detect the subtler morphological differences, such analyses are not yet commonly performed because they are laborious. This protocol describes in detail two image analysis algorithms "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", available as Fiji-compatible macros, for quantitative, accurate and objective morphometric analysis of the Drosophila NMJ. This methodology is developed to analyze NMJ terminals immunolabeled with the commonly used markers Dlg-1 and Brp. Additionally, its wider application to other markers such as Hrp, Csp and Syt is presented in this protocol. The macros are able to assess nine morphological NMJ features: NMJ area, NMJ perimeter, number of boutons, NMJ length, NMJ longest branch length, number of islands, number of branches, number of branching points and number of active zones in the NMJ terminal.

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two image analysis algorithms, "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" were created, to automatically quantify nine morphological features of the Drosophila neuromuscular junction (NMJ).

שני אלגוריתמים עבור תפוקה גבוהה וכימות Multi-פרמטרית של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; מורפולוגיה צומת Neuromuscular

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

Assay רומן עבור הקרה Nociception ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

מוקד Macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מצומת דרוזופילה Neuromuscular זחל

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The well characterized larval neuromuscular junction is often used for such studies. However, rapid larval development followed by muscle histolysis and nervous system remodeling during metamorphosis makes this model problematic for the study of slow age-dependent degenerative changes like those occurring in amyotrophic lateral sclerosis. Alternatively, adult flies live for 90 days and the adult leg can be used to study motor neuron changes over the course of adult lifespan using in vivo fluorescent imaging through the cuticle. Here, we describe a leg dissection technique coupled with immunocytochemistry, which allows for the study of molecular changes at the neuromuscular junction of identified adult leg motor neurons. These techniques can be coupled with a myriad of antibodies labeling both pre- and post-synaptic structures. Together these procedures allow a more complete characterization of slow age-dependent changes in adult flies and can be applied across multiple motor neuron disease models.

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

We describe a dissection technique that preserves the architecture of the neuromuscular junction and enables a detailed immunocytochemical study of motor neurons in the adult Drosophila leg.

ניתוח ואימונוהיסטוכימיה של הרגל הבוגרת של דרוסופילה לזיהוי שינויים בצומת הנוירו-שרירי עבור נוירון מוטורי מזוהה

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting the expression of G protein-coupled receptors (GPCRs). Formalin-fixed jugular-nodose ganglia were processed with the RNAscope technology to simultaneously detect the expression of two representative GPCRs (cholecystokinin and ghrelin receptors) in combination with one marker gene of either nodose (paired-like homeobox 2b, Phox2b) or jugular afferent neurons (PR domain zinc finger protein 12, Prdm12). Labeled ganglia were imaged using confocal microscopy to determine the distribution and expression patterns of the aforementioned transcripts. Briefly, Phox2b afferent neurons were found to abundantly express the cholecystokinin receptor (Cck1r) but not the ghrelin receptor (Ghsr). A small subset of Prdm12 afferent neurons was also found to express Ghsr and/or Cck1r. Potential technical caveats in the design, processing, and interpretation of multiplex ISH are discussed. The approach described in this article may help scientists in generating accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

Multiplex in situ hybridization (ISH) was employed to simultaneously visualize the transcripts for two G protein-coupled receptors and one transcription factor in the entire vagal ganglionic complex of the adult mouse. This protocol could be used to generate accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

זיהוי של ביטוי קולטן מצמיד חלבון G בנוירונים Afferent עכבר Vagal באמצעות מולטיפלקס בהכלאה במקום

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...