Wir danken dem Bloomington Drosophila Stock Center für die Bereitstellung von Flug Aktien. Wir danken auch den Entwicklungs Studies Hybridoma Bank und Dr. Lynn Cooley (Yale University) für die Bereitstellung von Antikörpern. Ein besonderer Dank geht an AhHyun Yoo für ihre Hilfe zum Manuskript. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus den Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council of Canada (Krieger), die William und Ada Isabelle Steel Fund (Krieger) und der kanadischen Institutes of Health Research (Harden) unterstützt.

1. Körper Wand Vorbereitung HINWEIS: Herstellung der dritten Larvenlarvenkörperwände (zum Studium der NMJs die die Körperwand Muskeln innervieren) wurde durchgeführt, wie zuvor in Brent et al 10 oder Ramachandran und Budnik 11,12 beschrieben, jedoch mit einigen Modifikationen.. <ol><li> Präparation <ol><li> Heben fly Aktien und Kreuzen bei 25 ° C für fünf bis sechs Tage nach Standardverfahren 13. </li><li> Wählen Sie kriechen dritten Larvenstadium von Fläschchen oder Flaschen mit feinen Pinzette. </li><li> Der Larven in eine kleine Petrischale gegeben, die Phosphatpuffer-Saline (PBS), um Essensreste zu entfernen waschen. </li><li> Legen Sie eine einzelne Larve auf eine Sylgard Scheibe und tauchen Sie es in ein paar Tropfen eiskaltem PBS. Mit eiskaltem PBS wird dazu beitragen, zu betäuben die Larve dass es leichter zu manipulieren. Während der gesamten Präparation zu gewährleisten, dass das Präparat immer in PBS eingetaucht, um ein Austrocknen zu verhindern. </li><li> Positionieren Sie den larva mit seiner Rückenseite nach oben, so dass die beiden Luftröhrenwege unter einem Präpariermikroskop (2A) sichtbar sind. Mit der Pinzette eine minutien Stift zu greifen, Pin die Larve sich am hinteren Ende in der Nähe der Luftlöcher (2B). Mit einem anderen Stift, durchbohren durch die Kutikula am vorderen Ende in der Nähe der Mundhaken. Sanft dehnen die Larve der Länge nach, dann stecken Sie es nach unten (2B). </li><li> Mit Mikrodissektion Schere, klemmen Sie das hintere Ende in der Nähe des Stiftes, um eine kleine Öffnung zu schaffen. Der Schnitt sollte oberflächlich genug, nur durch die Kutikula passieren. </li><li> Dass sich die Spitze der unteren Klinge der Schere in den Einschnitt entlang der gesamten Länge der Rückenmittellinie zwischen den beiden Luftröhrenbahnen (2C) zu schneiden. Richten Sie die Scherenblätter leicht nach oben beim Schneiden um eine Beschädigung der ventralen Körperwand Muskeln. </li><li> Machen Sie eine kleine horizontaler Schnitt leicht anterioren zur Posteriorly platzierten Stift (2C). Stellen Sie einen anderen ähnlichen Schnitt etwas nach vorne platzierten Stift (2C) posterior. Die Schnitte sollten nur durch die Kutikula weiterzugeben. HINWEIS: Die drei Schnitte aus den Schritten 1.1.7 und 1.1.8 in Kombination sollte ein ähnlich &quot; <img fo:content-width="0.09in" src="/files/ftp_upload/52139/52139_letter_I.jpg" width="15px" /> &quot;Wenn sie abgeschlossen sind, das heißt, eine linke und rechte Klappe auf der dorsalen Seite der Larvenkörper hergestellt werden soll. </li><li> Sorgfältig reinigen, die inneren Organe mit der Zange. Hinzufügen von ein paar kräftigen Tropfen PBS helfen verdrängen die Organe aus dem Larvenkörper, wodurch es einfacher, sie zu entfernen. Vermeiden Sie stoßen die Larven Körper, wie es zu Schäden an der Körperwand Muskeln führen. </li><li> Rollen Sie das Larvenkörpers offen und stecken Sie die Ecken nach unten (2D). Wenn Pinning, strecken den Körper Wand horizontal und vertikal, um eine gleichmäßige spannte Rechteck bilden (see 2G für die Form), kümmert sich nicht um die Körperwand Muskeln in den Prozess zu reißen. </li><li> Beenden Sie entfernen alle verbleibenden inneren Organe (2E). </li></ol></li><li> Fixierung und Permeabilisierung <ol><li> Tauchen Sie die fixierten Körperwände in mehrere Tropfen Bouin-Lösung. Inkubieren für 15 Minuten auf Eis. Alternativ können Sie auch 4% Paraformaldehyd (PFA) als Alternative Haarfestiger; Inkubation 30 Min. </li><li> Dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit Triton (PBT) zu spülen. </li><li> Mit einer feinen Pinzette vorsichtig die Stifte zu entfernen und die Körperwände durch ihre Ecken in eine silikonisierte 0,65 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Bewahren Sie die Körperwände in PBT bei 4 ° C, bis sie für PLA. Für optimale Ergebnisse, starten Sie eine Immunfärbung der Körperwände innerhalb eines Tages oder zwei der Dissektion. ANMERKUNG: Um auf Reagenzien zu sparen und um sicherzustellen, daß alle Körperwände gleichmäßig während des Assays behandelt wird, kann unterschiedlichen Genotypen in einer einzigen gelegt werdenRohr. Genotypen können durch Abschneiden der Ecken der Körperwände unterschiedlich (siehe 2F für Beispiele) unterschieden werden. </li></ol></li></ol> 2. Immunhistochemie HINWEIS: Immunfärbung von dritten Larvenlarvenkörperwänden wurde durchgeführt, wie zuvor in Brent et al 14 und Ramachandran und Budnik 11 beschrieben, jedoch mit einigen Modifikationen 11,14.. HINWEIS: Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur und unter leichtem Schütteln sofern nicht anders angegeben. <ol><li> Blockierung <ol><li> Dreimal für jeweils 10 min Waschen Sie die Körperwände mit PBT. </li><li> Blockieren mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) für 1 Stunde. </li></ol></li><li> Immunfärbung <ol><li> Die Körperwände mit Mäusen und Kaninchen primären Antikörper gegen die beiden Proteine ​​von Interesse Inkubieren für 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C (in 1% BSA verdünnt). In diesem Fall verwenden 1.10 Maus-Anti-Dlg und 1: 250 Kaninchen einnti-HtsM 15,16. Antikörper gegen Marker, die nicht in der Maus oder Kaninchen hergestellt werden, können ebenfalls enthalten sein - zB Verwenden von 1: 200 Ziege-Anti-HRP, um die neuronalen Membranen abzugrenzen. </li><li> Für jede 10 Minuten abwaschen mit PBT dreimal. </li><li> Inkubieren mit Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper, die Markierungen (in 1% BSA verdünnt) 2 Stunden lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C zu erkennen. Als die PLA-Signal wird später mit einem roten Fluoreszenzfarbstoff sichtbar gemacht, muss ein anderer Fluorophore verwendet werden, um den Marker zu erfassen - zB verwenden 1: 200 FITC-konjugiertem Anti-Ziege, die Ziege-Anti-Hrp Antikörper nachzuweisen. Durch die Verwendung von lichtempfindlichen Reagenzien, halten die Rohre in der Dunkelheit ab diesem Zeitpunkt. HINWEIS: Der Kit, der verwendet wird, ermöglicht die PLA zwischen primären Antikörpern in Mäusen und Kaninchen durchgeführt werden, erhöht, wobei das Signal auf dem roten Kanal unter konfokale Mikroskopie sichtbar gemacht. Auf Wunsch sind weitere Kits zur Verfügung, die der Test mit prima durchgeführt werden könnenry Antikörper in anderen Spezies gezüchtet, und das Signal auf anderen Kanälen sichtbar gemacht. </li></ol></li></ol> 3. Proximity Ligation Assay HINWEIS: Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur und unter leichtem Schütteln sofern nicht anders angegeben. <ol><li> PLA Probes <ol><li> Dreimal für jeweils 10 min Waschen Sie die Körperwände mit PBT. </li><li> Inkubieren mit PLA-Sonden (1: 5-Verdünnung jeder in 1% BSA) für 2 Stunden bei 37 ° C. In diesem Fall verwenden 40 ul der PLA-Sonde-anti-Maus MINUS 40 ul PLA-Sonde-anti-Kaninchen PLUS und 120 ul 1% BSA, um die richtige Eintauchen und Mischen von 5-10 Körperwände zu gewährleisten. Bis zu einer 1:25 Verdünnung der PLA-Sonden können weiterhin in einer ausreichenden Signal-zu-Rausch-Verhältnis (dh bei diesem Experiment) führen. </li></ol></li><li> Ligation <ol><li> Die Körperwände mit Waschpuffer A für 5 Minuten jeweils zweimal waschen. </li><li> Inkubation mit Ligation-Lösung (1.40 Verdünnung Ligase in Ligationspuffer) für 1 Stunde eint 37 ° C. In diesem Fall arbeitet man mit 5 ul Ligase, 40 ul 5 Ligationspuffer und 155 &amp; mgr; l von hochreinem Wasser, um das richtige Eintauchen und das Vermischen von 5-10 Körperwände zu gewährleisten. </li></ol></li><li> Verstärkung <ol><li> Die Körperwände mit Waschpuffer A für 2 min je zweimal waschen. </li><li> Inkubieren mit Verstärkungslösung (1:80 Verdünnung von Polymerase in Amplifikationspuffer) für 2 h bei 37 ° C. In diesem Fall verwenden 2,5 ul Polymerase, 40 ul 5 Verstärkung Puffer und 157,5 ul von hochreinem Wasser, um die richtige Eintauchen und Mischen von 5-10 Körperwände gewährleisten. </li></ol></li><li> Vorbereitung für Imaging <ol><li> Die Körperwände mit Waschpuffer B 10 min je zweimal waschen. </li><li> Mit 0,01x Waschpuffer B einmal für 1 min waschen. </li><li> Äquilibrieren in einigen Tropfen Befestigungslösung für mindestens 30 min vor der Montage, oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Mit einer feinen Pinzette vorsichtig die Körperwände übertragen auf eine Plattform Schiebe with ihre Nagelhaut nach unten. Positionieren der Körperwände in Reihen und in der gleichen Orientierung in ein oder zwei Tropfen mountant. Legen Sie eine 22 mm x 40 mm Deckglas über die Zubereitung dabei nicht um Luftblasen zu erzeugen, dann verschließen Sie die Folie mit klarem Nagellack. </li><li> Bewahren Sie die Folien im Dunkeln bei -20 ° C, bis sie zur konfokalen Abbildung. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieser Bericht zeigt, wie PLA kann dem Drosophila Larven NMJ angewendet werden. Der Test basiert auf Larvenkörper Wandmuskulatur, die zum Zwecke des Erfassens endogenen Protein-Protein-Wechselwirkungen an der NMJ vorliegenden geführt. Mit dieser Technik und dlg Hts sind gezeigt, um in enger Nähe zueinander sind, und somit in einem Komplex vorhanden sind, und zwar an der postsynaptischen Bereich 27. Zur Unterstützung dieses Ergebnis hat eine frühere Studie Beweise ihrer Verbindung mit den folgend...

Drosophila Discs groß (DLG) ist ein konserviertes Mitglied der membranassoziierten Guanylatkinase Familie von Gerüsten Proteine ​​dirigieren die Montage von großen Proteinkomplexen an spezifischen Stellen der Plasmamembran beitragen. Ursprünglich identifiziert als ein Tumorsuppressor-Protein dient Dlg einer wichtigen Determinante der epithelialen apicobasal Polarität 1,2,3. Dlg dient auch als eine Hauptgerüstmoduls an der neuromuskulären Verbindung (NMJ) der glutamatergen Motoneuronen im Larvenentwicklung 4. Dlg spielt verschiedene Rollen bei der Larven NMJ und seine Polyphänie beruht auf seiner Fähigkeit, mit mehreren Proteinen 5,6 assoziieren. Ein solches Protein ist Hu-li tai Shao (HTS), ein Homolog zu den Säuger adducins, die hauptsächlich in Bezug auf ihre Rolle bei der Regulation des Actin-Zytoskeletts Spektrin 7 beschrieben. Es wurde zuvor gezeigt, dass dlg Hts einen Komplex miteinander anhand von in vitro zu bilden </em&gt; Co-Immunopräzipitation Experimente, die gesamte erwachsene Fliege Lysate 8. Ein Nachteil dieser Ergebnisse ist jedoch, dass sie nicht anzeigen, wo diese komplexen Formen. Mit der Verwendung von Immunhistochemie, werden die Verteilungen und dlg Hts beobachtet, an der postsynaptischen Membran der Larven NMJs lappen, aber sie sind in einem Komplex in diesem Bereich 8? Wie kürzlich gezeigt und weiter hier beschrieben wird Proximity Ligation Assay (PLA) verwendet werden, um für eine in situ-Verbindung zwischen Dlg und Hts speziell auf die Larven NMJ 27 aussehen. PLA ist eine relativ neue Technik, vor allem in der Zell- und Gewebekultur, die Protein-Protein-Wechselwirkungen in situ 9 erkennen kann. In diesem Assay werden primäre Antikörper gegen die beiden Proteine ​​von Interesse mit einem Paar von artspezifischen sekundären Antikörper nachgewiesen, genannt PLA-Sonden, die an Oligonucleotide konjugiert sind (1A, B). Wenn die zwei Proteins sind in unmittelbarer Nähe zueinander befinden (dh innerhalb von wenigen zehn Nanometern), wobei der Abstand zwischen den angebrachten PLA Sonden können durch Hybridisierung von zwei zusätzlichen Anschluß Oligonukleotide (1C) überbrückt werden. In dieser Konformation sind die freien Enden der Stecker Oligonukleotide nahe genug, um einen Kontakt miteinander herzustellen, und einer geschlossenen, ringförmigen DNA-Molekül kann auf in situ-Ligation (1D) ausgebildet werden. Die kreisförmige DNA-Molekül als Matrize für die in situ Wälzkreis Verstärkung, die durch eines der Oligonukleotide an die PLA-Sonden (1E) konjugiert grundiert wird. Sequenzen innerhalb der resultierenden amplifizierten, konkatemeren DNA-Produkt kann dann mit fluoreszenzmarkierten, komplementär Oligonukleotidsonden (1F) visualisiert werden. Da die amplifizierte DNA bleibt an einer der PLA-Sonden, die subzelluläre Lokalisierung des Protein-Protein-Wechselwirkung withi befestigtna Gewebe kann leicht festgestellt werden. Mehrere Verfahren sind häufig verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu erkennen, einschließlich In-vitro-Verfahren, wie Co-Immunopräzipitation, Pulldown-Assays und Hefe-Zwei-Hybrid-Screening, und in-vivo-Techniken, wie Förster Resonance Energy Transfer (FRET) und Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation ( BIFC). Ein Problem der in-vitro-Techniken ist, dass sie nicht erkennen, wo die Wechselwirkung endogen vorkommenden, während die zuvor erwähnten in vivo Techniken beinhalten die künstliche Expression von Fusionsproteinen, die das native Verhalten ihrer endogenen Gegen nicht reflektieren kann. Ein wesentlicher Vorteil der PLA ist, dass es in der Lage die Bestimmung innerhalb eines Gewebes die subzelluläre Lokalisation des endogenen Protein-Interaktoren, die in unmittelbarer Nähe zueinander sind, und wahrscheinlich ein Komplex gebildet ist, mit dem Näherungsgrad erforderlich, um ein Signal, das vergleichbar FR erzeugenET und BIFC. PLA kann Wechselwirkungen mit hoher Spezifität und Empfindlichkeit aufgrund der Kopplung der Antikörpererkennung und die DNA-Amplifikation nachzuweisen. So kann der Assay diskreten strahlend Signale in Form Pünktchen, die die exakte Position der Wechselwirkung offenbaren erzeugen. Außerdem kann kaum sichtbar Antigene nachgewiesen werden. Schließlich ist PLA eine relativ einfache Technik, um durchzuführen, und es nimmt nicht mehr als eine Standard-immunhistochemischen Verfahren abzuschließen. Daher stellt PLA einen technischen Vorteil gegenüber anderen Protein-Protein-Interaktionsassays, die oft mit langen Vorbereitungszeiten und umfangreiche Fehlersuche ein Problem dar. Dieses Protokoll zeigt, wie PLA kann dem Drosophila Larven NMJ zwecks Erfassen endogenes Protein-Protein-Wechselwirkungen in situ aufgebracht werden. Hier wird PLA auf Larvenkörperwand Muskel Zubereitungen, für Dlg und Hts erweisen sich in der Tat in einer Anlage sind im postsynaptischen Region NMJs geführt. PLA wurde zuvor nicht verwendet werden, um die Larven NMJ untersuchen, und es gibt derzeit nur eine Handvoll von publizierten Arbeiten, das diesen Assay in Drosophila Gewebe verwendet wurden. Es ist zu hoffen, daß eine weitere Belichtung der PLA zu dem Drosophila-Gemeinschaft wird der erhöhten Verwendung als zusätzliches Werkzeug führen zu anderen, üblicherweise verwendeten Protein-Protein Interaktionsassays ergänzen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="630">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:211px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:120px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:191px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:211px;">Forceps (fine #5)</td>
			<td style="width:120px;">Almedic</td>
			<td>A10-704</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:211px;">Sylgard Disc</td>
			<td style="width:120px;">World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td style="width:191px;">Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60x15mm petri dish lid when dissecting.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter)</td>
			<td style="width:120px;">Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">Microdissection Scissors (ultra fine)</td>
			<td style="width:120px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:111px;">15200-00</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;width:211px;">Platform Slides</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Glue two 22x22mm coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a &#60;20mm gap in between for sample mounting.</td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;width:211px;">w1118</td>
			<td style="width:120px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:111px;">3605</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;width:211px;">hts01103</td>
			<td style="width:120px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:111px;">10989</td>
			<td style="width:191px;">Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal.</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7.0</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Bouin&#39;s Solution</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">HT10132</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="114">
			<td height="114" style="height:114px;width:211px;">4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">PFA (Anachemia Science - 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">BSA (Bioshop Canada - ALB001). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">mouse anti-Dlg (Discs large)</td>
			<td style="width:120px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>4F3</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:10 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao)</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">rabbit anti-Pak (p21-activated kinase)</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">mouse anti-Wg (Wingless)</td>
			<td style="width:120px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:111px;">4D4</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:5 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase)</td>
			<td style="width:120px;">Jackson&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ImmunoResearch</td>
			<td style="width:111px;">123-065-021</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">FITC-conjugated donkey anti-goat</td>
			<td style="width:120px;">Jackson&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ImmunoResearch</td>
			<td style="width:111px;">705-095-003</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO92004</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO92002</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ Detection Reagents Red</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92008</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">1x Wash Buffer A: 0.01M Tris, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82049</td>
			<td style="width:191px;">Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">1x Wash Buffer B: 0.2M Tris, 0.1M NaCl, pH 7.5</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82049</td>
			<td style="width:191px;">Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">0.01x Wash Buffer B: 2mM Tris, 1mM NaCl, pH 7.5</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82049</td>
			<td style="width:191px;">Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82040</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of in situ protein-protein complexes at the drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

In Wildtyp dritten Larvenlarven NMJs wird Dlg überwiegend an der postsynaptischen Membran des Typs I glutamatergen Boutons gefunden, mit Dlg Immunreaktivität Ebenen sein ausgeprägter Typ Ib boutons als Typ Ist boutons (3A) 4. Hts ist im gesamten Muskel vorhanden, aber konzentriert sich an der postsynaptischen Region Hts Immunreaktivität Ebenen sowohl Typ I boutons gleich erscheinen und wird auch präsynaptisch gefunden (3A &#39;) 8,17. Beachten Sie, dass die Ve...

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Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Dieses Protokoll zeigt, wie Proximity Ligation Assay kann verwendet werden, um in situ Protein-Protein-Wechselwirkungen an der Drosophila Larvenneuromuskulären Verbindung nachzuweisen. Mit dieser Technik werden Discs großen und Hu-li tai Shao gezeigt, um einen Komplex an der postsynaptischen Region, eine Vereinigung die vorher durch Co-Immunpräzipitation identifiziert bilden.

Detektion<em&gt; In-situ-</em&gt; Protein-Protein-Komplexe bei der<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Neuromuskuläre Junction Mit Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

detection-situ-protein-protein-complexes-at-drosophila-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

13.0K Aufrufe.  Simon Fraser University.  Dieses Protokoll zeigt, wie Proximity Ligation Assay kann verwendet werden, um in situ Protein-Protein-Wechselwirkungen an der Drosophila Larvenneuromuskulären Verbindung nachzuweisen. Mit dieser Technik werden Discs großen und Hu-li tai Shao gezeigt, um einen Komplex an der postsynaptischen Region, eine Vereinigung die vorher durch Co-Immunpräzipitation identifiziert bilden. 