نشكر ذبابة الفاكهة مركز بلومينغتون المالية لتوفير مخزون الطاير. كما نشكر البنك دراسات الإنمائية هجين والدكتور لين كولي (جامعة ييل) لتوفير الأجسام المضادة. شكر خاص يذهب إلى AhHyun يو لمساعدتها على المخطوطة. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (كريجر)، ويليام وادا إيزابيل صندوق الصلب (كريجر)، والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة (هاردن).

1. الجسم إعداد ستريت تم تنفيذ إعداد الطور الثالث الجدران الجسم اليرقات (لدراسة لل NMJs التي يعصب عضلات جدار الجسم) كما هو موضح سابقا في برنت 10 آخرون، أو راماشاندران وBudnik 11،12، ولكن مع بعض التعديلات: ملاحظة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع مخزون الطاير والصلبان عند 25 درجة مئوية لمدة 5-6 أيام باستخدام الإجراءات القياسية 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار الزحف يرقات العمر الثالثة من قوارير أو زجاجات باستخدام ملقط غرامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل اليرقات في طبق بتري صغيرة تحتوي على الفوسفات عازلة المالحة (PBS) لإزالة أي جزيئات الطعام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع يرقة واحدة على قرص sylgard وتزج به في بضع قطرات من برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. باستخدام PBS الجليد الباردة سيساعد الصاعقة اليرقة مما يجعل من الاسهل للتلاعب. في جميع أنحاء تشريح، وضمان أن إعداد الغارقة دائما في برنامج تلفزيوني لمنعها من الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع لاوكالة الخطوط الجوية مع الجانب الظهري لها تواجه حتى أن اثنين من مساحات القصبة الهوائية مرئية تحت المجهر تشريح (الشكل 2A). باستخدام ملقط لفهم دبوس minutien، دبوس اليرقة إلى أسفل في نهاية الخلفي بالقرب من الفتحات التنفسية (الشكل 2B). مع دبوس آخر، يخترق من خلال بشرة في نهاية الأمامية بالقرب من السنانير الفم. تمتد برفق اليرقة خارج بالطول، ثم يعلقون عليه (الشكل 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص تسليخ مجهري، قرصة نهاية الخلفي بالقرب من دبوس لخلق فتحة صغيرة. يجب أن يكون شق سطحي يكفي لتمرير فقط من خلال بشرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع غيض من شفرة الجزء السفلي من مقص في شق، وقطع على طول على طول خط الوسط الظهرية بين اثنين من مساحات القصبة الهوائية (الشكل 2C). يشير ريش مقص صعودا طفيفا عند قطع لتجنب إتلاف بطني عضلات جدار الجسم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق صغير الأفقي الأمامي قليلا لمنصبدبوس وضعت eriorly (الشكل 2C). جعل شق آخر مماثل الخلفي قليلا إلى دبوس وضعت الأمامية (الشكل 2C). يجب أن الشقوق يمر من خلال بشرة. ملاحظة: شقوق ثلاثة من خطوات 1.1.7 و 1.1.8 مجتمعة يجب اشبه &quot; <img fo:content-width="0.09in" src="/files/ftp_upload/52139/52139_letter_I.jpg" width="15px" /> &quot;عند اكتماله، أي يجب أن تنتج رفرف اليسارية واليد اليمنى على الجانب الظهري من الجسم اليرقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف بعناية الأعضاء الداخلية مع ملقط. وإضافة بضع قطرات قوية من برنامج تلفزيوني مساعدة تهجير أجهزة خارج الجسم اليرقات، مما يجعل من الاسهل لإزالتها. تجنب بدس الجسم اليرقات لأنها سوف تسبب ضررا على عضلات جدار الجسم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فض الجسم اليرقات مفتوحة ويعلقون الزوايا أسفل (الشكل 2D). عندما تعلق، وتمتد جدار الجسم أفقيا ورأسيا لتشكيل المستطيل المتأزم بالتساوي (SEالبريد الشكل 2G للشكل)، مع الحرص على عدم المسيل للدموع عضلات جدار الجسم في هذه العملية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتهاء من إزالة أي الأعضاء الداخلية المتبقية (الشكل 2E). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تثبيت وPermeabilization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج الجدران الجسم معلقة في عدة قطرات من الحل بوان. احتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد. بدلا من ذلك، استخدم بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) باعتبارها تثبيتي بديل. احتضان لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف ثلاث مرات مع الفوسفات عازلة المالحة مع تريتون (PBT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط غرامة، وإزالة بعناية دبابيس ونقل الجدران الجسم عن طريق أركانها إلى siliconized و0.65 مل أنبوب microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين الجدران الجسم في PBT في 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة لجيش التحرير الشعبى الصينى. لأفضل النتائج، وبدء المناعية الجدران الجسم في خلال يوم أو يومين من تشريح. ملاحظة: لانقاذ على الكواشف وضمان أن يتم التعامل مع جميع الجدران الجسم بالتساوي أثناء الفحص، يمكن وضعها الأنماط الجينية المختلفة في واحدأنبوب. الأنماط الجينية يمكن تمييزها عن طريق خفض زوايا الجدران الجسم بطريقة مختلفة (انظر الشكل 2F للحصول على أمثلة). </li></ol></li></ol> 2. المناعية تم تنفيذ المناعية من الطور الثالث الجدران جسم اليرقات كما هو موضح سابقا في برنت وآخرون 14 و راماشاندران وBudnik 11، ولكن مع بعض التعديلات 11،14: ملاحظة. ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ومع الإثارة لطيف ما لم ينص على خلاف ذلك. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حجب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الجدران الجسم مع PBT ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منع مع 1٪ الأبقار مصل الزلال (BSA) لمدة 1 ساعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الجدران الجسم مع الماوس والأرنب الابتدائي أجسام مضادة ضد اثنين من البروتينات ذات الاهتمام (المخفف في 1٪ BSA) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة، أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. في هذه الحالة، استخدم 1:10 الماوس مكافحة DLG و 1: 250 أرنب لالمعهد القومي للاتصالات-HtsM 15،16. ويمكن أيضا أن يدرج الأجسام المضادة ضد علامات التي لا تتم في الماوس أو أرنب - على سبيل المثال، استخدم 1: 200 الماعز المضادة للبرنامج الصحة الإنجابية لتحديد أغشية الخلايا العصبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مع PBT ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية fluorophore مترافق للكشف عن علامات (المخفف في 1٪ BSA) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة، أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. وكما هو تصور إشارة PLA في وقت لاحق مع fluorophore أحمر، يجب استخدام fluorophore آخر للكشف عن علامة - على سبيل المثال، استخدم 1: 200 FITC مترافق مكافحة الماعز للكشف عن الماعز المضادة للHRP الأضداد. نظرا لاستخدام الكواشف الحساسة للضوء، والحفاظ على أنابيب في الظلام من هذه النقطة فصاعدا. ملاحظة: هذه المجموعة التي تستخدم تسمح لجيش التحرير الشعبى الصينى التي يتعين القيام بها بين الأجسام المضادة الأولية التي أثيرت في الماوس والأرانب، مع الإشارة تصور على القناة الحمراء تحت المجهر متحد البؤر. إذا رغبت في ذلك، هي مجموعات الأخرى المتاحة التي تسمح للفحص الذي يتعين القيام به مع الوجاهةالأجسام المضادة راي أثيرت في الأنواع الأخرى، وإشارة تصور على القنوات الأخرى. </li></ol></li></ol> 3. القرب ربط الفحص ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ومع الإثارة لطيف ما لم ينص على خلاف ذلك. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جيش التحرير الشعبى الصينى المسابر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الجدران الجسم مع PBT ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى (1: 5 تمييع كل في 1٪ BSA) لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية. في هذه الحالة، استخدم 40 ميكرولتر من جيش التحرير الشعبى الصينى التحقيق المضادة للماوس MINUS، 40 ميكرولتر من جيش التحرير الشعبى الصينى التحقيق المضادة للأرنب PLUS و 120 ميكرولتر من 1٪ BSA لضمان غمر السليم واختلاط 5-10 الجدران الجسم. حتى 1:25 التخفيف من تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى لا يزال يؤدي إلى وجود نسبة كافية إشارة إلى الضوضاء (أي لهذه التجربة). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رباط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الجدران الجسم مع الاحتياطي اغسل A مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع الحل ربط (01:40 التخفيف من يغاز العازلة في ربط) لمدة 1 ساعة لر 37 ° C. في هذه الحالة، استخدم 5 ميكرولتر من يغاز، 40 ميكرولتر من العازلة 5 ربط و 155 ميكرولتر من المياه عالية النقاء لضمان غمر السليم واختلاط 5-10 الجدران الجسم. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توسيع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الجدران الجسم مع الاحتياطي اغسل A مرتين لمدة 2 دقيقة لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع التضخيم الحل (1:80 التخفيف من البلمرة في المخزن التضخيم) لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية. في هذه الحالة، استخدم 2.5 ميكرولتر من البلمرة، 40 ميكرولتر من 5 التضخيم العازلة و157.5 ميكرولتر من المياه عالية النقاء لضمان غمر السليم واختلاط 5-10 الجدران الجسم. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد للتصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الجدران الجسم مع الاحتياطي اغسل B مرتين لمدة 10 دقيقة لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مع 0.01x الاحتياطي اغسل B مرة واحدة لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن في بضع قطرات من تصاعد الحل لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التركيب، أو تخزين بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط غرامة، ونقل بعناية الجدران الجسم على شريحة منصة ثإيث البشرة من أسفل. ضع الجدران الجسم في الصفوف وفي نفس الاتجاه داخل قطرة أو اثنتين من مرس. وضع 22 مم × 40 مم ساترة على إعداد مع الحرص على عدم توليد فقاعات الهواء، ثم ختم الشريحة مع طلاء الأظافر واضحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين الشرائح في الظلام في -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة للتصوير متحد البؤر. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Woods, D. F., Bryant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discs-large+tumor+suppressor+gene+of+Drosophila+encodes+a+guanylate+kinase+homolog+localized+at+septate+junctions.">The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions.</a> Cell. 66, 451-464 (1991).</li><li>Yamanaka, T., Ohno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Lgl/Dlg/Scribble+in+the+regulation+of+epithelial+junction,+polarity+and+growth.">Role of Lgl/Dlg/Scribble in the regulation of epithelial junction, polarity and growth.</a> Front Biosci. 13, 6693-6707 (2008).</li><li>Humbert, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+tumourigenesis+by+the+Scribble/Dlg/Lgl+polarity+module.">Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module.</a> Oncogene. 27, 6888-6907 (2008).</li><li>Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X. X., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+dlg+is+required+for+normal+synaptic+bouton+structure.">The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure.</a> Neuron. 13, 823-835 (1994).</li><li>Ataman, B., Budnik, V., Thomas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffolding+proteins+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Scaffolding proteins at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Int Rev Neurobiol. 75, 181-216 (2006).</li><li>Thomas, U., Kobler, O., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+larval+neuromuscular+junction+as+a+model+for+scaffold+complexes+at+glutamatergic+synapses:+benefits+and+limitations.">The Drosophila larval neuromuscular junction as a model for scaffold complexes at glutamatergic synapses: benefits and limitations.</a> J Neurogenet. 24, 109-119 (2010).</li><li>Matsuoka, Y., Li, X., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adducin:+structure,+function+and+regulation.">Adducin: structure, function and regulation.</a> Cell Mol Life Sci. 57, 884-895 (2000).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+adducin+regulates+Dlg+phosphorylation+and+targeting+of+Dlg+to+the+synapse+and+epithelial+membrane.">Drosophila adducin regulates Dlg phosphorylation and targeting of Dlg to the synapse and epithelial membrane.</a> Dev Biol. 357, 392-403 (2011).</li><li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45, 227-232 (2008).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+dissection.">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li><li>Ramachandran, P., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+staining+of+Drosophila+larval+body-wall+muscles.">Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).</li><li>Ramachandran, P., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Drosophila+larval+body-wall+muscles.">Dissection of Drosophila larval body-wall muscles.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Laboratory Manual. , (1989).</li><li>Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+immunohistochemistry.">Drosophila larval NMJ immunohistochemistry.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+postsynaptic+structure+and+protein+localization+by+the+Rho-type+guanine+nucleotide+exchange+factor+dPix.">Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix.</a> Neuron. 32, 415-424 (2001).</li><li>Petrella, L. N., Smith-Leiker, T., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ovhts+polyprotein+is+cleaved+to+produce+fusome+and+ring+canal+proteins+required+for+Drosophila+oogenesis.">The Ovhts polyprotein is cleaved to produce fusome and ring canal proteins required for Drosophila oogenesis.</a> Development. 134, 703-712 (2007).</li><li>Pielage, J., Bulat, V., Zuchero, J. B., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hts/Adducin+controls+synaptic+elaboration+and+elimination.">Hts/Adducin controls synaptic elaboration and elimination.</a> Neuron. 69, 1114-1131 (2011).</li><li>Spradling, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Berkeley+Drosophila+Genome+Project+gene+disruption+project:+Single+P-element+insertions+mutating+25%+of+vital+Drosophila+genes.">The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes.</a> Genetics. 153, 135-177 (1999).</li><li>Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+p21-Activated+Kinases.">Biology of the p21-Activated Kinases.</a> Annu Rev Biochem. 72, 743-781 (2003).</li><li>Bahri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+leading+edge+during+dorsal+closure+as+a+model+for+epithelial+plasticity:+Pak+is+required+for+recruitment+of+the+Scribble+complex+and+septate+junction+formation.">The leading edge during dorsal closure as a model for epithelial plasticity: Pak is required for recruitment of the Scribble complex and septate junction formation.</a> Development. 137, 2023-2032 (2010).</li><li>Albin, S. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+structural+and+functional+synapse+development:+postsynaptic+p21-activated+kinase+independently+specifies+glutamate+receptor+abundance+and+postsynaptic+morphology.">Coordinating structural and functional synapse development: postsynaptic p21-activated kinase independently specifies glutamate receptor abundance and postsynaptic morphology.</a> J Neurosci. 24, 6871-6879 (2004).</li><li>Koles, K., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+in+neuromuscular+junction+development.">Wnt signaling in neuromuscular junction development.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li><li>Packard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+Wnt,+wingless,+provides+an+essential+signal+for+pre-+and+postsynaptic+differentiation.">The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation.</a> Cell. 111, 319-330 (2002).</li><li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays:+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox.">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Rev Proteomics. 7, 401-409 (2010).</li><li>Thymiakou, E., Episkopou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+signaling+effector-complexes+downstream+of+bmp4+using+PLA,+a+proximity+ligation+assay.">Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li><li>Maglione, M., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+forest+tree+by+tree:+super-resolution+light+microscopy+meets+the+neurosciences.">Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences.</a> Nat Neurosci. 16, 790-797 (2013).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biol. Open. 3 (12), 1196-1206 (2014).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

يوضح هذا التقرير كيف PLA يمكن تطبيقها على ذبابة الفاكهة اليرقات NMJ. يتم تنفيذ الفحص على اليرقات جدار الجسم الاستعدادات العضلات لغرض الكشف عن الذاتية البروتين البروتين التفاعلات الحاضرة في NMJ. مع هذه التقنية، وتظهر DLG وHTS ليكون على مقربة من بعضها البعض، وبالتالي وج?...

ذبابة الفاكهة أقراص كبيرة (DLG) هو عضو الحفظ من guanylate كيناز الأسرة المرتبطة غشاء السقالات البروتينات التي تساعد في تنظيم جمعية مجمعات البروتين كبيرة في مواقع محددة من غشاء البلازما. حددت أصلا باعتبارها البروتين القامع الورم، ويخدم DLG كمقياس مهم من الظهارية apicobasal قطبية 1،2،3. يخدم أجهزة ... كذلك وحدة نمطية السقالات الرئيسية في الوصل العصبي العضلي (NMJ) من الخلايا العصبية الحركية glutamatergic خلال نمو اليرقات 4. أجهزة ... تلعب أدوارا متنوعة في NMJ اليرقات، ويعتمد تعدد النمط الظاهري على قدرته على ربط مع بروتينات متعددة 5،6. واحدة من هذه البروتين هو هو جين تاو لى شاو تاي (HTS)، ونديد إلى adducins الثدييات التي أساسا وصفت في ما يخص دورهم في تنظيم الأكتين-إسبكترن الهيكل الخلوي 7. وقد سبق يتبين أن DLG وHTS يمكن أن تشكل مجمع مع بعضها البعض على أساس في المختبر </م&gt; تجارب شارك في مناعي التي تنطوي على الكبار كله لست] ذبابة 8. عيب واحد من هذه النتائج، ومع ذلك، هو أنها لا تشير إلى هذا حيث أشكال معقدة. مع استخدام المناعية، ويلاحظ توزيعات DLG وHTS إلى التداخل في الغشاء بعد المشبكي من لل NMJs اليرقات، ولكن هل هم في مجمع في هذه المنطقة 8؟ كما هو مبين في الآونة الأخيرة وأكبر من التفصيل هنا، ويستخدم القرب ربط الفحص (PLA) للبحث عن وجود ارتباط بين الوضع الطبيعي DLG وHTS في خصيصا في اليرقات NMJ 27. جيش التحرير الشعبى الصينى هو تقنية جديدة نسبيا تستخدم في الغالب في الخلايا والأنسجة الثقافة التي يمكن الكشف عن البروتين البروتين التفاعلات في الموقع 9. في هذا الاختبار، يتم الكشف عن الأجسام المضادة الأولية ضد اثنين من البروتينات في المصالح مع زوج من الأجسام المضادة الثانوية أنواع محددة، ووصف تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى، والتي يتم تصريفها إلى أليغنوكليوتيد] (الشكل 1A، B). إذا كان البروتين اثنينالصورة هي على مقربة من بعضها البعض (أي في غضون بضع عشرات من نانومتر)، والمسافة بين تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى المرفقة يمكن سد من خلال التهجين اثنين من [أليغنوكليوتيد موصل إضافية (الشكل 1C). في هذا التشكل، وينتهي خالية من أليغنوكليوتيد] موصل قريبة بما فيه الكفاية لاجراء اتصالات مع بعضها البعض، وجزيء DNA دائرية مغلقة يمكن تشكيلها على ربط في الموضع (1D الشكل). يخدم جزيء DNA دائري كنموذج لفي الموقع التضخيم دائرة المتداول، والذي وتستعد قبل واحدة من [أليغنوكليوتيد مترافق إلى تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى (الشكل 1E). تسلسل داخل تضخيمها، والمنتج DNA concatemeric الناتجة عندئذ يمكن تصور مع fluorescently المسمى، تحقيقات قليل النوكليوتيد التكميلية (الشكل 1F). منذ يبقى تضخيم الحمض النووي تعلق على واحدة من تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى، وتوطين التحت خلوية من البروتين البروتين التفاعل داخلهاالأنسجة غ يمكن التأكد بسهولة. ويشيع استخدام عدة أساليب للكشف عن البروتين البروتين التفاعلات بما في ذلك تقنيات المختبر مثل شارك في مناعي، وسحب إلى أسفل المقايسات والخميرة فحص يومين الهجين، وتقنيات الجسم الحي مثل نقل فورستر الرنين الطاقة (الحنق) وثنائي الجزيء الإسفار التكملة ( BiFC). وشرك من التقنيات في المختبر هو أنها لا تعرف أين التفاعل يحدث التطور الطبيعي، في حين تشمل المذكورة آنفا في الجسم الحي تقنيات التعبير الاصطناعي من البروتينات الانصهار التي قد لا تعكس السلوك الأصلي من نظرائهم الذاتية. واحد الميزة الرئيسية لجيش التحرير الشعبى الصينى هو أنه قادر على تحديد داخل الأنسجة توطين التحت خلوية من interactors البروتين الذاتية التي هي على مقربة من بعضها البعض، ومن المرجح تشكيل المعقدة، مع درجة من التقارب المطلوب لتوليد إشارة يجري مقارنة لFRET وBiFC. PLA يمكن الكشف عن التفاعلات مع خصوصية عالية وحساسية نظرا لاقتران الاعتراف الأجسام المضادة والتضخيم DNA. وهكذا، يمكن فحص توليد منفصلة، ​​وإشارات مضيئة في شكل نقاط والتي تكشف عن الموضع الدقيق للتفاعل. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يتم الكشف عن المستضدات مرئية بالكاد. وأخيرا، جيش التحرير الشعبى الصينى هو تقنية بسيطة نسبيا على القيام بها، ويستغرق مدة لا تزيد على إجراء المناعى القياسية لإكمال. ولذلك، يوفر PLA ميزة الفنية اكثر من غيرها من المقايسات التفاعل البروتين البروتين التي غالبا ما تعاني من الأوقات إعداد طويلة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها واسعة النطاق. يوضح هذا البروتوكول كيف PLA يمكن تطبيقها على ذبابة الفاكهة اليرقات NMJ لغرض الكشف عن الذاتية البروتين البروتين التفاعلات في الموقع. هنا، يتم تنفيذ جيش التحرير الشعبى الصينى على اليرقات الاستعدادات العضلات جدار الجسم حيث يتم عرض DLG وHTS في الوجود الواقع في مجمع في المنطقة بعد المشبكي من لل NMJs. جيش التحرير الشعبى الصينى لم تستخدم سابقا لدراسة NMJ اليرقات، وهناك في الوقت الحاضر سوى عدد قليل من الأبحاث المنشورة التي استخدمت هذا الاختبار في الأنسجة ذبابة الفاكهة. ومن المؤمل أن مزيدا من التعرض لجيش التحرير الشعبى الصينى للمجتمع ذبابة الفاكهة سوف يؤدي إلى زيادة استخدامه كأداة إضافية لتكمل الأخرى، أكثر شيوعا البروتين البروتين المقايسات التفاعل.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="630">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:211px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:120px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:191px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:211px;">Forceps (fine #5)</td>
			<td style="width:120px;">Almedic</td>
			<td>A10-704</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:211px;">Sylgard Disc</td>
			<td style="width:120px;">World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td style="width:191px;">Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60x15mm petri dish lid when dissecting.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter)</td>
			<td style="width:120px;">Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">Microdissection Scissors (ultra fine)</td>
			<td style="width:120px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:111px;">15200-00</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;width:211px;">Platform Slides</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Glue two 22x22mm coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a &#60;20mm gap in between for sample mounting.</td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;width:211px;">w1118</td>
			<td style="width:120px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:111px;">3605</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;width:211px;">hts01103</td>
			<td style="width:120px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:111px;">10989</td>
			<td style="width:191px;">Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal.</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7.0</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Bouin&#39;s Solution</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">HT10132</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="114">
			<td height="114" style="height:114px;width:211px;">4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">PFA (Anachemia Science - 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">BSA (Bioshop Canada - ALB001). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">mouse anti-Dlg (Discs large)</td>
			<td style="width:120px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>4F3</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:10 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao)</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">rabbit anti-Pak (p21-activated kinase)</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">mouse anti-Wg (Wingless)</td>
			<td style="width:120px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:111px;">4D4</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:5 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase)</td>
			<td style="width:120px;">Jackson&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ImmunoResearch</td>
			<td style="width:111px;">123-065-021</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">FITC-conjugated donkey anti-goat</td>
			<td style="width:120px;">Jackson&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ImmunoResearch</td>
			<td style="width:111px;">705-095-003</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO92004</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO92002</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ Detection Reagents Red</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92008</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">1x Wash Buffer A: 0.01M Tris, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82049</td>
			<td style="width:191px;">Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">1x Wash Buffer B: 0.2M Tris, 0.1M NaCl, pH 7.5</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82049</td>
			<td style="width:191px;">Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">0.01x Wash Buffer B: 2mM Tris, 1mM NaCl, pH 7.5</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82049</td>
			<td style="width:191px;">Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82040</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of in situ protein-protein complexes at the drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

في البرية من نوع الطور الثالث لل NMJs اليرقات، وجدت DLG الغالب في الغشاء بعد المشبكي من نوع I حبات glutamatergic، مع مستويات مناعية DLG يجري أكثر وضوحا في نوع حبات إيب من نوع هل حبات (الشكل 3A) 4. HTS موجودة في جميع أنحاء العضلات ولكن يركز على المنطقة بعد المشبكي مع مستو...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

يوضح هذا البروتوكول كيف القرب ربط الفحص يمكن استخدامها للكشف في الموقع تفاعلات البروتين البروتين في ذبابة الفاكهة العصبي العضلي اليرقات تقاطع. مع هذه التقنية، وترد أقراص كبيرة وهو جين تاو لى شاو تاي لتشكيل مجمع في المنطقة بعد المشبكي، وهي جمعية التي سبق تحديدها من خلال المشاركة في مناعي.

الكشف عن<em&gt; في الموقع</em&gt; مجمعات البروتين البروتين في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقية الموصل العصبي العضلي عن طريق القرب ربط الفحص

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

detection-situ-protein-protein-complexes-at-drosophila-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

13.0K Views.  Simon Fraser University.  يوضح هذا البروتوكول كيف القرب ربط الفحص يمكن استخدامها للكشف في الموقع تفاعلات البروتين البروتين في ذبابة الفاكهة العصبي العضلي اليرقات تقاطع. مع هذه التقنية، وترد أقراص كبيرة وهو جين تاو لى شاو تاي لتشكيل مجمع في المنطقة بعد ال?...

Video: Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

تصور الأعصاب القطاعي اليرقات في 3 الثالثة طور مرحلي ذبابة الفاكهة التحضيرات اليرقات

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

في التصور المجراة من الحويصلات متشابك ضمن محاور عصبية ذبابة الفاكهة القطاعي اليرقات

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

تشريح والتصوير من المناطق النشطة في ذبابة الفاكهة الوصل العصبي العضلي

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

صور متتابعة تبيض لتحديد خلايا شوان واحدة عند تقاطع الاعصاب

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

لماذا الكمي المسائل: توصيف الظواهر في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات عصبي عضلي مفرق

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

قياس الأداء الوظيفي الوصلات العصبية العضلية

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ), a well-established model for glutamatergic synapses, has been extensively studied for decades. Identification of mutations causing NMJ morphological defects revealed a repertoire of genes that regulate synapse development and function. Many of these were identified in large-scale studies that focused on qualitative approaches to detect morphological abnormalities of the Drosophila NMJ. A drawback of qualitative analyses is that many subtle players contributing to NMJ morphology likely remain unnoticed. Whereas quantitative analyses are required to detect the subtler morphological differences, such analyses are not yet commonly performed because they are laborious. This protocol describes in detail two image analysis algorithms "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", available as Fiji-compatible macros, for quantitative, accurate and objective morphometric analysis of the Drosophila NMJ. This methodology is developed to analyze NMJ terminals immunolabeled with the commonly used markers Dlg-1 and Brp. Additionally, its wider application to other markers such as Hrp, Csp and Syt is presented in this protocol. The macros are able to assess nine morphological NMJ features: NMJ area, NMJ perimeter, number of boutons, NMJ length, NMJ longest branch length, number of islands, number of branches, number of branching points and number of active zones in the NMJ terminal.

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two image analysis algorithms, "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" were created, to automatically quantify nine morphological features of the Drosophila neuromuscular junction (NMJ).

اثنين من الخوارزميات لإنتاجية عالية ومتعدد حدودي الكمي ل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; عصبي عضلي مفرق الصرف

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

تسجيلات ماكروباتش المحورية للتيارات متشابك من الوصلات العصبية العضلية اليرقات المورفولوجية

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The well characterized larval neuromuscular junction is often used for such studies. However, rapid larval development followed by muscle histolysis and nervous system remodeling during metamorphosis makes this model problematic for the study of slow age-dependent degenerative changes like those occurring in amyotrophic lateral sclerosis. Alternatively, adult flies live for 90 days and the adult leg can be used to study motor neuron changes over the course of adult lifespan using in vivo fluorescent imaging through the cuticle. Here, we describe a leg dissection technique coupled with immunocytochemistry, which allows for the study of molecular changes at the neuromuscular junction of identified adult leg motor neurons. These techniques can be coupled with a myriad of antibodies labeling both pre- and post-synaptic structures. Together these procedures allow a more complete characterization of slow age-dependent changes in adult flies and can be applied across multiple motor neuron disease models.

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

We describe a dissection technique that preserves the architecture of the neuromuscular junction and enables a detailed immunocytochemical study of motor neurons in the adult Drosophila leg.

تشريح والكيمياء المناعية من الساق الكبار Drosophila للكشف عن التغيرات في تقاطع العصبية والعضلية لخلية عصبية محركية محددة

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting the expression of G protein-coupled receptors (GPCRs). Formalin-fixed jugular-nodose ganglia were processed with the RNAscope technology to simultaneously detect the expression of two representative GPCRs (cholecystokinin and ghrelin receptors) in combination with one marker gene of either nodose (paired-like homeobox 2b, Phox2b) or jugular afferent neurons (PR domain zinc finger protein 12, Prdm12). Labeled ganglia were imaged using confocal microscopy to determine the distribution and expression patterns of the aforementioned transcripts. Briefly, Phox2b afferent neurons were found to abundantly express the cholecystokinin receptor (Cck1r) but not the ghrelin receptor (Ghsr). A small subset of Prdm12 afferent neurons was also found to express Ghsr and/or Cck1r. Potential technical caveats in the design, processing, and interpretation of multiplex ISH are discussed. The approach described in this article may help scientists in generating accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

Multiplex in situ hybridization (ISH) was employed to simultaneously visualize the transcripts for two G protein-coupled receptors and one transcription factor in the entire vagal ganglionic complex of the adult mouse. This protocol could be used to generate accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

الكشف عن G البروتين إلى جانب مستقبلات التعبير في الخلايا العصبية Vagal الماوس Afferent باستخدام Multix في الموقع التهجين

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...