Nous remercions le Bloomington Drosophila Stock Center pour fournir des stocks de mouches. Nous remercions également le Hybridoma Banque études développementales et le Dr Lynn Cooley (Université de Yale) pour fournir des anticorps. Un merci spécial à AhHyun Yoo pour son aide sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions du Fonds acier Isabelle Ada (Krieger) Conseil de recherches en génie du Canada (Krieger) les sciences naturelles et le William et et les Instituts canadiens de recherche en santé (Harden).

1. Préparation du corps mur REMARQUE: Préparation du troisième stade larvaire parois du corps (par étude des NMJs qui innervent les muscles de la paroi du corps) a été réalisée comme décrit précédemment dans Brent et al dix, ou Ramachandran et Budnik 11,12, mais avec quelques modifications.. <ol><li> Dissection <ol><li> Augmenter les stocks et les croix mouche à 25 ° C pendant cinq à six jours en utilisant des procédures standard 13. </li><li> Choisissez ramper troisième stade larvaire de flacons ou bouteilles en utilisant une pince fine. </li><li> Laver les larves dans une petite boîte de Pétri contenant un tampon phosphate salin (PBS) pour éliminer les particules alimentaires. </li><li> Placez une seule larve sur un disque de Sylgard et la plonger dans quelques gouttes de PBS glacé. Utilisation de PBS glacé aidera étourdir la larve qui rend plus facile à manipuler. Tout au long de la dissection, veiller à ce que la préparation est toujours immergé dans du PBS pour l&#39;empêcher de sécher. </li><li> Placez le larva avec sa face dorsale orientée vers le haut de sorte que les deux secteurs de la trachée sont visibles sous un microscope à dissection (figure 2A). En utilisant les forceps pour saisir une broche de minuties, épingler la larve vers le bas à l&#39;extrémité postérieure près des stigmates (figure 2B). Avec une autre épingle, percer à travers la cuticule à l&#39;extrémité antérieure près de l&#39;embouchure crochets. Étirer doucement la larve sur la longueur, puis épingler le bas (figure 2B). </li><li> Avec des ciseaux de microdissection, pincez l&#39;extrémité postérieure près de la broche pour créer une petite ouverture. L&#39;incision doit être assez superficielle juste passer à travers la cuticule. </li><li> Mise en place de la pointe de la lame inférieure des ciseaux dans l&#39;incision, coupé le long de toute la longueur de la ligne médiane dorsale entre les deux voies trachéaux (figure 2C). Dirigez les lames de ciseaux légèrement vers le haut lors de la coupe pour éviter d&#39;endommager les muscles de la paroi ventrale du corps. </li><li> Faire une petite incision horizontale légèrement antérieur au posteeriorly broche placée (figure 2C). Faire une autre incision similaire légèrement postérieure à la broche antérieurement placé (figure 2C). Les incisions doivent simplement passer à travers la cuticule. NOTE: Les trois incisions des étapes 1.1.7 et 1.1.8 combinés devrait ressembler à un &quot; <img fo:content-width="0.09in" src="/files/ftp_upload/52139/52139_letter_I.jpg" width="15px" /> &quot;Une fois terminé, ce est à dire, un volet de gauche et de droite sur la face dorsale du corps de la larve devrait être produite. </li><li> Nettoyer soigneusement les organes internes avec la pince. Ajout de quelques gouttes de PBS énergiques aidera déplacer les organes du corps larvaire, rendant ainsi plus facile de les enlever. Évitez piquer le corps des larves car il risque d&#39;endommager les muscles de la paroi du corps. </li><li> Déroulez le corps des larves ouverte et épinglez les coins vers le bas (Figure 2D). Lorsque l&#39;épinglage, étirer la paroi du corps à la fois horizontalement et verticalement pour former un rectangle uniformément tendu (soie Figure 2G pour la forme), en prenant soin de ne pas déchirer les muscles de la paroi du corps dans le processus. </li><li> Terminer la suppression de tous les organes internes restants (figure 2E). </li></ol></li><li> Fixation et perméabilisation <ol><li> Plonger les parois du corps épinglés dans plusieurs gouttes de solution de Bouin. Incuber pendant 15 min sur la glace. Vous pouvez également utiliser paraformaldéhyde 4% (PFA) comme un autre fixateur; incuber pendant 30 min. </li><li> Rincer trois fois avec du tampon phosphate salin avec du Triton (PBT). </li><li> En utilisant des pinces fines, retirez soigneusement les broches et transférer les parois du corps par leurs coins en 0,65 ml microtube siliconé. </li><li> Conserver les parois du corps dans PBT à 4 ° C jusqu&#39;au moment de PLA. Pour des résultats optimaux, commencer immunocoloration les parois de la caisse dans un jour ou deux de dissection. REMARQUE: Pour enregistrer sur les réactifs et d&#39;assurer que tous les murs du corps sont traités de manière égale pendant l&#39;essai, différents génotypes peuvent être placés dans un seultube. Les génotypes peuvent être distingués en coupant les coins des parois de la caisse différemment (voir la figure 2F pour des exemples). </li></ol></li></ol> 2. immunohistochimie REMARQUE: Immunomarquage de troisième stade larvaire parois du corps a été effectuée comme décrit précédemment dans Brent et al 14 et Ramachandran et Budnik 11, mais avec quelques modifications 11,14.. REMARQUE: Effectuez toutes les étapes à la température ambiante et sous agitation douce, sauf indication contraire. <ol><li> Blocage <ol><li> Laver les parois du corps avec PBT trois fois pendant 10 minutes chacun. </li><li> Bloquer avec 1% de sérum-albumine bovine (BSA) pendant 1 heure. </li></ol></li><li> Immunocoloration <ol><li> Incuber les parois de la caisse avec la souris et le lapin primaires d&#39;anticorps contre les deux protéines d&#39;intérêt (dilué dans 1% de BSA) pendant 2 h à température ambiante, ou pendant une nuit à 4 ° C. Dans ce cas, utilisez 01:10 souris anti-Dlg et 1: 250 de lapin d&#39;unenti-HtsM 15,16. Les anticorps dirigés contre des marqueurs qui ne sont pas faites chez la souris ou le lapin peuvent également être inclus - par exemple, utiliser 1: 200 de chèvre anti-HRP pour délimiter les membranes neuronales. </li><li> Laver avec PBT trois fois pendant 10 minutes chacun. </li><li> Incuber avec des anticorps secondaires conjugués à un fluorophore à détecter les marqueurs (dilué dans 1% de BSA) pendant 2 h à température ambiante, ou pendant une nuit à 4 ° C. Comme le signal PLA est ensuite visualisée avec un fluorochrome rouge, un autre fluorophore doit être utilisé pour détecter le marqueur - par exemple, en utilisant 1: 200 anti-chèvre conjugué à FITC pour détecter l&#39;anticorps anti-HRP de chèvre. En raison de l&#39;utilisation de réactifs sensibles à la lumière, garder les tubes dans l&#39;obscurité partir de ce point. REMARQUE: Le kit qui est utilisée permet de PLA à effectuer entre anticorps primaires soulevées dans la souris et le lapin, avec le signal visualisé sur le canal rouge sous microscopie confocale. Si on le souhaite, d&#39;autres kits sont disponibles qui permettent à l&#39;essai à effectuer avec primaanticorps ry soulevées dans d&#39;autres espèces, et le signal visualisées sur d&#39;autres canaux. </li></ol></li></ol> 3. Proximité ligature Assay REMARQUE: Effectuez toutes les étapes à la température ambiante et sous agitation douce, sauf indication contraire. <ol><li> PLA Sondes <ol><li> Laver les parois du corps avec PBT trois fois pendant 10 minutes chacun. </li><li> Incuber avec des sondes PLA (1: 5 de chaque dilution dans 1% de BSA) pendant 2 h à 37 ° C. Dans ce cas, utiliser 40 pi de sonde PLA MOINS anti-souris, 40 pl de sonde PLA anti-lapin PLUS et 120 pi de 1% de BSA pour assurer l&#39;immersion correcte et le mélange de 5-10 parois du corps. Jusqu&#39;à une dilution 1:25 des sondes PLA peut encore se traduire par un rapport adéquat signal-sur-bruit (par exemple, pour cette expérience). </li></ol></li><li> Ligature <ol><li> Laver les parois du corps avec le tampon de lavage A deux fois pendant 5 min chacune. </li><li> Incuber avec une solution de ligature (1h40 de dilution de ligase dans un tampon de ligature) pendant 1 heure unt 37 ° C. Dans ce cas, utiliser 5 ul de ligase, 40 pi de tampon de ligature et 5 155 pi d&#39;eau de haute pureté pour assurer l&#39;immersion approprié et le mélange de 5 à 10 parois de la caisse. </li></ol></li><li> Amplification <ol><li> Laver les parois du corps avec le tampon de lavage A deux fois pour 2 minutes chacun. </li><li> Incuber avec une solution d&#39;amplification (1:80 de dilution dans du tampon de polymerase amplification) pendant 2 heures à 37 ° C. Dans ce cas, utiliser 2,5 pi de la polymérase, 40 pi de tampon 5 Amplification et 157,5 pi d&#39;eau de haute pureté pour assurer l&#39;immersion correcte et le mélange de 5-10 parois du corps. </li></ol></li><li> Préparation for Imaging <ol><li> Laver les parois du corps avec le tampon de lavage B deux fois pour 10 minutes chacun. </li><li> Laver avec 0,01x tampon de lavage B une fois pour 1 min. </li><li> Équilibrer dans quelques gouttes de solution de montage pour au moins 30 min avant le montage ou la conserver pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> En utilisant des pinces fines, transférer soigneusement les parois du corps sur une lame de la plateforme wvec leurs cuticules vers le bas. Positionner les parois de la caisse dans des rangées et dans la même orientation à l&#39;intérieur d&#39;une ou deux gouttes de milieu de montage. Placez un 22 mm x 40 mm lamelle sur la préparation en prenant soin de ne pas générer des bulles d&#39;air, puis sceller la lame avec vernis à ongles transparent. </li><li> Conserver les diapositives dans l&#39;obscurité à -20 ° C jusqu&#39;au moment de l&#39;imagerie confocale. </li></ol></li></ol>

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Les auteurs ne ont rien à divulguer.

Ce rapport montre comment PLA peut être appliqué à la drosophile larves NMJ. Le dosage est réalisé sur des larves préparations de muscle de la paroi du corps dans le but de détecter les interactions protéine-protéine endogènes présentes à la jonction neuromusculaire. Avec cette technique, Dlg Hts et sont indiqués pour être à proximité immédiate de l&#39;autre, et ainsi exister dans un complexe, en particulier dans la région post-synaptique 27. À l&#39;appui de ce résultat, une ét...

Drosophila disques large (DLG) est un élément conservé de la famille guanylate kinase associée à la membrane d&#39;un échafaudage de protéines qui aident à orchestrer l&#39;ensemble de grands complexes de protéines à des sites spécifiques de la membrane plasmique. Initialement identifié comme une protéine suppresseur de tumeur, Dlg sert un déterminant important de l&#39;épithélium 1,2,3 apicobasal de polarité. Dlg sert également un module d&#39;échafaudage majeur à la jonction neuromusculaire (JNM) des neurones moteurs glutamatergiques cours du développement larvaire 4. Dlg joue divers rôles à la JNM des larves, et son pléiotropisme repose sur sa capacité à associer à de multiples protéines 5,6. Une telle protéine est Hu-li tai shao (Hts), un homologue aux adducins mammifères qui ont été décrites principalement en ce qui concerne leurs rôles dans la régulation du cytosquelette d&#39;actine-spectrine 7. Il a été montré précédemment que la DLG et Hts peuvent former un complexe avec l&#39;autre sur la base in vitro </em&gt; expériences de co-immunoprécipitation impliquant toute mouche adulte lysats 8. Un inconvénient de ces résultats, cependant, ce est qu&#39;ils ne indiquent pas où cela formes complexes. Avec l&#39;utilisation de l&#39;immunohistochimie, les distributions de la DLG et sont observés Hts à se chevaucher sur la membrane post-synaptique de la JNM des larves, mais elles sont dans un complexe dans cette région 8? Comme l&#39;a récemment illustré et détaillé plus loin ici, Proximité ligature Assay (PLA) est utilisé pour rechercher une association entre Dlg situ et Hts en particulier au stade larvaire NMJ 27. PLA est une technique relativement nouvelle utilisée principalement dans la culture de cellules et de tissus qui permet de détecter les interactions protéine-protéine in situ neuf. Dans ce dosage, les anticorps primaires contre les deux protéines d&#39;intérêt sont détectés avec une paire d&#39;anticorps secondaire spécifique à l&#39;espèce, appelées sondes PLA, qui sont conjugués à des oligonucleotides (Figure 1A, B). Si les deux protéiness sont à proximité étroite les uns des autres (ce est à dire au bout de quelques dizaines de nanomètres), la distance entre les sondes attachées PLA peut être comblé par l&#39;hybridation de deux oligonucléotides connecteurs complémentaires (figure 1C). Dans cette conformation, les extrémités libres des oligonucléotides connecteurs sont suffisamment proches pour entrer en contact avec l&#39;autre, et une molécule d&#39;ADN circulaire fermé peuvent être formées sur la ligature en situ (Figure 1D). La molécule d&#39;ADN circulaire sert de matrice in situ pour l&#39;amplification par cercle roulant, qui est amorcée par l&#39;un des oligonucléotides conjugués à des sondes de l&#39;APL (Figure 1E). Les séquences au sein de la amplifiée, un produit d&#39;ADN concatémère résultant peuvent ensuite être visualisées, avec des sondes oligonucléotidiques complémentaires marquées par fluorescence (Figure 1F). Étant donné que l&#39;ADN amplifié reste attaché à l&#39;une des sondes de l&#39;APL, la localisation subcellulaire de la protéine-protéine interaction withitissus na peut être facilement établi. Plusieurs méthodes sont couramment utilisées pour détecter les interactions protéine-protéine, y compris des techniques in vitro telles que la co-immunoprécipitation, pull-down des essais et de la levure Double hybride, et dans les techniques in vivo telles que le transfert Förster Resonance Energy (FRET) et bimoléculaire complémentation de fluorescence ( BiFC). Un écueil des techniques in vitro, ce est qu&#39;ils ne identifient pas où l&#39;interaction est endogène produit, tandis que les techniques in vivo l&#39;susmentionnés impliquent dans l&#39;expression artificielle de protéines de fusion qui peuvent ne pas refléter le comportement natif de leurs homologues endogènes. Un avantage majeur de PLA est qu&#39;il est capable de déterminer au sein d&#39;un tissu de la localisation subcellulaire des interacteurs protéiques endogènes qui sont à proximité étroite les uns aux autres et susceptibles formant un complexe, avec le degré de proximité nécessaire pour produire un signal comparable à FRET et BiFC. PLA peut détecter des interactions avec une spécificité élevée et une sensibilité due au couplage de la reconnaissance d&#39;anticorps et l&#39;amplification d&#39;ADN. Ainsi, le dosage peut générer des signaux lumineux discrets, sous la forme de points lacrymaux qui révèlent la position exacte de l&#39;interaction. En outre, les antigènes à peine visibles peuvent être détectés. Enfin, le PLA est une technique relativement simple à réaliser, et il ne prend pas plus d&#39;une procédure standard pour compléter immunohistochimique. Par conséquent, PLA offre un avantage technique sur d&#39;autres tests d&#39;interaction protéine-protéine qui sont souvent en proie à des temps de préparation long et vaste dépannage. Ce protocole montre comment PLA peut être appliquée à la Drosophile larvaire JNM dans le but de détecter les interactions protéine-protéine endogènes in situ. Ici, le PLA est effectuée sur des larves préparations de muscle de la paroi du corps où Dlg et Hts sont présentées d&#39;exister en effet dans un complexe dans la région post-synaptique du NMJs. PLA n&#39;a pas déjà été utilisé pour étudier la JNM des larves, et il ya à l&#39;heure actuelle seule une poignée d&#39;articles publiés qui ont utilisé cette technique dans le tissu drosophile. Il est à espérer que la poursuite de l&#39;exposition de PLA à la communauté Drosophila entraînera dans son utilisation accrue comme un outil supplémentaire pour compléter d&#39;autres, les plus couramment utilisés essais d&#39;interaction protéine-protéine.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="630">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:211px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:120px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:191px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:211px;">Forceps (fine #5)</td>
			<td style="width:120px;">Almedic</td>
			<td>A10-704</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:211px;">Sylgard Disc</td>
			<td style="width:120px;">World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td style="width:191px;">Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60x15mm petri dish lid when dissecting.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter)</td>
			<td style="width:120px;">Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">Microdissection Scissors (ultra fine)</td>
			<td style="width:120px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:111px;">15200-00</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;width:211px;">Platform Slides</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Glue two 22x22mm coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a &#60;20mm gap in between for sample mounting.</td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;width:211px;">w1118</td>
			<td style="width:120px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:111px;">3605</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;width:211px;">hts01103</td>
			<td style="width:120px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:111px;">10989</td>
			<td style="width:191px;">Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal.</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7.0</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Bouin&#39;s Solution</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">HT10132</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="114">
			<td height="114" style="height:114px;width:211px;">4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">PFA (Anachemia Science - 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">BSA (Bioshop Canada - ALB001). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">mouse anti-Dlg (Discs large)</td>
			<td style="width:120px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>4F3</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:10 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao)</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">rabbit anti-Pak (p21-activated kinase)</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">mouse anti-Wg (Wingless)</td>
			<td style="width:120px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:111px;">4D4</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:5 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase)</td>
			<td style="width:120px;">Jackson&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ImmunoResearch</td>
			<td style="width:111px;">123-065-021</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">FITC-conjugated donkey anti-goat</td>
			<td style="width:120px;">Jackson&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ImmunoResearch</td>
			<td style="width:111px;">705-095-003</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO92004</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO92002</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ Detection Reagents Red</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92008</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">1x Wash Buffer A: 0.01M Tris, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82049</td>
			<td style="width:191px;">Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">1x Wash Buffer B: 0.2M Tris, 0.1M NaCl, pH 7.5</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82049</td>
			<td style="width:191px;">Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">0.01x Wash Buffer B: 2mM Tris, 1mM NaCl, pH 7.5</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82049</td>
			<td style="width:191px;">Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82040</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of in situ protein-protein complexes at the drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Dans de type sauvage troisième stade larvaire NMJs, Dlg est principalement trouvé à la membrane postsynaptique de type I boutons glutamatergiques, avec des niveaux d&#39;immunoréactivité Dlg étant plus marquée dans le type Ib boutons que le type est boutons (figure 3A) 4. Hts est présent tout au long du muscle, mais se concentre dans la région post-synaptique avec Hts niveaux d&#39;immunoréactivité apparaissant égale dans les deux boutons de type I, et se retrouve également prés...

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Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Ce protocole montre comment Proximité Ligation Assay peut être utilisé pour détecter des interactions protéine-protéine in situ à la jonction des larves de Drosophila neuromusculaire. Avec cette technique, disques grande et Hu-li shao de tai sont présentés pour former un complexe dans la région post-synaptique, une association préalablement identifiés par co-immunoprécipitation.

Détection de<em&gt; In Situ</em&gt; complexes protéine-protéine à la<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvaire jonction neuromusculaire Utilisation Proximité ligature Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

detection-situ-protein-protein-complexes-at-drosophila-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

13.0K vues.  Simon Fraser University.  Ce protocole montre comment Proximité Ligation Assay peut être utilisé pour détecter des interactions protéine-protéine in situ à la jonction des larves de Drosophila neuromusculaire. Avec cette technique, disques grande et Hu-li shao de tai sont présentés pour former un complexe dans la région post-synaptique, une association préalablement identifiés par co-immunoprécipitation. 