המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר לואיס Reichardt לעכברי TrkA taulacZ וד&quot;ר אנט מרקוס לדיון והצעות תובנה. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות הפעלה מהקרן בורק כמו גם המענק וייטהול קרן מחקר 2010-08-61, מענק מחקר מכנפיים לקרן חיים (WFL-ארה&quot;ב-028/14), להעניק ZB1-1102-1 מ כריסטופר ודנתי ריב קרן, ומענקים 1R01EY022409 ו3R01EY022409-01S1 מהעין הלאומית, לJZ. KJO הוא עמית גולדסמית.

הערה: כל הנהלים עומדים במדריך NIH לשימוש וטיפול בחי מעבדה. פרוטוקול בעלי החיים אושר על ידי IACUC במכללה רפואית ווייל קורנל. 1. רקמות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים נקבות מתוזמן-הריון על ידי צוואר רחם עקירה 15. לנתח E16 עובריים - עוברי E18 מנקבות מתוזמן-הריון ועוברי מקום בנפרד בבארות של צלחת 6-גם, מלאות מלוח פוספט הקר שנאגרו (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את העוברים בקור PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חלק קטן של הקרום מי השפיר של העובר והמקום בפתרון K proteinase מוכן מראש עבור genotyping שלאחר מכן. לחלופין, אם הקרום מי השפיר הולך לאיבוד, להסיר חלק קטן מקצה זנב העובר ולמקם אותו בפתרון K proteinase </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חורים לתוך העור בכל רחבי העובר באמצעות סיכות חרקים (לפחות 100 לכל צד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ולאט לאט להוסיף paraformaldehyde 2% טריים (PFA),pH 7.4, ול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נער בעדינות לשעה 2 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את עוברי פעמים PBS ולאחסן PBS ב 4 מעלות צלזיוס עד צביעה. </li></ol> 2. Genotyping <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הקרומים מי שפיר או זנבות עובר בתערובת K proteinase לפי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 56 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ DNA באמצעות ערכת טיהור DNA זמינה מסחרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 0.5 μl של 200 μl הכולל מטוהר פתרון הדנ&quot;א הגנומי, לשלב את זה עם 0.5 μl של כל אחד מצבעי יסוד הגן ספציפי תחושה וantisense (10 מיקרומטר), 2 μl dNTP Mix (2.5 מ&quot;מ של dATP, dCTP, dGTP וdTTP) , 0.2 פולימראז μl תקי (5 U / μl) וחיץ 2 μl PCR (10x), להוסיף H 2 O כדי בהיקף כולל של 20 μl. הערה: רצפי פריימר הם כדלקמן (טבלה 1): TrkA: TrkA_F: GCG GGC GCC GCC GCG ATG, TrkA_R: GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG; frag PCRאורך ment: 400 basepairs (נ&quot;ב). Bax: In5R: GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG, Ex5F: TGA TCA GAA CCA TCA TG, NeoR: CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG; אורכי PCR בר: סוג בר, 304 נ&quot;ב; null Bax, 507 נ&quot;ב. TauLacZ: lacZup: ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA, lacZdown: ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G; אורך PCR בר: 360 נ&quot;ב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל PCR עם התכנית לTrkA הבאה: שלב 1: 1 דקות על 95 מעלות צלזיוס, שלב 2: 10 שניות על 95 מעלות צלזיוס, שלב 3: 20 שניות על 68 מעלות צלזיוס, שלב 4: 30 שניות על 72 מעלות צלזיוס. חזור על שלבים 2-4 במשך 40 מחזורים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לLacZ וBax, לרוץ PCR עם התכנית הבאה: צעד 1: 1 דקות על 95 מעלות צלזיוס, שלב 2: 10 שניות על 95 מעלות צלזיוס, שלב 3: 1 דקות על 54 ° C, שלב 4: 1 דקות ב 72 מעלות צלזיוס, חזור על השלבים 2-4 במשך 35 מחזורים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות הפעלת PCR על ג&#39;ל 2% agarose ב 100 V במאגר 1x טריס-אצטט-EDTA במשך 20 דקות עם נתיב של סולם DNA להעריך אורכי בר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח עובר לנוכחות של הסוג בר TrkA, TrkA-tauLacZ וBax אללים null. גנוטיפים של עוברים ניסיוניים הם TrkA taulacZ / WT: Bax - / - וTrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / -, בהתאם לשאלות הניסיוניות. העוברים חסרי כתב tauLacZ יהיו שליליים עבור מכתים axonal ולכן יכולים לשמש בקרות שליליות לכייל את תהליך הצביעה. </li></ol> 3. העובר מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בערכה מסחרית מכתים lacZ עם כמה שינויים כמפורט להלן בסעיפי 3.2-3.8. כאן, השתמש בערכת Millipore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את העוברים במאגר לשעה לפחות 1, רועדים בעדינות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ישירות לטבול עוברים במאגר B לפחות 15 דקות, רועד בעדינות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד עוברים נמצאים במאגר A / B, פתרון Base רקמות טרום חם על 37 מעלות צלזיוס. השתמש 5 מיליליטר של תמיסת בסיס רקמות לעובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד עוברים נמצאים במאגר A / B, להכין 5-br הטריomo- 4 כלורופורם 3 indolyl α-D-galactopyranoside (X-gal) בריכוז של 40 מ&quot;ג / מיליליטר ב 100 sulfoxide דימתיל% (DMSO). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל X-gal לפתרון בסיס רקמות המחומם מראש בריכוז של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ולהוסיף 5 מיליליטר של X-gal / תערובת בסיס רקמות לבקבוקון נצנץ זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העוברים לבקבוקון נצנץ זכוכית המכיל תערובת Base X-gal / רקמות. לאטום את המכסה עם Parafilm ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה, בדיקה לנוכחות של כתם כחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברי Postfix עם 4% טריים PFA, pH 7.4. נער בעדינות במשך 4 שעות על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את העוברים פעמים PBS הקר. </li></ol> 4. רקמות התייבשות וסליקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברי מקום ב -50% מתנול / 50% תערובת PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר, רועדות בבקבוקוני הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך ליבש במתנול 75% / 25% PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר, רועד בבקבוקוני זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך ליבש ב -90% מתנול / 10% PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר, רועדות בבקבוקוני זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך ליבש במתנול 100% למשך 30 דקות (2x) בטמפרטורת חדר, רועד בבקבוקוני זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד עוברים להתייבשות, להכין 1: 1 (v: v) תערובת של אלכוהול ונזואיל נזואיל בנזואט. הערה: בנזואט האלכוהול בנזואיל ונזואיל הוא רעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את העוברים ב1: 1 (v: v) תערובת של מתנול 100%: 100% באב במשך 15 דקות. השתמש אך ורק משום שזכוכית באב יתמוסס פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את העוברים ב100% באב לברור לחלוטין הרקמה ולדמיין צביעת X-gal בעובר פינה. הערה: תמונה בהקדם האפשרי משום שכתם X-gal יימוג לאורך זמן. </li></ol> 5. הר שלם הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצב את העובר, שקוע ב100% באב, בזוויות המתאימות למלקחי מתכת צילום באמצעות. להאיר באמצעות שילוב של מקורות עד-אור ותחת אור אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות עם מיקרוסקופ לנתחמצויד במצלמה דיגיטלית. קח חשיפות שדה בהירות מרובות בחמישה מטוסי מוקד רצופים 0.5 מ&quot;מ זה מזה לאורך ציר Z. זמני חשיפה וF- מפסיק עשויות להשתנות בהתאם למפרט תאורה ומצלמה וצריכים להיות מותאמים לכל התקנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת עיבוד תמונה סטנדרטית לעיבוד תמונות כיסוי וליצור photomontages. </li></ol>

<ol>
	<li>Verze, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+innervation+in+hereditary+sensory+and+autonomic+neuropathy+type+IV.">Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV.</a> Neurology. 55, 126-128 (2000).</li><li>Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+sensory+abnormalities+in+children+and+adolescents+with+complex+regional+pain+syndromes.">Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents with complex regional pain syndromes.</a> Pain. 131, 153-161 (2007).</li><li>Uceyler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+fibers+in+Fabry+disease:+baseline+and+follow-up+data+under+enzyme+replacement+therapy.">Small fibers in Fabry disease: baseline and follow-up data under enzyme replacement therapy.</a> J Peripher Nerv Syst. 16, 304-314 (2011).</li><li>Reichardt, L. F., Mobley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Going+the+distance,+or+not,+with+neurotrophin+signals.">Going the distance, or not, with neurotrophin signals.</a> Cell. 118, 141-143 (2004).</li><li>White, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+onset+of+NGF+and+TrkA+survival+dependence+in+developing+dorsal+root+ganglia.">Synchronous onset of NGF and TrkA survival dependence in developing dorsal root ganglia.</a> J Neurosci. 16, 4662-4672 (1996).</li><li>Farinas, I., Wilkinson, G. A., Backus, C., Reichardt, L. F., Patapoutian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neurotrophin+and+Trk+receptor+functions+in+developing+sensory+ganglia:+direct+NT-3+activation+of+TrkB+neurons+in+vivo.">Characterization of neurotrophin and Trk receptor functions in developing sensory ganglia: direct NT-3 activation of TrkB neurons in vivo.</a> Neuron. 21, 325-334 (1998).</li><li>Markus, A., Zhong, J., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raf+and+akt+mediate+distinct+aspects+of+sensory+axon+growth.">Raf and akt mediate distinct aspects of sensory axon growth.</a> Neuron. 35, 65-76 (2002).</li><li>Kuruvilla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurotrophin+signaling+cascade+coordinates+sympathetic+neuron+development+through+differential+control+of+TrkA+trafficking+and+retrograde+signaling.">A neurotrophin signaling cascade coordinates sympathetic neuron development through differential control of TrkA trafficking and retrograde signaling.</a> Cell. 118, 243-255 (2004).</li><li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raf+kinase+signaling+functions+in+sensory+neuron+differentiation+and+axon+growth+in+vivo.">Raf kinase signaling functions in sensory neuron differentiation and axon growth in vivo.</a> Nature. 10, 598-607 (2007).</li><li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+olfactory+sensory+map+develops+in+the+absence+of+normal+projection+neurons+or+GABAergic+interneurons.">An olfactory sensory map develops in the absence of normal projection neurons or GABAergic interneurons.</a> Neuron. 21, 1273-1282 (1998).</li><li>Moqrich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expressing+TrkC+from+the+TrkA+locus+causes+a+subset+of+dorsal+root+ganglia+neurons+to+switch+fate.">Expressing TrkC from the TrkA locus causes a subset of dorsal root ganglia neurons to switch fate.</a> Nature. 7, 812-818 (2004).</li><li>Knudson, C. M., Tung, K. S., Tourtellotte, W. G., Brown, G. A., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bax-deficient+mice+with+lymphoid+hyperplasia+and+male+germ+cell+death.">Bax-deficient mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death.</a> Science. 270 (5233), 96-99 (1995).</li><li>Lentz, S. I., Knudson, C. M., Korsmeyer, S. J., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins+support+the+development+of+diverse+sensory+axon+morphologies.">Neurotrophins support the development of diverse sensory axon morphologies.</a> J. Neurosci. 19, 1038-1048 (1999).</li><li>Patel, T. D., Jackman, A., Rice, F. L., Kucera, J., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+sensory+neurons+in+the+absence+of+NGF/TrkA+signaling+in+vivo.">Development of sensory neurons in the absence of NGF/TrkA signaling in vivo.</a> Neuron. 25, 345-357 (2000).</li><li>Donovan, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-RAF+kinase+drives+developmental+axon+growth+and+promotes+axon+regeneration+in+the+injured+mature+CNS.">B-RAF kinase drives developmental axon growth and promotes axon regeneration in the injured mature CNS.</a> The Journal of experimental medicine. 211, 801-814 (2014).</li><li>Mercer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+endogenous+oncogenic+V600EB-raf+induces+proliferation+and+developmental+defects+in+mice+and+transformation+of+primary+fibroblasts.">Expression of endogenous oncogenic V600EB-raf induces proliferation and developmental defects in mice and transformation of primary fibroblasts.</a> Cancer research. 65, 11493-11500 (2005).</li><li>Tronche, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+glucocorticoid+receptor+gene+in+the+nervous+system+results+in+reduced+anxiety.">Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety.</a> Nature genetics. 23, 99-103 (1999).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-induced+activation+and+silencing.">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing.</a> Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neuronal+Subsets+in+Transgenic+Mice+Expressing+Multiple+Spectral+Variants+of+GFP.">Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Schmidt, H., Rathjen, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiI-labeling+of+DRG+neurons+to+study+axonal+branching+in+a+whole+mount+preparation+of+mouse+embryonic+spinal+cord.">DiI-labeling of DRG neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord.</a> J Vis Exp. , (2011).</li></ol>

The authors declare that there are no competing interests.

ההליך מכתים X-gal-שתואר לעיל של עכברי TrkA taulacZ עובריים מאפשר ההדמיה המהירה ומפורטת של תחזיות האקסון למרחקים ארוכים בעובר הקבוע בשלמותה. בגלל רקע null Bax עכברים אלה מאפשרים לחיטוט של איתות מנגנונים שעשויות לתרום לצמיחת שני האקסון והישרדות עצבית. הזדווגות עם...

הקמת רשתות עצביות מדויקות היא תהליך התפתחותי מורכב חיוני לפעולה התקינה של מערכת העצבים. הפרעה בתהליך זה מובילה לבעיות בתפקוד עצביים שהיה מעורב במחלות נוירולוגיות אנושיות 1-3. כדי לחקור את המנגנונים מולקולריים שבבסיס של צמיחת האקסון ועצבוב היעד ביונקים, שפיתחנו פרוטוקול לדמיין מסלולי axonal של TrkA להביע עצב סנסורי באמצעות שילוב של שני קווי עכבר מהונדסים גנטי. TrkA הוא קולטן לגורם גדילה עצבית NGF ומהווה סמן תפקודי של עצב סנסורי nociceptive 4. TrkA מתבטא מאוד בתאי עצב nociceptive במהלך התפתחות מוקדמת ומתווך הישרדות NGF תלוי נוירון, צמיחת האקסון, arborization ויעד עצבוב 5-9. בעכברי TrkA taulacZ, גן TrkA הסוג בר הוא הוחלף על ידי ג ביטוי taulacZ10 assette, כך שמורפולוגיה axonal של נוירונים TrkA החיובי משוערים ניתן דמיינה ידי β-gal (X-gal) מכתים 11. באמצעות קו TrkA taulacZ / WT הטרוזיגוטיים, אנו יכולים לבחון גורמים שעשויים לווסת או להפריע להתפתחות של תחזיות מביא חושיות in vivo. יתר על כן, ביטוי TrkA נעדר בעכברי TrkA taulacZ / taulacZ הומוזיגוטים, אשר על כן ניתן להשתמש בו כדי להעריך את צמיחת האקסון קידום מנגנונים בהעדר איתות NGF / TrkA. מאז הנוירונים nociceptive תלויים בNGF / TrkA איתות לא רק לצמיחת האקסון, אלא גם להישרדות, אנו מעסיקים קו עכבר אחר, חסר את גן Bax פרו-אפופטוטיים, לעכב אפופטוזיס בתאי עצב DRG עוברי, מציל אותם ממוות של תאים שהוא אחרת נצפה בהעדר איתות TrkA. Bax - / - הרקע 12 וכך מאפשר לmolecuנתיחת lar של מסלולי איתות שדווקא משפיעים 7-9,13-15 צמיחת האקסון. בTrkA - / -: Bax - / - עכברים, תאי עצב DRG לשרוד, אבל עצבוב מביא חושי בעור הוא בוטל לחלוטין 14,15. אנחנו באופן סלקטיבי יכולים להפעיל מסלולי איתות כדי לקבוע התרומות שלהם לפיתוח תחזיות האקסון. השירות של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת ההערכה של שינויים בפנוטיפים צמיחת axonal כאשר שינויים גנטיים שונים הם התרבו על TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - או TrkA taulacZ / WT: Bax - / - רקע.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="465">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;"></td>
			<td style="width:127px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PFA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Life Tech</td>
			<td>10010-023</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Rinse Solution A</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>BG-6-B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Rinse Solution B</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>BG-7-B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Stain Base Solution</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>BG-8-C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-gal&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4252</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass scintiallation vial</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>74500-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>Labline</td>
			<td>Model 120</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insect pins</td>
			<td>FST</td>
			<td>26000-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6 well dish</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7672-7506</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>custom DNA primers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Takara dNTP mixture</td>
			<td>Takara</td>
			<td>4030</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Takara LA buffer</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR002A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Takara LA Taq</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR002A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR machine</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>DNA Engine Dyad</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B-1042</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl benzoate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B-6630</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC310FX</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ring light&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>MEB110</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Photoshop 4.0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-mount imaging of mouse embryo sensory axon projections

ההדמיה של תחזיות עצביות באורך מלא בעוברים היא חיונית כדי לזכות בהבנה של איך יונקים רשתות עצביות לפתח. כאן אנו מתארים שיטה לתייג באתר משנה של גנגליון שורש הגבי תחזיות האקסון (DRG) כדי להעריך את המאפיינים פנוטיפי שלהם באמצעות כמה שורות עכבר מניפולציות גנטית. נוירונים TrkA חיובי נוירונים קולטן אזעקה, שהוקדשו להעברת אותות כאב. אנו מנצלים קו עכבר TrkA taulacZ לתייג המסלולים של כל האקסונים ההיקפיים TrkA החיובי בעובר העכבר ללא פגע. בנוסף, אנו להתרבות קו TrkA taulacZ על רקע null Bax, אשר למעשה מבטל אפופטוזיס העצבי, על מנת להעריך את השאלות הקשורות לצמיחה באופן עצמאי מהשפעות אפשריות של מניפולציות גנטיות על הישרדות עצבית. בהמשך לכך, עכברים מהונדסים גנטי של עניין הם התרבו עם taul TrkAקו וnull acZ / Bax אז הם מוכנים למחקר באמצעות הטכניקות המתוארות במסמך זה. מצגת זו כוללת מידע מפורט על תוכניות רבייה עכבר, genotyping בזמן הנתיחה, הכנת רקמה, צביעה וסליקה, כדי לאפשר ויזואליזציה של מסלולי axonal באורך מלא בהכנה כל הר.

גנוטיפים של TrkA WT / taulacZ: Bax - / - וTrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - עוברים ניתן לקבוע באופן חד משמעי על ידי genotyping PCR הסטנדרטי (איור 1). מציגה צביעת X-gal מפורט סוכות axonal היקפיים תת עורי בעוברים מוכתמים קונבנציונלי (איורים 2, 3 א), ובכל רחבי העובר לאחר ?...

Watch this Scientific Journal Video about Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections at JoVE.com

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

הדמיה הר-כל תחזיות החושיות אקסון העובר העכבר

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

whole-mount-imaging-of-mouse-embryo-sensory-axon-projections

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.0K Views.  Weill Medical College of Cornell University. We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Video: Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

מרובה עכבר Neuroanatomical תהודה מגנטית

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Dissection העין עכבר על הר שלם של האפיתל פיגמנט רשתית

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

עכבר לשחזור Sciatic עצב קראש והערכה לאחר ההתחדשות של ניתוח הר שלם שריר

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

מכתים Immunofluorescent הר שלם של רשתית עכבר ילודים לחקר אנגיוגנזה<em&gt; בvivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אנטנה

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel cell clusters), sebaceous glands, nerves and nerve endings, and capillaries. The spatial arrangement of these structures is tightly controlled on a microscopic scale - as seen, for example, in the orderly arrangement of cell types within a single hair follicle - and on a macroscopic scale - as seen by the nearly identical orientations of thousands of hair follicles within a local region of skin. Visualizing these structures without physically sectioning the skin is possible because of the 2-dimensional geometry of this organ. In this protocol, we show that mouse skin can be dissected, fixed, permeabilized, stained, and clarified as an intact two dimensional object, a flat mount. The protocol allows for easy visualization of skin structures in their entirety through the full thickness of large areas of skin by optical sectioning and reconstruction. Images of these structures can also be integrated with information about position and orientation relative to the body axes.

Mammalian skin contains a diverse array of structures - such as hair follicles and nerve endings - that exhibit distinctive patterns of spatial organization. Analyzing skin as a flat mount takes advantage of the 2-dimensional geometry of this tissue to produce full-thickness high-resolution images of skin structures.

הר הדמיה שטוחה של עור העכבר ויישומו לניתוח של שיער זקיק דפוסים וחושי אקסון מורפולוגיה

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

ההדמיה Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamics בסופי קון קולטי האור אקסון של רשתית העכבר

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

טומוגרפיה אופטית קוהרנטית: הדמיה העכבר גנגליון תאים In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Quadunple Immunostaining של הנורה חוש הריח עבור ויזואליזציה של חוש הריח חושפת אקסון מולקולרית קודי זהות

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...