Name: whole-mount imaging of mouse embryo sensory axon projections
Uploaded: 2014-12-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections at JoVE.com

저자는 통찰력 토론과 제안의 TrkA taulacZ 마우스 박사 아네트 마르쿠스 박사 루이스 레이 차트에 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 버크 재단뿐만 아니라 화이트 홀 재단 연구비 2010-08-61, 생명 재단 (WFL-US-028 / 14) 날개에서 연구 지원 사업 시작 기금에 의해 지원되었다,에서 ZB1-1102-1을 부여 크리스토퍼 &amp; 데이나 리브 재단​​과 JZ에 국립 안과 연구소의 보조금 1R01EY022409과 3R01EY022409-01S1. KJO는 골드 스미스의 동료입니다.

참고 : 모든 절차는 실험 동물의 사용 및 관리에 대한 NIH 가이드 준수합니다. 동물 프로토콜은 웨일 코넬 의과 대학에서 IACUC 승인을 받았다. 1. 조직 준비 <ol><li> 자궁 경부 전위 15 시간 초과 - 임신 여성을 안락사. 개별적으로 차가운 인산염 완충 식염수 (PBS)로 채워진 6 잘 접시의 우물에서 시간 초과 - 임신 여성과 장소 배아에서 E18 배아 - 배아 E16를 해부하다. </li><li> 차가운 PBS에서 배아를 씻어. </li><li> 후속 유전자형을위한 사전 준비의 proteinase K 용액 배아과 장소 양막의 작은 부분을 제거한다. 양막이 끊어지면 대안, 배아의 꼬리 끝의 일부를 제거하고 K 테 용액에 넣 </li><li> 모든 곤충 핀 (측면 당 적어도 100)를 이용하여 배아 주위 피부에 구멍을 찔러. </li><li> (PFA)을 신선한 2 % 파라 포름 알데히드를 추가 천천히 PBS를 제거하고우물에 pH가 7.4. </li><li> 조심스럽게 4 ° C에서 2 시간 동안 흔들어. </li><li> PBS에 두 번 배아를 씻어 염색까지 4 ° C에서 PBS에 저장합니다. </li></ol> 2. 유전자형 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 단백질 분해 효소 K 혼합물에 양막 또는 배아 꼬리를 담근다. </li><li> 10 분 동안 56 ° C에서 품어. </li><li> 시중에서 판매하는 DNA 정제 키트를 사용하여 DNA를 추출합니다. </li><li> 유전자 특이 센스 및 안티센스 프라이머 (10 μM)의 각각 0.5 μL, 2 μL의 dNTP 믹스와 결합, 게놈 DNA 용액 정제 총 200 μL의 0.5 μl를 타고 (dATP 존재의 2.5 mM의,의 dCTP, dGTP의 및 dTTP) 0.2 μL의 Taq 중합 효소 (5 U / μL) 및 2 ㎕의 PCR 완충액 (10 배)은 20 ㎕의 총 부피로 H 2 O를 추가한다. 참고 : 프라이머 서열은 다음과 같습니다 (표 1) 의 TrkA : TrkA_F : GCG GGC GCC GCC GCG ATG, TrkA_R : GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG; PCR의 파편, 표준 길이 : 400 염기쌍 (BP). 백스 : In5R : GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG, Ex5F : TGA TCA GAA CCA TCA TG, NeoR : CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG; PCR 단편 길이 : 야생형, BP (304); Bax의 널 (null), 507 bp의. TauLacZ : lacZup : ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA, lacZdown : ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G; PCR 단편 길이 : 360 bp의. </li><li> 의 TrkA에 대해 다음 프로그램으로 PCR을 실행 1 단계 : 1 분 95 ° C, 2 단계에서 30 초 72 ° C : 68 ° C, 4 단계에서 20 초 : 95 ° C, 3 단계에서 10 초. 40주기 4 - 반복 2 단계를 반복합니다. <ol><li> LacZ를하고 백스를 들어, 다음 프로그램으로 PCR을 실행 1 단계 : 1 분 95 ° C에서, 2 단계 : 10 초 95 ° C, 단계에서 3 : 1 분 54 ° C, 단계 4 : 72에서 1 분 35 사이클 - 4 ° C를 반복 2 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> DNA 래더의 차선을 20 분 동안 1X 트리스 - 아세테이트 - EDTA 완충액에서 100 V에서 2 % 아가 로스 겔에서 실행 PCR 샘플 길이 단편을 평가. </li><li> 야생형의 TrkA, T의 존재에 대해 분석 배아RKA - tauLacZ 및 Bax의 널 (null) 대립 유전자. 백스 - / -, 실험 질문에 따라 : - - /와의 TrkA taulacZ / taulacZ 백스 : 실험 배아의 유전형의 TrkA taulacZ / WT 있습니다. tauLacZ 기자가없는 배아 축삭 염색 부정적으로 사용되므로 염색 과정을 교정하는 부정적인 컨트롤을 제공 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 배아 염색 <ol><li> 3.8 - 섹션 3.2에서 아래와 같이 일부 수정과의 lacZ 염색 상용 키트를 사용합니다. 여기에, 밀리 포아 키트를 사용합니다. </li><li> 실온에서 부드럽게 흔들어, 적어도 1 시간 동안 버퍼의 배아를 담근다. </li><li> 직접 실온에서 부드럽게 흔들어, 적어도 15 분 동안 버퍼 B의 배아를 체험. </li><li> 배아는 버퍼 A / B, 37 ° C에서 미리 따뜻한 조직 염기 용액에있는 동안. 배아 당 조직 염기 용액 5 mL를 사용합니다. </li><li> 배아 버퍼 A / B에있는 동안, 신선한 5-BR 준비omo- 100 % 디메틸 술폭 시드 (DMSO)에 40 ㎎ / ㎖의 농도로 -3- 인돌 α-D-갈 락토 (X-GAL) -4- 클로로. </li><li> 1 mg / ml의 농도로 예열 된 티슈베이스 용액에 X-gal을 희석시키고 유리 섬광 바이알로 X-GAL / 티슈베이스 혼합물을 5 mL를 추가한다. </li><li> X-GAL / 티슈베이스를 함유하는 혼합물을 유리 섬광 바이알로 배아를 전송합니다. 파라 필름으로 뚜껑을 밀봉 파란색 얼룩의 존재를 확인, 37 ℃에서 하룻밤 배양한다. </li><li> 신선한 4 % PFA, pH가 7.4 후위 배아. 조심스럽게 4 ° C에서 4 시간 동안 흔들. </li><li> 차가운 PBS에 두 번 배아를 씻어. </li></ol> 4. 조직 탈수 및 지우기 <ol><li> 유리 바이알에서 흔들면서 실온에서 30 분 동안 50 % 메탄올 / 50 % PBS 액에 넣어 배아. </li><li> 유리 바이알에서 흔들면서 실온에서 30 분 동안 75 % 메탄올 / 25 % PBS 탈수 계속. </li><li> 90 % 탈수 계속 메탄올 / 10 % P유리 바이알에서 흔들면서 실온에서 30 분 동안 BS. </li><li> 유리 바이알에서 흔들면서 실온에서 30 분 (2 배), 100 % 메탄올 탈수 계속. </li><li> 1 (V : V) 벤조일 알코올 벤조일 벤조 에이트의 혼합물 배아 탈수하는 동안, 1을 제조. 참고 : 벤조일 알코올과 벤조일 벤조 에이트는 독성이다. </li><li> 1 : 1 배아를 담가 (V : V) 100 % 메탄올의 혼합물 : 15 분 동안 100 % BABB. BABB 플라스틱을 용해하기 때문에 만 유리를 사용합니다. </li><li> 완전히 투명 조직 100 % BABB에서 배아를 담그고 삭제 배아에서 X-여자 염색을 시각화 할 수 있습니다. 참고 : 가능한 한 빨리 X-여자의 얼룩은 시간이 지남에 따라 퇴색하기 때문에 이미지. </li></ol> 5. 전체 마운트 이미지 <ol><li> 사진 사용하여 금속 집게에 대한 적절한 각도로, 100 % BABB에 몰입 배아를 안정화. 점등 미만 광용 광원의 조합을 사용 밝히는. </li><li> 해부 현미경으로 이미지를 수집디지털 카메라로 복. 0.5 mm 떨어져 Z 축을 따라 다섯 연속 초점면에 여러 시야 노출을 가져 가라. 노출 시간과 F-정거장 조명 및 카메라 사양에 따라 다를 수 있으며 각 설정에 최적화 될 필요가있다. </li><li> 오버레이 된 영상을 가공 및 포토 몽타주를 생성하는 기준 화상 처리 소프트웨어를 사용한다. </li></ol>

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The authors declare that there are no competing interests.

배아의 TrkA taulacZ 마우스의 상술 한 X-GAL 염색 과정은 그대로 고정 배아에서 장거리 축삭 돌기 신속하고 상세한 시각화한다. 이 마우스가 축삭의 성장과 생존의 연결 모두에 기여할 수있는 메커니즘을 신호의 프로빙을 허용 백스 널 배경 때문에. 관심의 유전자 변형 또는 녹아웃 쥐와 교미하는 축삭 표현형의 종합적인 평가를 할 수 있으며 더 자세한 방식으로 축삭의 성장 신호를 검사 할 미래의 실험에 유용한 가이드를 제공 할 수 있습니다. 생체 축삭의 성장 연구를위한 주요 과제는 조직을 준비하는 시간이다 섹션과 어느 한 유전자 조작에 의해 다양한 방식으로 영향을받을 수 성장 축삭의 복잡한 표현형을 평가. 의 TrkA taulacZ은 / taulacZ : 백스 - /이 - 라인은 유전자의 전체 효과의 평가를 할 수 있습니다주변 침해 수용체 축삭 개발에 관심. 기법은 일반적으로 초기 발달 단계 동안의 TrkA를 발현 할 침해 수용체 축삭 궤적 시각화에 한정된다. 주연 침해 수용체에 더하여, 이것은 교감 기저 전뇌 콜린성 돌기를 시각화하는 것이 가능할 수있다; 그러나 이는 염색 기법 별 최적화를 필요 조직 청소는 여기에 설명 된 프로토콜의 핵심 단계이다. 그것은 전체 마운트 준비에 깊은 거짓말을 돌기 때문에 별개의 표현형의 잠재적 식별의 세부 평가를 할 수 있습니다. 우리가 발견했기 때문에 이러한 TdTomato 또는 GFP 기자 18, 19, 형광 기자, 특정 조건에서 시각적 선명도를 제공 할 수 있습니다, 그러나 그것은 X-여자 염색과 달리, 형광 신호가 동안 실질적으로 퇴색하는 것이 전체 마운트 이미지를 획득하기가 어렵습니다 조직의 청산 절차. DII염색도 널리 축삭 라벨 (20)에 사용됩니다; 단점은 선택적으로 예컨대 여기 섬유 통각 수용기로서 축삭 특정 아형 레이블 수 없다고하고, 그 주위에 충분히 긴 궤적 라벨을하는 것이 곤란하다. 요약하면, 우리는 마우스 배아에서 통각 축삭 전체 정자 루틴 시각화를 허용하도록 두 유전자 변형 마우스 라인의 조합을 사용하는 프로토콜을 제공한다.

정확한 신경 네트워크의 설립은 신경계의 기능에 필수적인 복잡한 발달 과정이다. 이 과정에서 장애는 인간의 신경 질환 1-3에 연루 된 신경 세포의 기능 장애로 이어집니다. 포유 동물에서 축삭 성장과 타겟 신경 분포의 기본 분자 메커니즘을 연구하기 위해, 우리는 두 가지 유전자 변형 마우스 라인의 조합을 사용하여 감각 뉴런의 TrkA는 발현의 축삭 궤적을 시각화하는 프로토콜을 개발했다. 의 TrkA는 신경 성장 인자 수용체 NGF 용이며 통각 감각 뉴런 (4)의 기능적인 마커이다. 의 TrkA 매우 초기 개발 과정에서 통각 신경 세포에서 발현 및 NGF에 의존하는 신경 세포의 생존, 축삭 성장, arborization 및 대상 신경 분포 5-9을 매개한다. 생쥐의 TrkA taulacZ에서는 야생형의 TrkA 유전자 taulacZ 식 C로 대체추정의 TrkA - 신경 세포의 축삭 형태 (11) 염색 β-여자 (X-GAL)에 의해 가시화 될 수 있도록 assette 10. 이형의 TrkA taulacZ / WT 라인을 사용하여, 우리는 규제 또는 생체 내에서 감각 구 심성 돌기의 발달을 방해 할 수있는 요소를 검사 할 수 있습니다. 더욱이 식의 TrkA 따라서 NGF / 시그널링의 TrkA 부재 메커니즘을 촉진 축삭 성장을 평가하기 위해 사용될 수 동형의 TrkA taulacZ / taulacZ 마우스에 존재하지 않는다. 통각 신경 NGF /의 TrkA뿐만 아니라 축삭 성장에 대한 시그널링에 의존하기 때문에, 또한 생존을 위해, 우리는, 그렇지 세포 죽음에서 그들을 구출 배아 DRG 신경 세포 사멸을 억제하는 것으로, 친 아폽토시스는 Bax 유전자가없는, 다른 마우스 선을 채용 시그널링의 TrkA의 부재하에 관찰 하였다. 백스 - / - (12)는 이와 같이 배경 molecu 허용특히 축삭의 성장 7-9,13-15에 영향을 미치는 신호 전달 경로의 LAR 해부. 의 TrkA에서 - / - : 백스 - / - 마우스는 DRG 뉴런은 생존하지만, 피부에 감각 구 심성 신경 분포가 완전히 (14, 15)를 폐지한다. 우리는 선택적으로 축삭 돌기의 발달에 각각의 기여를 결정하는 신호 전달 경로 활성화 할 수 있습니다. 이 방법의 유틸리티는 다른 유전 수정이의 TrkA taulacZ / taulacZ에 사육하는 경우가 축삭 성장 표현형의 변화에 대한 평가를 할 수 있다는 것입니다 백스 - / - 또는의 TrkA taulacZ / WT : 백스 - / - 배경.

<table><tbody><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6418</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Tech</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Rinse Solution A</td><td>Millipore</td><td>BG-6-B</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Rinse Solution B</td><td>Millipore</td><td>BG-7-B</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Stain Base Solution</td><td>Millipore</td><td>BG-8-C</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>Glass scintiallation vial</td><td>Kimble Chase</td><td>74500-20</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Labline</td><td>Model 120</td><td></td></tr><tr><td>Insect pins</td><td>FST</td><td>26000-30</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>6-well dish</td><td>USA Scientific</td><td>CC7672-7506</td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td>IDT</td><td>custom DNA primers</td><td></td></tr><tr><td>Takara dNTP mixture</td><td>Takara</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>Takara LA buffer</td><td>Takara</td><td>RR002A</td><td></td></tr><tr><td>Takara LA Taq</td><td>Takara</td><td>RR002A</td><td></td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Bio-Rad</td><td>DNA Engine Dyad</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-1042</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl benzoate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-6630</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>M205A</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Leica</td><td>DFC310FX</td><td></td></tr><tr><td>Ring light</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>MEB110</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>Photoshop 4.0</td><td></td></tr></tbody></table>

whole-mount imaging of mouse embryo sensory axon projections

배아 전장 신경 돌기의 시각화는 신경 네트워크가 개발 포유류 방법을 이해하는 것이 필수적이다. 여기에서 우리는 현장에서 여러 유전자 ​​조작 마우스 라인을 사용하여 자신의 표현형 특성을 평가하기 후근 신경절 (DRG) 축삭 돌기의 부분 집합에 레이블을하는 방법을 설명합니다. 양성 뉴런의 TrkA 통증 신호의 송신에 전용 침해 수용체 뉴런이다. 우리는 그대로 마우스 배아의 모든의 TrkA 양성 주변 축삭의 궤도에 라벨의 TrkA taulacZ 마우스 라인을 사용한다. 우리는 더 독립적으로 신경 세포의 생존에 유전자 조작의 가능한 효과의 성장과 관련된 질문을 평가하기 위해, 기본적으로 신경 세포의 사멸을 폐지 백스 널 배경 위에의 TrkA taulacZ 라인을 번식. 이어서, 관심의 유전자 변형 마우스의 TrkA taul와 교배ACZ / Bax의 널 라인은 본 발명에 개시된 기술을 사용하여 연구를위한 준비가되었다. 이 프레젠테이션은 전체 마운트 준비에 전체 길이 축삭 궤적의 시각화 수 있도록 해부, 조직 준비, 염색 및 청소시 상세한 마우스 사육 계획에 대한 자세한 내용은 유전자형이 포함되어 있습니다.

의 TrkA WT / taulacZ의 유전자형 : 백스 - / -과의 TrkA taulacZ / taulacZ : 백스 - / - 배아가 명확하게 표준 PCR 유전형에 의해 결정될 수있다 (그림 1). X-여자 염색 디스플레이는 통상적으로 염색 배아 (그림 2, 3A)에 피하 주변 축삭 아버을 자세히 설명하고, 조직 제거한 후 배아에 걸쳐 (그림 3B, 4). - / - 라인 신경 세포 고유의 네 스틴 프로모터 (17)의 제어하에 구조적으로 키나제 활성화 된 B-RAF (V600E) 돌연변이 (LSL-kaBraf 16)를 운반하는 쥐, 구하는 LSL- 백스 : 우리의 TrkA WT / taulacZ을 사육했다 kaBraf :의 TrkA taulacZ / taulacZ : 백스 - / - 마우스. 완전히의 TrkA 신호 부족이 배아에서, 침해 수용체 주변 돌기의 형태는 그럼에도 불구하고 거의 일반적으로 (그림 4)를 개발했다. 이 보여- / - 유전 적 배경 신호의 TrkA 의존 생존 손실 치환 B-RAF도 주연 축삭 성장 시그널링 등에 대한 SA 중요한 기능은 생존과의 TrkA 시그널링의 기능을 촉진 축삭 성장은 Bax와 함께, 분리 될 수 있다는 것을 보여준다 . <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52212/52212fig1highres.jpg" /> 그림 1 : 형질 전환 마우스의 유전자형 대표 아가 로스 젤 이미지.. 샘플 1 :의 TrkA WT / taulacZ : 백스 WT / -, 샘플 2 :의 TrkA taulacZ / taulacZ : 백스 - / -, 샘플 3 :의 TrkA WT / taulacZ : 백스 - / -. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52212/52212fig2highres.jpg" /> 그림 2 : E18.5의 TrkA WT / taulacZ 마우스 X-여자 염색 삼차 신경의 축삭 돌기를 몸통과 HEA에.D는 해제되지 않은 배아에 표시됩니다. 스케일 바 : 1mm. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52212/52212fig3highres.jpg" /> 그림 3 :. E18.5의 TrkA WT / taulacZ의 전에 X-여자 (A)로 염색 마우스와 중간 몸통에 DRGs에서 BABB 계획으로 삭제 후 (B)가 표시됩니다. 스케일 바 : 2mm. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52212/52212fig4highres.jpg" /> 그림 4 : E16.5 LSL - kaBraf :의 TrkA taulacZ / taulacZ : 백스 - / - :. X-여자 염색과 BABB kaBraf으로 삭제 스틴-Cre 호텔 마우스 배아 키나제 활성화 B-RAF 키나제 단백질을 암호화, B-RAF V600E. DRG 뉴런에서 KAB-RAF의 발현의 TrkA 신호가없는 상태에서 정상 축삭 확장에 가까운 전체 길이, 결과. 스케일 바 : 1mm. 컨트롤을 포함하여 더 많은 이미지를 들어, 심판을 참조하십시오. 15, 그림2. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td colspan="2"> PCR에 사용 된 프라이머 유전자형 </td></tr><tr><td rowspan="3"> (1) </td><td> 의 TrkA </td><td> DNA 단편의 크기 : 400 bp의 </td></tr><tr><td> TrkA_F </td><td> GCG GGC GCC GCC GCG ATG </td></tr><tr><td> TrkA_R </td><td> GAA GCC GCC TGC GCG의 GCT CTG C​​CA GGG TG </td></tr><tr><td rowspan="4"> 이 </td><td> 백스 </td><td> DNA 단편의 크기 : 304 BP (야생형), (507) BP (Bax의 널 (null)) </td></tr><tr><td> In5R </td><td> GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG </td></tr><tr><td> Ex5F </td><td> TGA의 TCA의 GAA CCA TCA TG </td></tr><tr><td> NeoR </td><td> CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG </td></tr><tr><td rowspan="3"> 3 </td><td> TauLacZ </td><td> DNA 단편의 크기 : 360 bp의 </td></tr><tr><td> lacZup </td><td> ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA </td></tr><tr><td> lacZdown </td><td> ATC의 AAC ATT AAA TGT GAG CGA G </td></TR&gt; </tbody></table> 표 1 : 유전자형 PCR에 사용하는 프라이머.

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Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

마우스 배아 감각 축삭 돌기 전체 마운트 이미지

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

whole-mount-imaging-of-mouse-embryo-sensory-axon-projections

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.0K 조회수.  Weill Medical College of Cornell University. We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

비디오: Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in which the enhanced version of the green fluorescent protein (EGFP) is exclusively expressed in all neurons of the developing central and peripheral nervous system1, allowing the possibility to both film the innervation of the forelimb and to manipulate this process with pharmacological and genetic techniques2. The most critical parameter in the successful cultivation of such slice cultures is the method by which the slices are prepared. After extensive testing of a variety of methods, we have found that a vibratome is the best possible device to slice the embryos such that they routinely result in a culture that demonstrates viability over a period of several days, and most importantly, develops in an age-specific manner. For mid-gestation embryos, this includes the normal outgrowth of spinal nerves from the spinal cord and the dorsal root ganglia to their targets in the periphery and the proper determination of skeletal and muscle tissue. 
In this work, we present a method for processing whole embryos of embryonic day (E) E10 to E12 into 300 - 400 micrometer slices for cultivation in a standard tissue culture incubator, which can be studied for up to two days after slice preparation. Critical for the success of this approach is the use of a vibratome to slice each agarose-embedded embryo. This is followed by the cultivation of the slices upon Millicell culture membrane inserts placed upon a small volume of medium, resulting in an interface culture technique. One litter with an average of 7 embryos routinely produces at least 14 slices (2-3 slices of the forelimb region per embryo), which varies slightly due to the age of the embryos as well as to the thickness of the slices. About 80% of the cultured slices show nerve outgrowth, which can be measured througout the culturing period2. Representative results using the tauGFP mouse line are demonstrated.

We present a method to prepare organotypic slices of mid-gestation mouse embryos for the cultivation and time-lapse imaging of peripheral nerve outgrowth.

의 Organotypic 슬라이스 문화 GFP - 표현 주변 신경 가지의 실시간 이미징을위한 마우스 배아를

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

연구

신경과학

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

공 초점 빛 시트 현미경 전체 마우스 두뇌의 마이크론 규모의 해상도 광학 단층 촬영

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

제노푸스 laevis 배아에서 눈부안으로 DNA의 미세 주입 및 GFP의 이미징 그대로 광학 축색 아버를 표현, 살아있는 제노푸스 올챙이

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

발생학

Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel cell clusters), sebaceous glands, nerves and nerve endings, and capillaries. The spatial arrangement of these structures is tightly controlled on a microscopic scale - as seen, for example, in the orderly arrangement of cell types within a single hair follicle - and on a macroscopic scale - as seen by the nearly identical orientations of thousands of hair follicles within a local region of skin. Visualizing these structures without physically sectioning the skin is possible because of the 2-dimensional geometry of this organ. In this protocol, we show that mouse skin can be dissected, fixed, permeabilized, stained, and clarified as an intact two dimensional object, a flat mount. The protocol allows for easy visualization of skin structures in their entirety through the full thickness of large areas of skin by optical sectioning and reconstruction. Images of these structures can also be integrated with information about position and orientation relative to the body axes.

Mammalian skin contains a diverse array of structures - such as hair follicles and nerve endings - that exhibit distinctive patterns of spatial organization. Analyzing skin as a flat mount takes advantage of the 2-dimensional geometry of this tissue to produce full-thickness high-resolution images of skin structures.

마우스의 피부와 모낭 패터닝 및 감각 축삭 형태학의 분석에의 응용의 평면 마운트 이미징

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation

Somitogenesis is a hallmark of vertebrate embryonic development. For years, researchers have been studying this process in a variety of organisms using a wide range of techniques encompassing ex vivo and in vitro approaches. However, most studies still rely on the analysis of two-dimensional (2D) imaging data, which limits proper evaluation of a developmental process like axial extension and somitogenesis involving highly dynamic interactions in a complex 3D space. Here we describe techniques that allow mouse live imaging acquisition, dataset processing, visualization and analysis in 3D and 4D to study the cells (e.g., neuromesodermal progenitors) involved in these developmental processes. We also provide a step-by-step protocol for optical projection tomography and whole-mount immunofluorescence microscopy in mouse embryos (from sample preparation to image acquisition) and show a pipeline that we developed to process and visualize 3D image data. We extend the use of some of these techniques and highlight specific features of different available software (e.g., Fiji/ImageJ, Drishti, Amira and Imaris) that can be used to improve our current understanding of axial extension and somite formation (e.g., 3D reconstructions). Altogether, the techniques here described emphasize the importance of 3D data visualization and analysis in developmental biology, and might help other researchers to better address 3D and 4D image data in the context of vertebrate axial extension and segmentation. Finally, the work also employs novel tools to facilitate teaching vertebrate embryonic development.

Here, we describe computational tools and methods that allow visualization and analysis of three and four-dimensional image data of mouse embryos in the context of axial elongation and segmentation, obtained by in toto optical projection tomography, and by live imaging and whole-mount immunofluorescence staining using multiphoton microscopy.

척추동물 축 신장 및 세분화를 연구하기 위한 세 가지 및 네 차원 시각화 및 분석 접근법

Somitogenesis is a hallmark of vertebrate embryonic development. For years, researchers have been studying this process in a variety of organisms using a ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

배아 운동 뉴런의 Axonal 투영 패턴의 시각화<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in vertebrates. Thus, it is critical to uncover the molecular mechanisms of how motor axons navigate to, arborize, and innervate their peripheral muscle targets during development and degeneration. Although transgenic Hb9::GFP mouse lines have long served to visualize motor axon trajectories during embryonic development, detailed descriptions of the full spectrum of axon terminal arborization remain incomplete due to the pattern complexity and limitations of current optical microscopy. Here, we describe an improved protocol that combines light sheet fluorescence microscopy (LSFM) and robust image analysis to qualitatively and quantitatively visualize developing motor axons. This system can be easily adopted to cross genetic mutants or MN disease models with Hb9::GFP lines, revealing novel molecular mechanisms that lead to defects in motor axon navigation and arborization.

Here, we describe a protocol for visualizing motor neuron projection and axon arborization in transgenic Hb9::GFP mouse embryos. After immunostaining for motor neurons, we used light sheet fluorescence microscopy to image embryos for subsequent quantitative analysis. This protocol is applicable to other neuron navigation processes in the central nervous system.

모터 축 삭 탐색 및 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 배아에서 축 삭 Arborization의 정량화의 시각화

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Visualizing Neuronal and Glial Cell Dynamics in the Developing Mouse Brain

Time-Lapse Imaging of Migrating Neurons and Glial Progenitors in Embryonic Mouse Brain Slices

During the development of the cerebral cortex, neurons and glial cells originate in the ventricular zone lining the ventricle and migrate toward the brain surface. This process is crucial for proper brain function, and its dysregulation can result in neurodevelopmental and psychiatric disorders after birth. In fact, many genes responsible for these diseases have been found to be involved in this process, and therefore, revealing how these mutations affect cellular dynamics is important for understanding the pathogenesis of these diseases. This protocol introduces a technique for time-lapse imaging of migrating neurons and glial progenitors in brain slices obtained from mouse embryos. Cells are labeled with fluorescent proteins using in utero electroporation, which visualizes individual cells migrating from the ventricular zone with a high signal-to-noise ratio. Moreover, this in vivo gene transfer system enables us to easily perform gain-of-function or loss-of-function experiments on the given genes by co-electroporation of their expression or knockdown/knockout vectors. Using this protocol, the migratory behavior and migration speed of individual cells, information that is never obtained from fixed brains, can be analyzed.

저자 스포트라이트: Exploring Cell Migration and Gene Roles in the Developing Brain

During the development of the cerebral cortex, neurons and glial cells originate in the ventricular zone lining the ventricle and migrate toward the brain surface. Many genes are involved in this process. This protocol introduces the technique for the time-lapse imaging of migrating neurons and glial progenitors.

배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

During the development of the cerebral cortex, neurons and glial cells originate in the ventricular zone lining the ventricle and migrate toward the brain ...