The author is grateful for the assistance of Mrs. Sharon Spana (University of Sydney) in rodent monitoring, handling and experimentation. The authorwould like to thank Prof. Jonathan Stone and Dr. Dan Johnstone for the assistance in the preparation of this manuscript. PhD funding support has been provided by University of Sydney and Australian Center for Excellence in Vision.

הצהרת אתיקה: הפרוטוקול כדלקמן הנחיות טיפול בבעלי החיים של אוניברסיטת סידני, AEC # 5657. אלחוש אושר על ידי ועדת אתיקה של בעלי החיים (אוניברסיטת סידני, # AEC 5657). 1. הכנת ציוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש במעקב טמפרטורת עור בזמן אמת. לעבור על מחשב, וחומרת רכישת נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנת הטמפרטורה להרחיב הקלטה ולהתאים את הגדרת טמפרטורה לבין 30-35 מעלות צלזיוס ותדירות דגימה לכל 100 אלפית שניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: מדחום רקטלי הכנס על מנת להבטיח טמפרטורת ליבה נותר יציב ב37.5 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2. כיול של המד לחץ הדם הידני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר שרוול זרוע ילוד לsphygmomanometer.Use גודל 2 שרוול לחולדת 250-550 גר &#39;. מתאם ייתכן שיהיה צורך לחבר את צינורות שרוול למד לחץ הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוציא את האוויר השרוול או על ידי התרופפות שסתום שחרור אוויר או ניתוק צינורות שרוול מלהתאיםאו. להבטיח שאין לחץ נשאר בצינור ואת מחט מד הלחץ מוטלת על אפס בתוך האליפסה / המלבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הלחץ בין צינורות, מד לחץ ושרוול. לנפח את השרוול עם משאבות עדינות של הנורה האינפלציה עד שקורא על מד הלחץ 100 מ&quot;מ כספית. ודא לחץ נשאר קבוע. להוציא את האוויר השרוול ידי פתיחת ערך שחרור האוויר לאט. </li></ol> 3. הכנת בעלי החיים הערה: בעלי חיים, כי הם לעבור פציעת אור דורשים adaption הכהה בלילה שלפני איסכמיה מרחוק. בעלי חיים עוברים נזק קל דורשים גידול (אור 12 שעות: מחזור כהה (5 סוויטה דה לוקס)) אפל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע איסכמיה המרוחקת בשני מכרסמים ער או anesthetised. ודא שיש לי חיות טונוס שרירים בריאים. להבטיח זאת על ידי צביטת הגפיים האחורי העליונים כדי לאשר יש הווה שריר נאות. הגנה מושרה RIP מפני פגיעת אור נבדקה בחולדות בישיבה עד גיל 6 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת anesthetised לRIP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק חולדות עם זריקת intraperitoneal של 60 מ&quot;ג / קילוגרם קטמין ו -5 מ&quot;ג / קילוגרם xylazine. בדוק את עומק ההרדמה על ידי הרחבת הרגל וצובט את העור בחלק התחתון של כף הרגל. יש בעלי החיים לא רפלקס אם הוא anesthetised עמוק. החל דמעות מלאכותיות כדי למנוע יובש בקרנית תוך תחת הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים חולדות בשתי כרית חום או במחזור צינורות דוד כדי לשמור על טמפרטורת גוף קבועה של 37.5 מעלות צלזיוס. מקם את העכברוש במצב שכיבה עם כריות כף הרגל של הגפיים התחתונים פונות כלפי מעלה. ימין או שמאל האיבר עשוי לעבור איסכמיה מרחוק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה ערה לRIP הערה: ער ניסויים בבעלי החיים דורשים שני אנשים. אדם אחד מרסן את החיה והאדם השני מפעיל את מד לחץ דם הידני. הנסיינים חייבים להיות בטוחים כדי לבצע את ההליך כאיפוק מעלה את הסיכון לפגיעה במפעילים. החולדות שעברו איסכמיה מרחוק חייבת להיות מותנות to איפוק במדריך. בהתאם להנחיות האינטואיטיבית איפוק במדריך צריך להיות התקדמות מ 30 שניות עד למקסימום של 5 דקות על פני מספר השבועות. בעלי חיים ביישנים שלא מצליחים להסתגל לריסון ספר צריכים להיות מחוץ ניסויים ער. לבסוף, איפוק ידני עשוי לגרום ללחץ (ואפשרות להציג את בלבול למחקר) לבעלי חיים ומחזור דמה (מיקום של שרוול ללא דלקת) יש להשתמש כדי לפרש במדויק תוצאות מחקר RIP. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך מגבת לתוך 15 סנטימטרים x 30-50 סנטימטר ומניח חתיכת הקצה הקצר בניצב לעמוד השדרה של החולדה, כיסוי הראש לראש הגפיים האחורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתחוב את הקצה הקצר מתחת לגופו של העכברוש בחוזקה ומתחיל לעטוף את העכברוש עם הקצה הארוך הנותר של מגבת. אבטח את בעלי החיים עטופים תחת הזרוע במצב שכיבה. אם החולדה מוחזקת ביד השמאל, לשחרר את האיבר תקין של החולדה מהמגבת. </li></ol></li></ol> o 4. יישוםבדיקה טמפרטורת עור F <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הארך את הרגל של העכברוש שהוא לעבור איסכמיה ולמקם את הבדיקה העור על השודד. מקם את הבדיקה העור למקסם את הקשר בין הבדיקה הטמפרטורה והעור. בתוקף לדחוף את החללית לשודדת הדרכים ולהדביק את החללית עם קלטת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את מיקום הבדיקה עור על ידי מעקב הטמפרטורה בתוכנת הקלטת טמפרטורה. ודא שטמפרטורת העור היא בין 30-34 מעלות צלזיוס ונשארה יציב. עקוב אחר טמפרטורת העור במשך 1-2 דקות. התאם את הבדיקה העור אם הטמפרטורה היא יציבה או מתחת ל -30 מעלות צלזיוס. </li></ol> 5. איסכמיה מרחוק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוציא את האוויר השרוול ולהבטיח את שסתום לחץ האוויר סגור. הארך את הרגל ורופפת להקיף את השרוול על הגפיים האחורי העליונים. השתמש באצבע והאגודל להאריך את הרגל ואת הספרות נמוכה יותר כדי לשמור על השרוול הרופף בעמדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעלות את לחץ השרוול של החיה anesthetised 160 מ&quot;מ כספית, ובחיות ערה increASE לחץ השרוול 180 מ&quot;מ כספית. הערה: לחץ דם anesthetised של חולדות נע 120-140 מ&quot;מ כספית ועולה ל 160 מ&quot;מ כספית כאשר מודע. להתחיל הקלטות טיימר וטמפרטורת רגל פעם אחת הוא הגיע בלחץ הנכון. הערה: טמפרטורת הרגל צריכה לרדת ב -2 מעלות צלזיוס לאחר 5 דקות של לחץ מתמיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על המיקום של השרוול מעל &quot;הברך&quot; של בעלי החיים ברחבי איסכמיה. לחץ השרוול יתחיל לרדת לאחר כמה דקות, או אם האיבר של החולדה נע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוב ושוב לשאוב את הנורה האינפלציה בפרצים קצרים כדי לשמור על צרור קצר החוזר ונשנה לחץ שרוול הרצוי של שאיבה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסכמיה מרחוק יכולה להיות מועברת ברציפות בין 5 ל 15 דקות. פרוטוקול reperfusion איסכמיה כולל 2 תקופות של 5 דקות עם איסכמיה reperfusion 5 דקות חלף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוציא את האוויר בלחץ השרוול על ידי שחרור שסתום לחץ האוויר. בדוק את שינוי הטמפרטורה במהלך פרו איסכמיהtocol. שחרר את השרוול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמשיך עם ניסויים פציעה. בעלי חיים תחת השפעת ההרדמה יצטרכו להיות ממוקמים על משטח חום. תמשיך לעקוב אחר בעלי חיים עד אמבולטורי. לא ניתן להחזיר בעלי חיים לדיור עד הליכה. </li></ol> 6. אור פגיעה - רשתית ניוון דגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dark להתאים את החיות הלילה (שעות 12-15). מייד לאחר איסכמיה אוויר מרוחק או איסכמיה דמה מרחוק (ריסון בעלי חיים) בעלי חיים במקום דיור פרספקס עם מזון ומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור על תאורת ניאון (1,000 לוקס) ממוקמת מעל דיור פרספקס שעה 9 בבוקר ל -24 שעות. בעקבות חשיפה לאור, להחזיר את בעלי החיים ללעמעם תאורה מחזורית למשך 7 ימים. </li></ol> נהלי איסכמיה 7. לאחר מרחוק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת חזון עם electroretinogram (ERG): הערה: הגדרת ERG ובזק פרוטוקול אחרי ברנדלי ואבן 26. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dark להסתגל חיות לילה (12-15 שעות). תחתלעמעם תאורה אדומה להרדים בעלי החיים על ידי זריקת intraperitoneal של קטמין ו xylazine (60 מ&quot;ג / קילוגרם ו 5 מ&quot;ג / קילוגרם, בהתאמה). Mydriatic (סולפט אטרופין 1.0%), הרדמה קרנית (proxymetacaine 0.5%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל לחות קרנית העין (פולימר קרבומר) יורדת באופן מיידי לקרנית. החל ג&#39;ל עיניים ב 20 דקות במרווחים לשמור על הידרציה קרנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצייר חוט קשור ברפיון סביב גלגל העין כדי לסייע הקלטות ERG יציבים. צג טמפרטורה באמצעות בדיקה רקטלית ולשמור על טמפרטורת הגוף של בעלי החיים ב37-37.5 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את הראש בתוך תחום שילוב Ganzfeld. הערה: Ganzfeld הוא גירוי אור לתכנות מלא, המספק הבזקים כהוא אחידים מנוריות לעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את electroretinogram באמצעות אלקטרודה מחוייט פלטינה 4 מ&quot;מ חיובית נוגעת קלות הקרנית וקוטר 2 מ&quot;מ אלקטרודה גלולה Ag / AgCl מוכנס לתוך הפה. התייחסות הן לאלקטרודות מחט נירוסטההוכנס מתחת לעור לתוך העכוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא אותות עם הגדרת להקה עוברת מ0.3-1,000 הרץ (-3 dB), עם רכישה בשיעור 2 קילוהרץ (מכשירים לספירה). לאחר הקלטת ERG יציבה הוקמה נושא בעלי החיים להסתגלות כהה 10 דקות לפני תחילת הקלטות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את פרוטוקול הבזק כפי שתואר בעבר על ידי ברנדלי ואבן 26. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתכנת את משך הבזק (השתמשנו הבזקים 1-2 אלפית שני בזמן), ולהגדיר את עוצמתו ל-4.4 ל -2.0 יומן סקוטי cd.sm -2. השתמש הבזקים בהירים (cd.sm 2.0 יומן הסקוטי -2, 1 ms) כדי למדוד את תפקוד הרשתית. במחקר זה היא ההשוואה בין שליטה, פציעה קלה ופציעה קלה עם RIP. </li></ol></li></ol></li></ol> 8. TUNEL Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים בעלי חיים על ידי זריקת intraperitoneal של מנת יתר phenobarbital (100 מ&quot;ג / קילוגרם). Enucleate העיניים ולתקן paraformaldehyde 4%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העיניים בPBS לפני cyroprotectingעיני הלילה ב -30% סוכרוז (w / v). להטביע את העיניים במתחם OCT וחתוך למקטעים של 20 מיקרומטר sagittal באמצעות cryostat. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את assay TUNEL על סעיפי רשתית עם מכתים DAPI הבא הפרוטוקול של et al Maslim. 27 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי לספירת TUNEL של הרשתית. תאי TUNEL נרשמו מהשכבה החיצונית הגרעינית (ONL); השכבה החיצונית ביותר של הרשתית המכילה גרעיני קולטי האור. במחקר זה, ספירת TUNEL נעשתה בשלושה עותקים לכל עין, עם 5 עיניים לכל קבוצת טיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמשו בכיוון אחד ANOVA לקבוצה סטטיסטית להשוות אמצעי שליטה, פציעה קלה, וחולדות פציעה + RIP אור. </li></ol>

The author has nothing to disclose.

איסכמיה גפיים אחוריות מכרסמים הייתה מושרה בהצלחה עם מד לחץ דם ידני ולאזוק את אספקת neuroprotection לקולטני האור ברשתית. ממצא עקבי עם הגנת אוויר מושרה איסכמי של קולטני האור מפגיעת אור 9,28. בעיקרו של דבר, איסכמיה מרחוק גורמת מחסור בחמ...

הישרדותם של רוב, אולי כל, רקמות לנוכח לחץ מטבולים ניתן לשפר על ידי אוויר מראש עם תקופה של איסכמיה sublethal 1,2. נפשית מראש איסכמי (IP) במונחים מעשיים הוא החשיפה של רקמה לאיסכמיה sublethal, לפני חוויות רקמת לחץ חמור יותר, כגון עלבון איסכמי שלאחר מכן. במודלים של בעלי חיים, IP מספק הגנה מדהימה למוח, הרשתית, לב וריאות 3-6. במקביל, תצפיות בחולי שבץ מוחי הראו קשר בין פיגועים הקודמים איסכמי חולפים ותוצאות קליניות טובות יותר 7,8. IP גם מגן קולטני האור ברשתית מפציעות שאינן איסכמי 9. היעילות של IP ברקמות ופציעות שונות מצביעה על כך שהוא מפעיל מנגנון מולד של תא הישרדות נוכחת בכל הרקמות. נפשית מראש איסכמי של שריר הלב כבר הציע לי השפעות מגנות דרך upregulationשל גורם היפוקסיה מושרה (HIF), ידוע להסדיר רבים מסלולים מטבוליים באמצעות שחרור אדנוזין או באמצעות פתיחת ערוצי אשלגן ATP במיטוכונדריה 10,11. ערוצי שחרור אדנוזין ואשלגן ATP הם מעורבים באיסכמיה מוחית אבל, חקירות מנגנוני ההגנה העצביות של אוויר איסכמי עד כה התמקדו בשינויים באנטי-הפעלת יתר רעילה, מסלולים אנטי-אפופטוטיים ואנטי דלקתיים 12,13. בסך הכל, הבנה של התהליך המולקולרי של אוויר להגנה על תאי עצב איסכמי היא מוגבלת. ניסיונות נפשית מראש איסכמי מרחוק להתנות איברים מרוחקים חשובים ביותר (לב, מוח, ריאות) על ידי יצירת איסכמיה ברקמות פחות קריטיות. נפשית מראש מרחוק איסכמי (RIP) באמצעות הגפיים האחוריות הודגם להיות neuroprotective במודלים של מכרסמים של שבץ 14-17. השיטה שתוארה על ידי מספקת prot פשוט, אמין ולא פולשניocol גרימת RIP. הרוב המכריע של פרוטוקולי RIP כרוך הגפיים האחורי, כנראה משום שעורק הירך ממוקם בגפיים האחורי העליונים ניתן לזהות בקלות והגישה להידוק כירורגית ויישום חוסם עורקים. במחקרי איסכמי איבר פולשני לחקר המוח והגנת עור, איסכמיה מושרה על ידי הפרדת עורק הירך מרצועות המפשעה ומהדק את עורק הירך 2,15,18. איסכמיה כתוצאה מהידוק עורק או כבילת איבר או הירך אושרה על ידי שינויים באיבר כולל אובדן של דופק, ירידה בחמצון וירידה בטמפרטורת עור. איסכמיה מרחוק יכולה להיות מאושרת על ידי האובדן של דופק באמצעות דופלר לייזר או דופלר אולטרה סאונד 17-19. טמפרטורת עור יכולה לשמש כחלופה לדופלר למרות מערכת היחסים היא אינו ליניארי 20,21. הקלטות טמפרטורה מדויקות הן דבר שבשגרה במעבדות ופחיתלהיות משולב בקלות לתוך מחקרי איסכמי מרחוק. אלטרנטיבה לירך מהדקת ניתוח היא האינדוקציה של איסכמיה באמצעות חוסם עורק. יישום חוסם עורקים מייצר איסכמיה דומה לזה שהושג עם הידוק כלי; Kutchner et al. לעומת עורק הירך פולשנית מהדק לחוסם עורק שאינו פולשני ומצא שני השיטות הופסקו זרימת דם לאיבר ונזק לעור מופחת במודל ניתוח פלסטי של איסכמיה דש עור 18. איזוק או הרגל או זרוע והעלאת לחץ השרוול לעיל לחץ דם הסיסטולי נמצא להיות מגן מפני נזק איסכמי בחזירים ובני אדם 17,19,22. חוסם עורקים גישות שונים לגרימה מרוחקת איסכמי כולל שימוש בשרוול לחץ דם או 17,22,23 גומייה. עם זאת, השימוש בגומייה כדי לגרום לאיסכמיה הוא שיטה בטוחה, פוטנציאל עלייה נותנת לסכום מוסדר של לחץ באיבר, עם עליות בלחץ מעל 500 מ&quot;מ כספית מוקלט בבני אדם 24. יתר על כן, איסכמיה האיבר באמצעות גומייה מובילה לנזק לשרירים בחולדות לאחר הסרת הלהקה 23, כפי שהוערך על ידי אוונס הכחול צבע, סמן vivo של חדירות myofiber 25. לעומת זאת, משלוח של לחץ מבוקר לחוסם העורק יכול להיות מושגת באמצעות שרוול לחץ דם קשור ל17,19,22,26 מד לחץ דם. במחקר זה, מודל פציעה קל של ניוון קולטי האור שימש כדי להדגים את היעילות של נוירו נפשית מראש איסכמי מרחוק. איסכמיה מרחוק הייתה מושרה באופן מיידי לפני פציעה קלה, ומנעה ניוון קולטי האור הבא כפי שאושרה על ידי בדיקת תפקוד רשתית. הווידאו הנלווה ידגים את היישום של איסכמיה המרוחקת לא פולשנית.

<table><tbody><tr><td>Gold series DuraShock hand aneroid sphygmomanometer</td><td>Welch Allyn</td><td>DS56</td><td>Manual Sphygmomanometer</td></tr><tr><td>Neonate [size 2] 1 tube, 10 pack</td><td>Welch Allyn</td><td>5082-102-1</td><td>Limb blood pressure cuff</td></tr><tr><td>Luer lock adaptor</td><td>Welch Allyn</td><td>5082-178</td><td>Adaptor for neonatal cuff</td></tr><tr><td>Thermistor pod</td><td>AD Instruments</td><td>ML 309</td><td>skin tempertature unit</td></tr><tr><td>Skin temperture probe</td><td>AD Instruments</td><td>MLT 422/A</td><td></td></tr><tr><td>Powerlab, 4 channel acquistion hardware</td><td>AD Instruments</td><td>PL 35044</td><td></td></tr><tr><td>Homeothermic blanket system with flexible probe</td><td>Harvard Appartus</td><td>507222F</td><td></td></tr><tr><td>Towel</td><td></td><td></td><td>optional: awake remote ischemia</td></tr><tr><td>Isoflo - 100% Isoflurane (250 ml)</td><td>Abbot Animal Health</td><td>05260-05</td><td>optional: inhaltion anaesthetic remote ischemia</td></tr><tr><td>Ketamil - ketamine 100 mg/ml (50 ml)</td><td>Troy Laboratories Pty Ltd</td><td></td><td>optional: injectable anaesthetic remote ischemia</td></tr><tr><td>Xylium - Xylazine 100 mg/ml (50 ml)</td><td>Troy Laboratories Pty Ltd</td><td></td><td>optional: injectable anaesthetic remote ischemia</td></tr></tbody></table>

remote limb ischemic preconditioning:  a neuroprotective technique in rodents

איסכמיה sublethal מגנה על רקמות מפני איסכמיה לאחר מכן, חמורה יותר באמצעות גברת הביטוי של מנגנונים אנדוגניים ברקמה הפגועה. איסכמיה sublethal גם הוכחה upregulate מנגנוני הגנה ברקמות מרוחקות. תקופה קצרה של איסכמיה (5-10 דקות) בגפיים האחורי של יונקים גורמת תגובות של הגנה עצמית במוח, הריאות, הלב והרשתית. ההשפעה ידועה כנפשי מראש מרוחק איסכמי (RIP). זוהי דרך טיפולית מבטיחה להגן על איברים חיוניים, וכבר נמצאה בניסויים קליניים לפציעות לב והמוח. פרסום זה מדגים שיטה מבוקרת, פולשנית של קבלת איבר - במיוחד הגפיים האחורי של חולדה - איסכמי. שרוול לחץ דם שפותח לשימוש בילודים אדם מחובר למד לחץ דם ידני ומשמש להפעלת לחץ מ&quot;מ כספית 160 סביב החלק העליון של הגפיים האחורי. בדיקה נועדה לזהות טמפרטורת עור משמשת כדי לוודא ischemi, על ידי הקלטת הירידה בטמפרטורת עור נגרמת על ידי חסימה נגרם לחץ של עורקי הרגל, והעלייה בטמפרטורה העוקבת שחרור של השרוול. שיטה זו של RIP מקנה הגנה לרשתית העכברוש מפני נזק הנגרם על-אור בהיר וניוון.

שרוול לחץ דם גבוה למעל 160 מ&quot;מ כספית עוצר את זרימת דם לגפיים האחורי כפי שניתן לראות בבירור באיור 1. חוסר חמצון רקמות הביא הפחתת טמפרטורת הרגל של בעל החיים לפרוטוקול איסכמיה reperfusion (איור 2). טמפרטורת הרגל (33 מעלות צלזיוס) הייתה נמוכה מטמפרטורת ליבה ומו?...

Watch this Scientific Journal Video about Remote Limb Ischemic Preconditioning:  A Neuroprotective Technique in Rodents at JoVE.com

Remote Limb Ischemic Preconditioning:  A Neuroprotective Technique in Rodents

נפשית מראש איסכמי מרחוק (RIP) הוא שיטה של ​​רקמות אוויר נגד לחץ מזיק. הקמנו שיטה של ​​איסכמיה מרחוק בגפיים האחורי, על ידי ניפוח שרוול מד לחץ דם למשך 5-10 דקות. יכולות ההגנה העצביות של RIP הוכחו במודל של ניוון רשתית במכרסמים.

איבר מרוחק איסכמי אכשור קד: טכניקת neuroprotective במכרסמים

Sublethal ischemia protects tissues against subsequent, more severe ischemia through the upregulation of endogenous mechanisms in the affected tissue. ...

remote-limb-ischemic-preconditioning-neuroprotective-technique

Research

JoVE Journal

Medicine

11.0K Views.  University of Sydney.  נפשית מראש איסכמי מרחוק (RIP) הוא שיטה של ​​רקמות אוויר נגד לחץ מזיק. הקמנו שיטה של ​​איסכמיה מרחוק בגפיים האחורי, על ידי ניפוח שרוול מד לחץ דם למשך 5-10 דקות. יכולות ההגנה העצביות של RIP הוכחו במודל של ניוון רשתית במכרסמים. 

Video: Remote Limb Ischemic Preconditioning:  A Neuroprotective Technique in Rodents

Strategies for Study of Neuroprotection from Cold-preconditioning

Neurological injury is a frequent cause of morbidity and mortality from general anesthesia and related surgical procedures that could be alleviated by development of effective, easy to administer and safe preconditioning treatments. We seek to define the neural immune signaling responsible for cold-preconditioning as means to identify novel targets for therapeutics development to protect brain before injury onset. Low-level pro-inflammatory mediator signaling changes over time are essential for cold-preconditioning neuroprotection. This signaling is consistent with the basic tenets of physiological conditioning hormesis, which require that irritative stimuli reach a threshold magnitude with sufficient time for adaptation to the stimuli for protection to become evident.
Accordingly, delineation of the immune signaling involved in cold-preconditioning neuroprotection requires that biological systems and experimental manipulations plus technical capacities are highly reproducible and sensitive. Our approach is to use hippocampal slice cultures as an in vitro model that closely reflects their in vivo counterparts with multi-synaptic neural networks influenced by mature and quiescent macroglia / microglia. This glial state is particularly important for microglia since they are the principal source of cytokines, which are operative in the femtomolar range. Also, slice cultures can be maintained in vitro for several weeks, which is sufficient time to evoke activating stimuli and assess adaptive responses. Finally, environmental conditions can be accurately controlled using slice cultures so that cytokine signaling of cold-preconditioning can be measured, mimicked, and modulated to dissect the critical node aspects. Cytokine signaling system analyses require the use of sensitive and reproducible multiplexed techniques. We use quantitative PCR for TNF-&alpha; to screen for microglial activation followed by quantitative real-time qPCR array screening to assess tissue-wide cytokine changes. The latter is a most sensitive and reproducible means to measure multiple cytokine system signaling changes simultaneously. Significant changes are confirmed with targeted qPCR and then protein detection. We probe for tissue-based cytokine protein changes using multiplexed microsphere flow cytometric assays using Luminex technology. Cell-specific cytokine production is determined with double-label immunohistochemistry. Taken together, this brain tissue preparation and style of use, coupled to the suggested investigative strategies, may be an optimal approach for identifying potential targets for the development of novel therapeutics that could mimic the advantages of cold-preconditioning.

We seek to define the neural immune signaling responsible for cold-preconditioning as means to identify novel targets for therapeutics development to protect brain before injury onset. We present strategies for such work that require biological systems, experimental manipulations plus technical capacities that are highly reproducible and sensitive.

אסטרטגיות לחקר neuroprotection מן הקרה נפשית מראש

Neurological injury is a frequent cause of morbidity and mortality from general anesthesia and related surgical procedures that could be alleviated by ...

Neuroscience

Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We have established bilateral common carotid artery occlusion as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to transient focal cerebral ischemia in C57Bl6/J mice. In this video, we will demonstrate the methodology used for this study.

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning (PC) &#x2013; a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We established bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO) as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance (IT) to transient focal cerebral ischemia (induced by middle cerebral artery occlusion, MCAO) in C57Bl6/J mice.

ספיגה דו צדדי משותף עורק תרדמה כגירוי נפשית מראש מספיק כדי לגרום סובלנות איסכמי מוקדמת לאיסכמיה מוחית מיקוד

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a ...

Murine Model of Hindlimb Ischemia 

In the United States, peripheral arterial disease (PAD) affects about 10 million individuals, and is also prevalent worldwide. Medical therapies for symptomatic relief are limited. Surgical or endovascular interventions are useful for some individuals, but long-term results are often disappointing. As a result, there is a need for developing new therapies to treat PAD. The murine hindlimb ischemia preparation is a model of PAD, and is useful for testing new therapies. When compared to other models of tissue ischemia such as coronary or cerebral artery ligation, femoral artery ligation provides for a simpler model of ischemic tissue. Other advantages of this model are the ease of access to the femoral artery and low mortality rate. 
In this video, we demonstrate the methodology for the murine model of unilateral hindimb ischemia. The specific materials and procedures for creating and evaluating the model will be described, including the assessment of limb perfusion by laser Doppler imaging. This protocol can also be utilized for the transplantation and non-invasive tracking of cells, which is demonstrated by Huang et al.1.

Murine Model of Hindlimb Ischemia

The surgical procedure for induction of unilateral hindlimb ischemia is demonstrated, with confirmation of ischemia by laser Doppler perfusion imaging.

דגם Murine של איסכמיה Hindlimb

In the United States, peripheral arterial disease (PAD) affects about 10 million individuals, and is also prevalent worldwide.  Medical therapies for ...

Biology

Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion

Background 
Lower extremity paralysis continues to complicate aortic interventions. The lack of understanding of the underlying pathology has hindered advancements to decrease the occurrence this injury.&#160;The current model demonstrates reproducible lower&#160;extremity paralysis following thoracic aortic occlusion.
Methods 
Adult male C57BL6 mice were anesthetized with isoflurane. Through a cervicosternal incision the aorta was exposed. The descending thoracic aorta and left subclavian arteries were identified without entrance into pleural space. Skeletonization of these arteries was followed by immediate closure (Sham) or occlusion for 4 min (moderate ischemia) or 8 min (prolonged ischemia). The sternotomy and skin were closed and the mouse was transferred to warming bed for recovery.&#160; Following recovery, functional analysis was obtained at 12 hr intervals until 48 hr.
Results 
Mice that underwent sham surgery showed no observable hind&#160;limb deficit. Mice subjected to moderate ischemia for 4 min had minimal functional deficit at 12 hr followed by progression to complete paralysis at 48 hr. Mice subjected to prolonged ischemia had an immediate paralysis with no observable hind-limb movement at any point in the postoperative period. There was no observed intraoperative or post&#160;operative mortality.
Conclusion 
Reproducible lower extremity paralysis whether immediate or delayed can be achieved in a murine model. Additionally, by using a median sternotomy and careful dissection, high survival rates, and reproducibility can be achieved.

The lack of mechanistic understanding of spinal cord ischemia-reperfusion injury has hindered further adjuncts to prevent paraplegia following high risk aortic operations. Thus, the development of animal models is imperative. This manuscript demonstrates reproducible lower extremity paralysis following thoracic aortic occlusion in a murine model.

פרפלגיה Reproducable ידי בית חזה אבי העורקים ספיגה במודל Murine של חוט השדרה איסכמיה reperfusion

Background
Lower extremity paralysis continues to complicate aortic interventions. The lack of understanding of the underlying pathology has hindered ...

Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the retina. The ERG is a sensitive measure of changes in retinal function that are pan-retinal, but is less effective for detecting damage confined to a small area of retina. In the present work we describe how to record the &#8216;flash&#8217; ERG, which is the potential generated when the retina is exposed to a brief light flash. We describe methods of anaesthesia, mydriasis and corneal management during recording; how to keep the retina dark adapted; electrode materials and placement; the range and calibration of stimulus energy; recording parameters and the extraction of data. We also describe a method of inducing ischemia in one limb, and how to use the ERG to assess the effects of this remote-from-the-retina ischemia on retinal function after light damage. A two-flash protocol is described which allows isolation of the cone-driven component of the dark-adapted ERG, and thereby the separation of the rod and cone components. Because it can be recorded with techniques that are minimally invasive, the ERG has been widely used in studies of the physiology, pharmacology and toxicology of the retina. We describe one example of this usefulness, in which the ERG is used to assess the function of the light-damaged retina, with and without a neuroprotective intervention; preconditioning by remote ischemia.

The electroretinogram (ERG) is an electrical potential generated by the retina in response to light. This paper describes how to use the ERG to assess retinal function, in dark-adapted rats, and how it can be can be used to assess a neuroprotective intervention, in the present case remote ischemic preconditioning.

שימוש בelectroretinogram כדי להעריך את התפקוד ברשתית מכרסמים וההשפעות המגנות של האיבר המרוחק איסכמי אכשור קד

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the ...

Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week protocol for repetitive hypoxic preconditioning (RHP) induces long-term protection against central nervous system (CNS) injury in a mouse model of focal ischemic stroke. RHP consists of 9 stochastic exposures to hypoxia that vary in both duration (2 or 4 hr) and intensity (8% and 11% O2). RHP reduces infarct volumes, blood-brain barrier (BBB) disruption, and the post-stroke inflammatory response for weeks following the last exposure to hypoxia, suggesting a long-term induction of an endogenous CNS-protective phenotype. The methodology for the dual quantification of infarct volume and BBB disruption is effective in assessing neurovascular protection in mice with RHP or other putative neuroprotectants. Adult male Swiss Webster mice were preconditioned by RHP or duration-equivalent exposures to 21% O2 (i.e. room air). A 60 min transient middle cerebral artery occlusion (tMCAo) was induced 2 weeks following the last hypoxic exposure. Both the occlusion and reperfusion were confirmed by transcranial laser Doppler flowmetry. Twenty-two hr after reperfusion, Evans Blue (EB) was intravenously administered through a tail vein injection. 2 hr later, animals were sacrificed by isoflurane overdose and brain sections were stained with 2,3,5- triphenyltetrazolium chloride (TTC). Infarcts volumes were then quantified. Next, EB was extracted from the tissue over 48 hr to determine BBB disruption after tMCAo. In summary, RHP is a simple protocol that can be replicated, with minimal cost, to induce long-term endogenous neurovascular protection from stroke injury in mice, with the translational potential for other CNS-based and systemic pro-inflammatory disease states.

This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.

כימות של הגנת עצבים וכלי דם בעקבות חסימת עורק חוזר חוסר חמצן אכשור קד וחלוף התיכון מוחין של עכברים

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.

The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

אינדוקציה והערכה של איסכמיה reperfusion פגיעה בלבבות עכברוש Langendorff-perfused

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia

Peripheral artery disease (PAD) is a leading cause of cardiovascular morbidity and mortality in developed countries, and animal models that reliably reproduce the human disease are necessary to develop new therapies for this disease. The mouse hindlimb ischemia model has been widely used for this purpose, but the standard practice of inducing acute limb ischemia by ligation of the femoral artery can result in substantial tissue necrosis, compromising investigators&#39; ability to study the vascular and skeletal muscle tissue responses to ischemia. An alternative approach to femoral artery ligation is the induction of gradual femoral artery occlusion through the use of ameroid constrictors. When placed around the femoral artery in the same or different locations as the sites of femoral artery ligation, these devices occlude the artery over 1 - 3 days, resulting in more gradual, subacute ischemia. This results in less substantial skeletal muscle tissue necrosis, which may more closely mimic the responses seen in human PAD. Because genetic background influences outcomes in both the acute and subacute ischemia models, consideration of the mouse strain being studied is important in choosing the best model. This paper describes the proper procedure and anatomical placement of ligatures or ameroid constrictors on the mouse femoral artery to induce subacute or acute hindlimb ischemia in the mouse.

Surgical induction of hindlimb ischemia in the mouse is useful to examine angiogenesis, however this is compromised in certain inbred mouse strains that display marked ischemia-induced tissue necrosis. Methods are described to induce subacute limb ischemia using ameroid constrictors to circumvent this problem through the induction of gradual arterial occlusion.

שיטות חריפה subacute Murine Hindlimb איסכמיה

Peripheral artery disease (PAD) is a leading cause of cardiovascular morbidity and mortality in developed countries, and animal models that reliably ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

נוירונים חוט השדרה בידוד ותרבות מ עכברים ניאונטליים

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for neuroprotection, postconditioning treatments have proven to be promising therapies against cerebral ischemia. However, complicated procedures and potential safety issues limit their clinical application. To overcome these disadvantages, we have developed acidic postconditioning (APC) as a therapy for experimental focal cerebral ischemia. APC refers to the mild acidosis treatment by inhaling CO2 during reperfusion following ischemia. Here we present two models to execute APC in vitro and in vivo, respectively. The oxygen-glucose deprivation (OGD) treatment of mice and the corticostriatal occlusion and middle cerebral artery occlusion (MCAO) of mice were employed to mimic cerebral ischemia. APC can be simply achieved by transferring brain slices to acidic buffer bubbled with 20% CO2, or by mice inhaling 20% CO2. APC showed significant protective effects against cerebral ischemia, as reflected by tissue viability and brain infarct volume.

Acidic postconditioning protects against cerebral ischemia. Here we present two models to execute APC. They are achieved respectively by transferring corticostriatal slices to acidic buffer after oxygen-glucose deprivation in vitro and by inhaling 20% CO2 after middle cerebral artery occlusion in vivo.