The author is grateful for the assistance of Mrs. Sharon Spana (University of Sydney) in rodent monitoring, handling and experimentation. The authorwould like to thank Prof. Jonathan Stone and Dr. Dan Johnstone for the assistance in the preparation of this manuscript. PhD funding support has been provided by University of Sydney and Australian Center for Excellence in Vision.

윤리 문 : 프로토콜은 5657 # AEC 시드니 대학의 동물 관리 가이드 라인을 따른다. 마취 동물 윤리위원회 (시드니 대학, AEC # 5657)에 의해 승인되었다. 1. 장비 준비 <ol><li> 실시간 피부 온도 추적을 사용합니다. 컴퓨터에 스위치, 데이터 수집 하드웨어. </li><li> 열기 온도 레코딩 소프트웨어 및 온도 ° 30 ~ 35 사이의 C로 설정하고 매 100 밀리 초에 샘플링 주파수를 조정합니다. </li><li> 옵션 : 코어 온도를 보장하기 위해 삽입 직장 온도계가 37.5 ° C에서 안정적으로 유지. </li></ol> 수동 혈압계 2. 교정 <ol><li> 250~550그램 쥐에 대한 크기 2 커프를 sphygmomanometer.Use하는 신생아 팔 커프를 연결합니다. 어댑터는 혈압계 커프에 튜브를 연결하는 것이 필요할 수있다. </li><li> 하나의 공기 방출 밸브를 느슨하게하거나 적응로부터 커프 튜브를 분리하여 커프를 수축나. 더 압력을 확인하지하면 튜브에 남아 및 압력계의 바늘은 타원형 / 사각형 안에 제로에 달려있다. </li><li> 배관, 압력계와 팔목 사이의 압력을 확인합니다. 이 압력계 100 mmHg로 표시 될 때까지 인플레이션 전구의 부드러운 펌프 커프를 부풀려. 압력이 일정하게 유지 확인. 천천히 공기 방출 값을 개방함으로써 커프를 수축. </li></ol> 3. 동물 준비 참고 : 어두운 적응을 필요로 빛 부상을 받아야하는 원격 허혈 전날 밤입니다 동물. 가벼운 손상을받은 동물은 어두운 양육 (12 시간 빛을 : 어두운주기 (5 룩스)) 필요 <ol><li> 깨어 또는 anesthetised 설치류 중 하나에서 원격 허혈을 수행합니다. 동물이 건강한 근육이 있는지 확인합니다. 적절한 근육의 존재가 확인하기 위해 위 뒷다리를 곤란하여이를 확인합니다. 가벼운 부상에 대한 RIP에 의한 보호는 생후 6 개월까지 앉아있는 쥐에서 테스트되었습니다. </li><li> R에 대한 Anesthetised 준비IP <ol><li> 60 ㎎ / ㎏ 케타민 5 ㎎ / ㎏ 자일 라진의 복강 내 주사로 쥐를 주입한다. 다리 연장하고 다리의 하부에 피부를 집어 마취 깊이를 확인한다. 이 깊이 anesthetised 경우 동물은 더 반사가 없습니다. 마취 동안 각막 건조를 방지하기 위해 인공 눈물을 적용합니다. </li><li> 열 패드 또는 37.5 ° C의 일정 체온을 유지하기 위해 온수 배관을 순환하는 하나의 래트를 놓는다. 낮은 사지 &#39;발 패드면이 위를 향하도록하여 발생하기 쉬운 위치에 쥐를 놓습니다. 어느 쪽의 오른쪽 또는 왼쪽 사지 원격 허혈을 거칠 수있다. </li></ol></li><li> RIP 깨어 준비 참고 : 동물 실험 두 사람이 필요합니다 잠에서 깨어. 한 사람이 동물을 억제하고, 두 번째 사람은 수동 혈압계를 운영하고 있습니다. 실험자는 구속 핸들러에 부상의 위험을 증가함에 따라 절차를 수행 할 자신감이 있어야합니다. 원격 허혈을받은 쥐들은 T를 조절해야합니다O 설명서를 구속. 직관적 인 가이드 라인에 따라 수동 구속은 주에 걸쳐 5 분에서 최대 30 초에서 진행을해야합니다. 수동 구속에 순응하지 못하는 겁 많은 동물이 깨어 실험에서 제외되어야한다. 마지막으로, 수동 구속 정확하게 RIP 연구 결과를 해석하는 데 사용해야합니다 동물에게 스트레스 (잠재적으로 연구에 교란을 소개)와 가짜 코호트 (염증없이 커프의 배치)을 일으킬 가능성이있다. <ol><li> 15cm X 30-50cm의 조각으로 수건을 잘라 뒷다리의 상단에 머리를 커버, 쥐의 척추에 수직 짧은 가장자리를 놓습니다. </li><li> 쥐의 몸통 아래의 짧은 쪽을 단단히 감싸과 수건의 나머지 긴 가장자리 쥐를 포장하기 시작합니다. 앙와위에서 팔 아래 포장 동물을 고정합니다. 쥐가 왼쪽 팔에서 개최되는 경우, 수건에서 쥐의 오른쪽 다리를 무료로 제공됩니다. </li></ol></li></ol> 4. 응용 프로그램 OF 피부 온도 프로브 <ol><li> 허혈를 받아야하고, 발바닥의 피부 프로브를 배치하는 것입니다 쥐의 다리를 확장 할 수 있습니다. 온도 프로브와 피부 사이의 접촉을 극대화하기 위해 피부 프로브를 배치합니다. 단단히 발바닥에 프로브를 밀어 종이 테이프와 프로브를 부착합니다. </li><li> 온도 레코딩 소프트웨어에 온도를 추적하여 피부 프로브 위치를 확인하십시오. 피부 온도는 30-34 ° C의 사이이며 안정적으로 유지 있는지 확인하십시오. 1-2 분 동안 피부 온도를 추적. 온도가 불안정하거나 30 ° C 이하이면 피부 프로브를 조정한다. </li></ol> 5. 원격 허혈 <ol><li> 커프를 수축 및 공기압 밸브가 폐쇄되어 있는지. 다리를 확장하고 느슨하게 상단 뒷다리에 커프를 둘러싸. 위치에 느슨하게 커프를 유지하기 위해 다리와 낮은 숫자를 확장하는 집게 손가락과 엄지 손가락을 사용합니다. </li><li> 깨어 동물 incre 160 mmHg로, 그리고에 anesthetised 동물의 커프 압력을 올립니다180 mmHg로에 커프 압력 ASE. 주 : 래트 anesthetised 혈압 120-140 mmHg의 범위 때 의식 160 mmHg로 상승한다. 정확한 압력에 도달하면 타이머와 발 온도 녹음을 시작. 참고 : 발 온도가 일정한 압력의 5 분 후 2 ° C에 의해 드롭해야한다. </li><li> 허혈에 걸쳐 동물의 &quot;무릎&quot;위의 커프의 위치를​​ 유지합니다. 커프 압력은 몇 분 후 드롭을 시작합니다, 또는 쥐의 사지는 이동합니다. </li><li> 반복적으로 펌핑의 원하는 커프 압력 반복적 인 짧은 버스트를 유지하기 위해 짧은 버스트로 인플레이션 전구 펌프 </li><li> 원격 허혈 5 분 내지 15 일 동안 연속적으로 전달 될 수있다. 허혈 재관류 프로토콜은 중간에 5 분 재관류 5 분 허혈이 기간을 포함한다. </li><li> 공기압 밸브를 풀어 커프 압을 수축. 허혈 프로 걸쳐 온도 변화를 확인로토콜. 커프를 놓습니다. </li><li> 부상 실험을 계속합니다. 마취의 영향 하에서 동물을 열 패드 상에 배치 될 필요가있다. 외래까지 동물을 모니터링하기 위해 계속합니다. 동물 산책 할 때까지 하우징에 반환 할 수 없습니다. </li></ol> 6. 가벼운 부상 - 망막 변성 모델 <ol><li> 다크 동물 하룻밤 (12 ~ 15 시간)을 적용. 즉시 원격 허혈 조절 또는 가짜 원격 허혈 (동물의 구속) 음식과 물과 방풍 하우징 장소 동물을 다음과 같습니다. </li><li> 24 시간 동안 오전 9시에 방풍 하우징 위에있는 형광등 (1,000 LUX)에 전환합니다. 빛 노출 후 7 일 동안 순환 조명을 어둡게하는 동물을 반환합니다. </li></ol> 7. 후 원격 허혈 절차 <ol><li> 전위도 (ERG)와 비전의 평가 : 참고 : ERG 설정 및 플래시 프로토콜은 Brandli 스톤 (26)을 따랐다. <ol><li> 다크 하룻밤 동물을 적용 (12 ~ 15 시간). 아래의붉은 조명이 케타민과 자일 라진의 복강 내 주사 (60 ㎎ / ㎏, 5 ㎎ / ㎏, 각각)에 의해 동물을 마취 차단하여주십시오. 동형 (아트로핀 황산염 1.0 %), 각막 마취 (proxymetacaine 0.5 %). </li><li> 각막 수화를 적용 (카보 머 폴리머) 눈은 각막 즉시 삭제합니다. 각막 수화를 유지하기 위해 20 분 간격으로 눈 겔을 적용한다. </li><li> 안정적인 에르그 녹음을 돕기 위해 안구 주위에 느슨하게 묶여 스레드를 그립니다. 직장 프로브를 사용하여 온도를 모니터링 및 37-37.5 ℃에서 동물의 체온을 유지한다. </li><li> Ganzfeld 적분 구 내부의 머리를 놓습니다. 참고 : Ganzfeld가 눈에 LED가에서 균일 한 오순절 깜박을 제공하는 완전히 프로그램 빛 자극이다. </li><li> 가볍게 각막 감동 주문품 4mm 백금 양극과 입에 삽입 2mm 직경 AG / AgCl을 펠릿 전극을 사용하여 전위도를 기록한다. 스테인리스 바늘에 양전극을 참조엉덩이에 피하 삽입. </li><li> 2 kHz의 수집 속도 0.3-1,000 Hz에서 (-3 dB)의 대역 통과 설정으로 녹음 신호 (AD 악기). 안정적인 에르그 녹음 녹음을 시작하기 전에 대상에게 10 분 어두운 적응에 동물을 설립 한 후. </li><li> 앞서 Brandli 스톤 (26)에 의해 설명 된 플래시 프로토콜을 따르십시오. <ol><li> 플래시 지속 시간을 프로그램 (우리는 깜박 기간이 1 ~ 2 밀리 초를 사용), 그리고 -4.4 로그 스코틀랜드 cd.sm -2 2.0에 자사의 강도를 설정합니다. 망막 기능을 측정하기 위해 밝은 플래시 (2.0 로그 스코틀랜드의 cd.sm -2, 1 MS)를 사용합니다. 본 연구에서는 제어, 빛 부상 RIP 빛 부상 사이의 비교입니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 8. TUNEL 분석 <ol><li> 페노바르비탈 과다 복용 (100 ㎎ / ㎏)의 복강 내 주사하여 동물을 안락사. 명백히하다 눈을 4 % 파라 포름 알데히드에 고정한다. </li><li> cyroprotecting 전에 PBS에 눈을 씻으십시오눈 하룻밤 자당 30 %에서 (W / V). 10월 화합물의 눈을 포함하고 저온 ​​유지 장치를 사용하여 20 μm의 시상 부분으로 잘라. </li><li> Maslim 등의 프로토콜 다음 DAPI 염색과 망막 섹션에 TUNEL 분석을 수행합니다. (27) </li><li> 망막의 TUNEL 카운트에 대한 형광 현미경을 사용합니다. TUNEL 세포는 외부 핵 층 (ONL)에서 기록되었다; 감광체 핵을 포함하는 망막의 최 외층. 본 연구에서는 TUNEL 수는 각 치료 그룹 (5) 눈으로, 각각의 눈에 대한 중으로 하였다. </li><li> 비교 통계 그룹에 일원 분산 분석을 사용하여 제어, 가벼운 부상, 가벼운 부상 + RIP 쥐의 의미합니다. </li></ol>

The author has nothing to disclose.

설치류 뒷다리 허혈 성공적 수동 혈압계로 유도하고 망막 광 수용체에 신경 전달 커프 하였다. 가벼운 부상 9,28에서 광 수용체의 허혈성 조절에 의한 보호와 일치 발견. 기본적으로 원격 허혈 조직에 대한 간단한 산소 부족이 발생합니다. 따라서, 원격 허혈 양상은 허혈성 조절 또는 대안이라고 허혈 내성, 저산소 전처리, 어느 정도, 무산소 운동에 많은 유사점이있다...

대부분의 생존, 아마도 모든 대사 스트레스에 직면 조직 치사 허혈 1,2- 주기로 사전 조절함으로써 개선 될 수있다. 실용적인 측면에서 허혈 (IP)은 조직의 경험 등 후속 허혈성 모욕으로 더 심한 스트레스, 전 치사 허혈 조직의 노출이다. 동물 모델에서 IP는 뇌, 망막, 심장과 폐 3-6에 눈에 띄는 보호 기능을 제공합니다. 대응하여, 뇌졸중 환자에서 관찰은 이전 일과성 허혈 발작과 임상 결과 더 -7,8- 사이의 링크를 보였다. IP는 또한 비 허혈성 손상 (9)에서 망막 광 수용체를 보호합니다. 다양한 조직 및 부상의 IP의 효과는 모든 조직에 존재하는 세포 생존의 타고난 메커니즘을 활성화하는 것을 의미한다. 심근 허혈은 상향 조절을 통해 보호 효과가 제안되었다아데노신의 방출을 통해 또는 미토콘드리아 ATP 10,11 칼륨 채널의 개구를 통해 다수의 대사 경로를 조절하는 것으로 알려져 저산소증 유도 성 인자 (HIF)의. 아데노신 릴리스와 ATP의 칼륨 채널은 현재까지 허혈성 조절의 신경 메커니즘에 대한 연구가 안티 흥분 독성 (excitotoxicity), 항 세포 사멸 및 항 염증 경로 (12, 13)에 대한 수정에 초점을 맞추고있다, 뇌허혈에 연루되어 있지만. 전반적으로, 신경 세포를 보호하는 허혈성 컨디셔닝 분자 프로세스 이해가 제한된다. 원격 허혈 양상 시도는 덜 중요한 조직에 허혈을 생성하여 먼 매우 중요한 장기 (심장, 뇌, 폐)를 상태로. 뒷다리를 사용하여 원격 허혈 (RIP)은 뇌졸중 14-17의 설치류 모델에서 신경 것으로 입증되었다. 우리에 의해 기술 된 방법은 간단하고 신뢰할 수있는 비 침습적 PROT를 제공RIP를 유도 ocol. RIP 프로토콜의 대부분은 상부 뒷다리에 위치한 대퇴 동맥을 용이하게 식별 및 수술 클램핑 지혈대 애플리케이션에 액세스 할 수있는 것으로 추정하기 때문에, 뒷다리를 포함한다. 뇌 및 피부 보호의 연구 침습 사지 허혈 연구에서 허혈 사타구니 인대에서 대퇴 동맥을 분리하고 대퇴 동맥 2,15,18 클램핑에 의해 유도된다. 사지 중있는 절삭이나 대퇴 동맥 클램핑으로 인한 허혈은 펄스의 감소, 감소 산소화 및 피부 온도의 저하를 포함 사지에서의 변화에​​ 의해 확인되었다. 원격 허혈은 레이저 도플러 또는 도플러 초음파 17-19을 사용하여 펄스의 손실에 의해 확인 될 수있다. 피부 온도는 관계 20,21 비선형이지만 도플러 대안으로 사용될 수있다. 정확한 온도 기록은 실험실과 캔의 흔한쉽게 원격 허혈성 연구에 혼입 될 수있다. 수술을 클램핑하는 대퇴 대안 지혈대를 사용하여 허혈의 유도이다. 지혈대 응용 프로그램은 선박 클램핑 달성에 필적 허혈을 생산; Kutchner 등. 비 침습적 지혈대에 클램핑 침습 대퇴 동맥을 비교하고 두 방법 피변 허혈 (18)의 성형 모델 사지 혈류 감소 피부 손상을 중지하였습니다. 다리 또는 팔 하나를있는 절삭 및 수축기 혈압 위의 커프 압력을 제기하는 돼지와 인간 17,19,22 허혈성 손상에 대한 보호 것으로 밝혀졌다. 다른 지혈대는 허혈성 혈압 커프 또는 탄성 밴드 17,22,23의 사용을 포함 원격 유도에 접근한다. 그러나, 허혈을 유도하는 탄성 밴드를 사용하는 방법은 안전하지 않은, 압력의 비 조절 양에 잠재적으로 상승시켜주는500 mmHg의 이상 압력 상승과 사지는 인간 (24)에 기록된다. 또한, 탄성 밴드를 사용하지 허혈은 에반스 블루 염료, 근섬유 투과성 (25)의 생체 마커에 의해 평가로, 밴드 (23)의 제거 다음 쥐의 근육 손상으로 이어집니다. 대조적으로, 지혈대에 제어 압력의 전달은 혈압계 17,19,22,26 접속 혈압계를 사용하여 달성 될 수있다. 본 연구에서는, 감광체 변성 광 손상 모델은 원격 허혈의 신경 보호 효능을 입증하기 위해 사용되었다. 원격 허혈 가벼운 부상 직전 유도, 망막 기능 검사에 의해 확인으로 후속 광 수용체의 변성을 방지했다. 첨부 된 동영상은 비 침습 원격 허혈의 적용을 설명한다.

<table><tbody><tr><td>Gold series DuraShock hand aneroid sphygmomanometer</td><td>Welch Allyn</td><td>DS56</td><td>Manual Sphygmomanometer</td></tr><tr><td>Neonate [size 2] 1 tube, 10 pack</td><td>Welch Allyn</td><td>5082-102-1</td><td>Limb blood pressure cuff</td></tr><tr><td>Luer lock adaptor</td><td>Welch Allyn</td><td>5082-178</td><td>Adaptor for neonatal cuff</td></tr><tr><td>Thermistor pod</td><td>AD Instruments</td><td>ML 309</td><td>skin tempertature unit</td></tr><tr><td>Skin temperture probe</td><td>AD Instruments</td><td>MLT 422/A</td><td></td></tr><tr><td>Powerlab, 4 channel acquistion hardware</td><td>AD Instruments</td><td>PL 35044</td><td></td></tr><tr><td>Homeothermic blanket system with flexible probe</td><td>Harvard Appartus</td><td>507222F</td><td></td></tr><tr><td>Towel</td><td></td><td></td><td>optional: awake remote ischemia</td></tr><tr><td>Isoflo - 100% Isoflurane (250 ml)</td><td>Abbot Animal Health</td><td>05260-05</td><td>optional: inhaltion anaesthetic remote ischemia</td></tr><tr><td>Ketamil - ketamine 100 mg/ml (50 ml)</td><td>Troy Laboratories Pty Ltd</td><td></td><td>optional: injectable anaesthetic remote ischemia</td></tr><tr><td>Xylium - Xylazine 100 mg/ml (50 ml)</td><td>Troy Laboratories Pty Ltd</td><td></td><td>optional: injectable anaesthetic remote ischemia</td></tr></tbody></table>

remote limb ischemic preconditioning:  a neuroprotective technique in rodents

치사 허혈는 영향을받는 조직의 내생 적 메커니즘의 상향 조절을 통해 이후, 더 심한 허혈에 대한 조직을 보호합니다. 치사 허혈은 원격 조직에서 보호 메커니즘을 상향 조절하는 것으로 나타났다. 포유 동물의 뒷다리에 허혈 (5 ~ 10 분)의 짧은 기간은 뇌, 폐, 심장, 망막의 자기 보호 반응을 유도한다. 효과는 원격 허혈 (RIP)로 알려져있다. 이는 생명 유지 기관을 보호 유망한 치료 방법이며, 심장 및 뇌 손상에 대한 임상 실험하에 이미. 쥐의 특히 뒷다리 - - 허혈이 책은 사지를 만드는 제어, 최소 침습적 방법을 보여줍니다. 인간 신생아에서 사용하기 위해 개발 혈압계는 혈압 설명서에 접속 뒷다리의 상부 주위에 160 mmHg의 압력을 적용하기 위해 사용된다. 피부 온도를 검출하기위한 프로브는 ischemi을 확인하는 데 사용되는레그 동맥 압력 유도 폐색에 의한 피부 온도의 저하와 커프스의 방출을 따르는 온도 상승을 기록하여. RIP의이 방법은 밝은 빛에 의한 손상과 변성에 대한 쥐의 망막에 대한 보호를 제공한다.

160 mmHg의 위까지 상승 혈압 커프는도 1b에 명확히 본 뒷다리 혈액의 흐름을 정지. 조직의 산소의 부족은 허혈 재관류 프로토콜 (도 2)에 대한 동물의 발 온도를 감소시키는 결과. 발 온도 (33 ° C)는 커프 (32 ° C) 수축 할 때 상승 커프 압력 상승 (31 ℃)시 코어 온도보다 낮은 안정적으로 감소했다. 단일 1,000 룩스 빛 부상은 또는 원격 허혈없이 흰둥이 쥐를 제기 어두워 전달했?...

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Remote Limb Ischemic Preconditioning:  A Neuroprotective Technique in Rodents

원격 허혈 (RIP)의 손상 스트레스에 대한 조절 조직의 방법이다. 우리는 5-10 분간 혈압계 커프를 팽창하여, 뒷다리에서 원격 허혈 방법을 확립했다. RIP의 신경 보호 기능은 설치류에서 망막 변성의 모델에서 입증되고있다.

원격 사지 허혈 양상 : 설치류에 신경 기술

Sublethal ischemia protects tissues against subsequent, more severe ischemia through the upregulation of endogenous mechanisms in the affected tissue. ...

remote-limb-ischemic-preconditioning-neuroprotective-technique

Research

JoVE Journal

Medicine

11.0K 조회수.  University of Sydney.  원격 허혈 (RIP)의 손상 스트레스에 대한 조절 조직의 방법이다. 우리는 5-10 분간 혈압계 커프를 팽창하여, 뒷다리에서 원격 허혈 방법을 확립했다. RIP의 신경 보호 기능은 설치류에서 망막 변성의 모델에서 입증되고있다. 

비디오: Remote Limb Ischemic Preconditioning:  A Neuroprotective Technique in Rodents

Strategies for Study of Neuroprotection from Cold-preconditioning

Neurological injury is a frequent cause of morbidity and mortality from general anesthesia and related surgical procedures that could be alleviated by development of effective, easy to administer and safe preconditioning treatments. We seek to define the neural immune signaling responsible for cold-preconditioning as means to identify novel targets for therapeutics development to protect brain before injury onset. Low-level pro-inflammatory mediator signaling changes over time are essential for cold-preconditioning neuroprotection. This signaling is consistent with the basic tenets of physiological conditioning hormesis, which require that irritative stimuli reach a threshold magnitude with sufficient time for adaptation to the stimuli for protection to become evident.
Accordingly, delineation of the immune signaling involved in cold-preconditioning neuroprotection requires that biological systems and experimental manipulations plus technical capacities are highly reproducible and sensitive. Our approach is to use hippocampal slice cultures as an in vitro model that closely reflects their in vivo counterparts with multi-synaptic neural networks influenced by mature and quiescent macroglia / microglia. This glial state is particularly important for microglia since they are the principal source of cytokines, which are operative in the femtomolar range. Also, slice cultures can be maintained in vitro for several weeks, which is sufficient time to evoke activating stimuli and assess adaptive responses. Finally, environmental conditions can be accurately controlled using slice cultures so that cytokine signaling of cold-preconditioning can be measured, mimicked, and modulated to dissect the critical node aspects. Cytokine signaling system analyses require the use of sensitive and reproducible multiplexed techniques. We use quantitative PCR for TNF-&alpha; to screen for microglial activation followed by quantitative real-time qPCR array screening to assess tissue-wide cytokine changes. The latter is a most sensitive and reproducible means to measure multiple cytokine system signaling changes simultaneously. Significant changes are confirmed with targeted qPCR and then protein detection. We probe for tissue-based cytokine protein changes using multiplexed microsphere flow cytometric assays using Luminex technology. Cell-specific cytokine production is determined with double-label immunohistochemistry. Taken together, this brain tissue preparation and style of use, coupled to the suggested investigative strategies, may be an optimal approach for identifying potential targets for the development of novel therapeutics that could mimic the advantages of cold-preconditioning.

We seek to define the neural immune signaling responsible for cold-preconditioning as means to identify novel targets for therapeutics development to protect brain before injury onset. We present strategies for such work that require biological systems, experimental manipulations plus technical capacities that are highly reproducible and sensitive.

콜드 preconditioning에서 Neuroprotection 연구를위한 전략

Neurological injury is a frequent cause of morbidity and mortality from general anesthesia and related surgical procedures that could be alleviated by ...

연구

신경과학

Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We have established bilateral common carotid artery occlusion as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to transient focal cerebral ischemia in C57Bl6/J mice. In this video, we will demonstrate the methodology used for this study.

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning (PC) &#x2013; a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We established bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO) as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance (IT) to transient focal cerebral ischemia (induced by middle cerebral artery occlusion, MCAO) in C57Bl6/J mice.

초점 대뇌 국소 빈혈에 조기 허혈성 공차를 유도하기 위해 적절한 전처리 자극으로 양측 경동맥 동맥 폐색

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a ...

의학

Murine Model of Hindlimb Ischemia 

In the United States, peripheral arterial disease (PAD) affects about 10 million individuals, and is also prevalent worldwide. Medical therapies for symptomatic relief are limited. Surgical or endovascular interventions are useful for some individuals, but long-term results are often disappointing. As a result, there is a need for developing new therapies to treat PAD. The murine hindlimb ischemia preparation is a model of PAD, and is useful for testing new therapies. When compared to other models of tissue ischemia such as coronary or cerebral artery ligation, femoral artery ligation provides for a simpler model of ischemic tissue. Other advantages of this model are the ease of access to the femoral artery and low mortality rate. 
In this video, we demonstrate the methodology for the murine model of unilateral hindimb ischemia. The specific materials and procedures for creating and evaluating the model will be described, including the assessment of limb perfusion by laser Doppler imaging. This protocol can also be utilized for the transplantation and non-invasive tracking of cells, which is demonstrated by Huang et al.1.

Murine Model of Hindlimb Ischemia

The surgical procedure for induction of unilateral hindlimb ischemia is demonstrated, with confirmation of ischemia by laser Doppler perfusion imaging.

Hindlimb 국소 빈혈의 Murine 모델

In the United States, peripheral arterial disease (PAD) affects about 10 million individuals, and is also prevalent worldwide.  Medical therapies for ...

생물학

Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion

Background 
Lower extremity paralysis continues to complicate aortic interventions. The lack of understanding of the underlying pathology has hindered advancements to decrease the occurrence this injury.&#160;The current model demonstrates reproducible lower&#160;extremity paralysis following thoracic aortic occlusion.
Methods 
Adult male C57BL6 mice were anesthetized with isoflurane. Through a cervicosternal incision the aorta was exposed. The descending thoracic aorta and left subclavian arteries were identified without entrance into pleural space. Skeletonization of these arteries was followed by immediate closure (Sham) or occlusion for 4 min (moderate ischemia) or 8 min (prolonged ischemia). The sternotomy and skin were closed and the mouse was transferred to warming bed for recovery.&#160; Following recovery, functional analysis was obtained at 12 hr intervals until 48 hr.
Results 
Mice that underwent sham surgery showed no observable hind&#160;limb deficit. Mice subjected to moderate ischemia for 4 min had minimal functional deficit at 12 hr followed by progression to complete paralysis at 48 hr. Mice subjected to prolonged ischemia had an immediate paralysis with no observable hind-limb movement at any point in the postoperative period. There was no observed intraoperative or post&#160;operative mortality.
Conclusion 
Reproducible lower extremity paralysis whether immediate or delayed can be achieved in a murine model. Additionally, by using a median sternotomy and careful dissection, high survival rates, and reproducibility can be achieved.

The lack of mechanistic understanding of spinal cord ischemia-reperfusion injury has hindered further adjuncts to prevent paraplegia following high risk aortic operations. Thus, the development of animal models is imperative. This manuscript demonstrates reproducible lower extremity paralysis following thoracic aortic occlusion in a murine model.

척수 허혈 - 재관류의 생쥐 모델에서 흉부 대동맥 폐색에 의해 재생산 할 하반신 마비

Background
Lower extremity paralysis continues to complicate aortic interventions. The lack of understanding of the underlying pathology has hindered ...

Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the retina. The ERG is a sensitive measure of changes in retinal function that are pan-retinal, but is less effective for detecting damage confined to a small area of retina. In the present work we describe how to record the &#8216;flash&#8217; ERG, which is the potential generated when the retina is exposed to a brief light flash. We describe methods of anaesthesia, mydriasis and corneal management during recording; how to keep the retina dark adapted; electrode materials and placement; the range and calibration of stimulus energy; recording parameters and the extraction of data. We also describe a method of inducing ischemia in one limb, and how to use the ERG to assess the effects of this remote-from-the-retina ischemia on retinal function after light damage. A two-flash protocol is described which allows isolation of the cone-driven component of the dark-adapted ERG, and thereby the separation of the rod and cone components. Because it can be recorded with techniques that are minimally invasive, the ERG has been widely used in studies of the physiology, pharmacology and toxicology of the retina. We describe one example of this usefulness, in which the ERG is used to assess the function of the light-damaged retina, with and without a neuroprotective intervention; preconditioning by remote ischemia.

The electroretinogram (ERG) is an electrical potential generated by the retina in response to light. This paper describes how to use the ERG to assess retinal function, in dark-adapted rats, and how it can be can be used to assess a neuroprotective intervention, in the present case remote ischemic preconditioning.

쥐 망막 및 원격 사지 허혈 양상의 보호 효과에 기능을 평가하기 위해 전위도를 사용하여

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the ...

Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week protocol for repetitive hypoxic preconditioning (RHP) induces long-term protection against central nervous system (CNS) injury in a mouse model of focal ischemic stroke. RHP consists of 9 stochastic exposures to hypoxia that vary in both duration (2 or 4 hr) and intensity (8% and 11% O2). RHP reduces infarct volumes, blood-brain barrier (BBB) disruption, and the post-stroke inflammatory response for weeks following the last exposure to hypoxia, suggesting a long-term induction of an endogenous CNS-protective phenotype. The methodology for the dual quantification of infarct volume and BBB disruption is effective in assessing neurovascular protection in mice with RHP or other putative neuroprotectants. Adult male Swiss Webster mice were preconditioned by RHP or duration-equivalent exposures to 21% O2 (i.e. room air). A 60 min transient middle cerebral artery occlusion (tMCAo) was induced 2 weeks following the last hypoxic exposure. Both the occlusion and reperfusion were confirmed by transcranial laser Doppler flowmetry. Twenty-two hr after reperfusion, Evans Blue (EB) was intravenously administered through a tail vein injection. 2 hr later, animals were sacrificed by isoflurane overdose and brain sections were stained with 2,3,5- triphenyltetrazolium chloride (TTC). Infarcts volumes were then quantified. Next, EB was extracted from the tissue over 48 hr to determine BBB disruption after tMCAo. In summary, RHP is a simple protocol that can be replicated, with minimal cost, to induce long-term endogenous neurovascular protection from stroke injury in mice, with the translational potential for other CNS-based and systemic pro-inflammatory disease states.

This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.

마우스의 반복 저산소 전처리 및 과도 중간 대뇌 동맥 폐쇄 후 신경 혈관 보호의 정량화

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.

The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

랑겐 돌프 - 관류 쥐 마음에 유도 및 허혈 - 재관류 손상의 평가

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia

Peripheral artery disease (PAD) is a leading cause of cardiovascular morbidity and mortality in developed countries, and animal models that reliably reproduce the human disease are necessary to develop new therapies for this disease. The mouse hindlimb ischemia model has been widely used for this purpose, but the standard practice of inducing acute limb ischemia by ligation of the femoral artery can result in substantial tissue necrosis, compromising investigators&#39; ability to study the vascular and skeletal muscle tissue responses to ischemia. An alternative approach to femoral artery ligation is the induction of gradual femoral artery occlusion through the use of ameroid constrictors. When placed around the femoral artery in the same or different locations as the sites of femoral artery ligation, these devices occlude the artery over 1 - 3 days, resulting in more gradual, subacute ischemia. This results in less substantial skeletal muscle tissue necrosis, which may more closely mimic the responses seen in human PAD. Because genetic background influences outcomes in both the acute and subacute ischemia models, consideration of the mouse strain being studied is important in choosing the best model. This paper describes the proper procedure and anatomical placement of ligatures or ameroid constrictors on the mouse femoral artery to induce subacute or acute hindlimb ischemia in the mouse.

Surgical induction of hindlimb ischemia in the mouse is useful to examine angiogenesis, however this is compromised in certain inbred mouse strains that display marked ischemia-induced tissue necrosis. Methods are described to induce subacute limb ischemia using ameroid constrictors to circumvent this problem through the induction of gradual arterial occlusion.

급성 및 아 급성 쥐 뒷다리 국소 빈혈하는 방법

Peripheral artery disease (PAD) is a leading cause of cardiovascular morbidity and mortality in developed countries, and animal models that reliably ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

신생아 생쥐의 척수 신경 세포 분리 및 배양

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for neuroprotection, postconditioning treatments have proven to be promising therapies against cerebral ischemia. However, complicated procedures and potential safety issues limit their clinical application. To overcome these disadvantages, we have developed acidic postconditioning (APC) as a therapy for experimental focal cerebral ischemia. APC refers to the mild acidosis treatment by inhaling CO2 during reperfusion following ischemia. Here we present two models to execute APC in vitro and in vivo, respectively. The oxygen-glucose deprivation (OGD) treatment of mice and the corticostriatal occlusion and middle cerebral artery occlusion (MCAO) of mice were employed to mimic cerebral ischemia. APC can be simply achieved by transferring brain slices to acidic buffer bubbled with 20% CO2, or by mice inhaling 20% CO2. APC showed significant protective effects against cerebral ischemia, as reflected by tissue viability and brain infarct volume.

Acidic postconditioning protects against cerebral ischemia. Here we present two models to execute APC. They are achieved respectively by transferring corticostriatal slices to acidic buffer after oxygen-glucose deprivation in vitro and by inhaling 20% CO2 after middle cerebral artery occlusion in vivo.