The following agencies provided critical funding support for this study: MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), Dana Foundation (A.Y.H.), St. Baldrick&#8217;s Foundation (A.Y.H.), Alex&#8217;s Lemonade Stand Foundation (A.Y.H.), Gabrielle&#8217;s Angel Foundation (A.Y.H.) and Hyundai Hope-on-Wheels Program (A.Y.H.). The authors are thankful for the indispensable help of Jerry Silver and Sarah Busch in learning the Dorsal Column Crush (DCC) injury. The authors are also grateful to Jingquang You, Elisabeth Hare and Hongmei Hu for technical help with genotyping and Ross Anderson for mounting the spinal stabilizing unit.

The authors have nothing to disclose.

אינטראקציות הדמיה סוגי תאים שונים בתאי רקמת מולדתם של שבהתפתח פתולוגיה בזמן אמת יצרו עניין רב. בתוך הרשת הצפופה של מערכת העצבים המרכזית, קשר תאי תאים ואיתות עם תאים סמוכים חיונית לתפקוד תקין ולהבנת הפתולוגיה של מערכת העצבים המרכזית. כאן, אנו תיארנו את השימוש במיקרוסקופ סריקת לייזר 2-פוטון לתצפית של תנועה הסלולר בתוך נגע מכאני בחוט השדרה. בנוסף לאיכות של הכנת הניתוח ורקמה, יציבות מכאנית של הרקמה היא בעל חשיבות עליונה למיקרוסקופיה זמן לשגות מוצלחת, במיוחד הבידוד של חוט השדרה מנשימת חפץ בתנועה. יציבות ניתן להעריך על ידי מחפש תנועה של חוט השדרה תחת מיקרוסקופ לנתח שמתאים לקצב הלב או הנשימה של בעלי החיים. יציבות יש לבחון גם בעת ביצוע הניתוח וגם מייד לפני תחילת הדמיה. אם האנימהl הוא לא יציב, התאמות צריכות להיעשות כדי ההשמה והאטימות של מלחציים חוט השדרה. מודלים של עכברי כתב ניאון ספציפי תא מסוג בשילוב עם גישות הכימרה מח העצם אפשרו זיהוי של תאי monocytic לעומת מיקרוגליה ואקסונים. מחקרים קודמים גילו כי מיקרוגליה מונוציטים בדם נגזר ולא אחראים לנזק axonal המשני לאחר טראומה באמצעות המתודולוגיה שתוארה כאן 43. צבע כלי מצומדות dextran מאפשר זיהוי כלי שני לספק ציוני דרך ולזהות פרצות בשלמות כלי דם. הבחירה של מודל עכבר כתב הניאון המתאים היא קריטית כדי לאפשר זיהוי הנכון של סוגי התאים הרצויים להיות צילם. פיתוח דגמי עכבר ניאון המתאימים למחקרים המתבצע גם קריטי להצלחה של ניסויים. הבחנה בין שתי אוכלוסיות phagocytic של CX3CR1 + / GFP </sup&gt; תאים במערכת העצבים המרכזית היו קשים באופן מסורתי. כפי שניתן לראות כאן, טכניקה נפוצה חיסונית, מפלצות קרינה, יכולה להיות מנוצלת כדי להבחין, מיקרוגליה CNS-תושב רדיו עמיד ממקרופאגים נגזרות מח העצם. יש הליך הקרנת הפוטנציאל לפגוע במחסום דם המוח ולשנות פנוטיפים תאים, ולכן שימוש במודל זה יש לשקול בזהירות. שינויים אלה במידה שונה עם מינון קרינה, כמו גם משך תקופת החלמה, וההשפעה שלהם על דגמים דלקתיים שונים לא נחקרה באופן מלא. ההשפעות של קרינה על מחסום דם מוח CNS ניתן למזער על ידי מגן הראש במהלך הקרנה, וזה הוכח להפחית חדירת תא אל חוט השדרה לאחר הקרנה, גם אם חוט השדרה הוא לא ישירות מוגן 52. כאן יש לנו ציינו כי מספר התאים שחדרו למערכת העצבים המרכזית במצב יציב כתוצאה מדור הכימרה הוא חסר משמעות בניגוד לתחושהאה של תאי הזנת הנגע. מודלים חלופיים אחרים לשקול לכלול מפלצות בהשפעת סמים או 52 מודלים של עכברי parabiotic 53. הנה, יש לנו הצגנו מודל פציעה קטן ספציפי, פשוט ושחזור כי תוצאות בנגע לחומר לבן גב של חוט השדרה שהוא קל לתמונה באמצעות מיקרוסקופיה 2-הפוטון. שיטה זו מספקת גם נגע לכימות לassay מידת dieback axonal בעמודות הגבי שבספרות כבר בשילוב עם 16,18,43,48,54 ניתוח רקמות קבועות משלימים. במודל זה, בעלי חיים להציג רק גירעונות מינימאליים ואין צורך בטיפול מיוחד לאחר פציעה. מחקרים עתידיים ניצול טכניקות פציעה למחוץ טור והדמיה הגב המתואר כאן עשויים להיות כלי מיון רבי עוצמה כדי להעריך את היעילות של טיפול בפגיעה בחוט השדרה. טיפולים אלה עשויים לכלול מעכבים קטנים מולקולה, תרופות, מוצרים סלולריים, שתלי רקמה וטיפול קומבינטוריתs. יחסי הגומלין בין מקרופאגים, מיקרוגליה ונוירונים הם גם צפוי לשחק תפקיד בדגמים אחרים מחלה בחוט השדרה, כוללים טרשת נפוצה, גידולים, דלקת קרום מוח וטרשת לרוחב amyotrophic, וטכניקה זו עשויה להיות שימושית במחקר של מחלות אלו, כמו גם .

התגובה הדלקתית למחלה או פציעה במערכת העצבים המרכזית (CNS) הוא הבין היטב, במיוחד בכל הקשור ליחסי הגומלין בין תאי מערכת חיסון ותושב בתוך הרקמה. חקירות של אינטראקציות הסלולר אלה בחוט השדרה הן בעלי עניין מיוחד בחי. בדרכי העניין רק נגישות בקלות במערכת העצבים המרכזית הלבנות היא בעמודות הגבי של חוט השדרה, מה שהופך את זה תחום חשוב שבו יש למקד את המאמצים בשיפור גישה ניסויית אפשרית. חקירות אלה היו מוגבלות בשל הקושי הטכני בגישה ולייצוב מערכת העצבים המרכזית להדמיה. הדמיה לחיות בחוט השדרה שתוארה תנועה סלולרית בעבר 1-13, עם זאת, מספר המחקרים התייחסו בפגיעה בחוט השדרה מעבר לכמה שעות אחרי העלבון הראשוני. נגע חוט השדרה הטראומתי הוא סביבה מורכבת, עם תאי עצב, האסטרוציטים, fibroblasts, ותאי NG2, ותאי חיסון including מיקרוגליה, נויטרופילים, מקרופאגים, תאי T, תאי B ותאים דנדריטיים 14,15. המקרופאגים הם תת-הקבוצה של תאי מערכת חיסון אחראים לphagocytosis בנגע, שחדרו מהמחזור. תפקידם של תאי phagocytic אלה כבר התווכח, עם דיווחים מצביעים על כך שתאים אלה יכולים לקחת על שני תפקידים מזיקים ומגן ברקמה הפגועה. תפקידים אלה נעים בין הגדלת dieback axonal המשני לאחר פציעה ופועל באופן phagocytic 16-22, לוקח על ריפוי פצע פנוטיפ, ולהקטין את גירעונות תפקודיים בבעלי החיים הפצועים 21,23,24. בעבר, מנסה להבחין מקרופאגים ממיקרוגליה הסתמכו בעיקר על מורפולוגיה ברקמה בריאה. עם זאת, מיקרוגליה ומקרופאגים מופעלים להביע רבים מאותו הסמנים ולהציג מורפולוגיה נבדלה לאחר פציעת 25-29, מה שהופכים את ההפרדה של פעילויות שונות של תאים אלה קשים ללמוד based בגורמים אלה לבד 30. ניתן להפריד תאים אלה על ידי ביטוי ההפרש של CD45 באמצעות זרימת cytometry 33,34, למרות שגישה זו היא פחות שימושית באפליה מסוג התא בגוף חי. ביטוי ההפרש ניצול של CCR2 וCX3CR1 במיקרוגליה ומקרופאגים גם נחקר, למרות שהשינויים הדינמיים בביטוי של סמנים אלה כמונוציטים להתמיין מקרופאגים יכולים לסבך ניתוח מדויק 35,36. Microglia הם התאים חיסוניים התושב במערכת העצבים המרכזית ונובע מאבות שק החלמון במהלך התפתחות עוברית, בעוד מקרופאגים נגזרים מאבות מח עצם ולהיכנס למערכת העצבים המרכזית הפצועה לאחר עלבון 31,32. גישה חלופית לשימוש במורפולוגיה להבחין בין שני סוגים אלה התא היא להחליף את מוח העצם עם אבות מבעלי חי תורם להביע סמן למעקב במקרופאגים נגזרו מאבות התורם, תוך שמירה על תושב CNS, recipהנגזר ient מיקרוגליה. המודלים chimeric מח עצם אלה נמצאים בשימוש נרחב ביישומים רבים אחרים 37-40. לשיטה זו אזהרות ייחודיות הקשורים לפגיעה בשלמות מחסום דם-המוח הנגרם על ידי תרופות קרינה או רעילות לתאים המשמשות למיגור אבות מח במארח, ובכך להגביל את השימוש שלה ביישומים מסוימים. לאחרונה, הבחנות פונקציונליות בין microglia ומקרופגים במערכת העצבים המרכזית מתחילות להבחין באמצעות cytometry זרימה, ניתוח מערך שבבי גן ושיטות chimerism 24,26,41-44, אשר תוכיח מאוד שימושי בעתיד. למרות מפריד בין שני סוגי התאים עדיין קשה, הבנת הפונקציות הייחודיות שלהם היא חשובה שבהוביל לטיפולים ממוקדים יותר של הפרעות שכוללות שני מיקרוגליה ומקרופאגים בתוך מערכת העצבים המרכזית. תיאור של אינטראקציות הסלולר בתוך נגע חוט השדרה הגיע בעיקר ממחקרים שכלל דגמי תרבית תאים. זה דue לאתגרים כרוכים בהדמיה הן נגע חוט השדרה ותאי חיסון יחד בחי. מודלים של מכרסמים הנוכחיים של פגיעה בחוט השדרה של סוג וחומרה שונים כוללים דגמי חבלה 45,46, פציעות דקירת סיכה 2, חתך 47, ולפציעתם למעוך עמודה הגבית שתוארה כאן 16,18,48. דלקת בקרומי המוח עולה עם חומרת פציעה ומציבה אתגרים ייחודיים להשתלה של חלונות או ניתוחים להדמיה סידורי. חלק מאתגרים אלה כוללים חדירה של תאי phagocytic, כמו גם את הדור של רקמה סיבית על האתר כירורגית. חלק מנושאים אלה ניתן להתגבר על ידי יצירת נגעים קטנים ומכסה את חוט השדרה החשוף ברוטב כירורגית שאינו חיסוני בין הדורה ושרירי paraspinous כדי לאפשר לניתוח פתיחה מחדש לאחר מכן, כפי שנעשה כאן כדי ללמוד את הפציעה למחוץ עמודה הגבי . יכולת תמונת החלק הגבי בלבד של הספיןכבל אל גם מגביל את הבחירה של פגיעה, שכן דגמי חבלה בעיקר לגרום לניזק לחוט המרכזי, לעתים קרובות חוסך חלק הגבי רוב עמודות הגב, במיוחד בנקודות זמן מוקדמות לאחר פציעת 45,49. לכן, אנו מתארים מודל פציעה פשוט שמניב נגע נקי, הדיר, מלבני בצורה שהוא שימושי עבור שתי התצפית של תנועת תאים בתוך הנגע ולכימות קל של axonal עמדה ביחס לנגע.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="594">
	<tbody>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:125px;">Name</td>
			<td style="width:165px;">Company</td>
			<td style="width:64px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:240px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:125px;">CX3CR1 GFP mice</td>
			<td style="width:165px;">Jackson laboratories</td>
			<td style="width:64px;">5582</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:125px;">Thy-1 YFP H mice</td>
			<td style="width:165px;">Jackson laboratories</td>
			<td style="width:64px;">3782</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:125px;">Mouse pie cage</td>
			<td style="width:165px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:64px;">MPC 2 set</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:125px;">60mm2 petri dish</td>
			<td style="width:165px;">Corning</td>
			<td style="width:64px;">430166</td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:125px;">Falcon 40 um cell filter</td>
			<td style="width:165px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:64px;">08-771-1</td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:125px;">1x15mL and 1x50mL conical tube</td>
			<td style="width:165px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">16 gauge needle</td>
			<td style="width:165px;">BD</td>
			<td style="width:64px;">305177</td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">1ml syringe</td>
			<td style="width:165px;">BD</td>
			<td style="width:64px;">309628</td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">ACK lysis buffer</td>
			<td style="width:165px;">Gibco</td>
			<td style="width:64px;">A10492-01</td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">HBSS</td>
			<td style="width:165px;">Gibco</td>
			<td style="width:64px;">1E+07</td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="79">
			<td height="100" rowspan="2" style="height:100px;width:125px;">RPMI media</td>
			<td rowspan="2" style="width:165px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">R8758</td>
			<td rowspan="2" style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:125px;">F4/80 antibody</td>
			<td style="width:165px;">Ebioscience</td>
			<td style="width:64px;">12-4801 PE</td>
			<td style="width:240px;">For FACS verification of chimeras</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">30-gauge insulin syringe&#160;</td>
			<td style="width:165px;">BD</td>
			<td style="width:64px;">328280</td>
			<td style="width:240px;">For tail vein injection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Spinal Cord Clamps</td>
			<td style="width:165px;">Narshinge</td>
			<td style="width:64px;">STS-A</td>
			<td style="width:240px;">For imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Ortho-Jet Dental Acrylic powder&#160;</td>
			<td style="width:165px;">Lang Dental</td>
			<td style="width:64px;">REF1320</td>
			<td style="width:240px;">For imaging</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Ortho-Jet Dental Acrylic liquid</td>
			<td style="width:165px;">Lang Dental</td>
			<td style="width:64px;">REF1404</td>
			<td style="width:240px;">For imaging</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Gelfoam gelatin sponges</td>
			<td style="width:165px;">Pfizer</td>
			<td style="width:64px;">9E+06</td>
			<td style="width:240px;">For imaging</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">4-0 Ethilon sutures</td>
			<td style="width:165px;">Ethilon</td>
			<td style="width:64px;">1667G</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Reflex Clips, 7mm</td>
			<td style="width:165px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:64px;">INS750344</td>
			<td style="width:240px;">For surgery. Sterilize before use</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Iris Scissors</td>
			<td style="width:165px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:64px;">14061-09</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">45/5 Forceps, Dumoxel</td>
			<td style="width:165px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:64px;">11251-35</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Rongeurs</td>
			<td style="width:165px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:64px;">16021-14</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">30 gauge needle</td>
			<td style="width:165px;">BD</td>
			<td style="width:64px;">305106</td>
			<td style="width:240px;">For making access holes in dura</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:125px;">Forceps Dumont #4 Biology tips</td>
			<td style="width:165px;">Dumont</td>
			<td style="width:64px;">11242-40</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Needle Drivers</td>
			<td style="width:165px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:64px;">12002-12</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Michel Wound Clip Forceps</td>
			<td style="width:165px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:64px;">INS700753</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Wound clip remover</td>
			<td style="width:165px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:64px;">12033-00</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:125px;">O-rings for Forceps</td>
			<td style="width:165px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:64px;">11200-00</td>
			<td style="width:240px;">For surgery, Often provided with #4 forceps, can also be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:125px;">Cordless Rechargable Animal trimmer</td>
			<td style="width:165px;">Wahl</td>
			<td style="width:64px;">Series 8900</td>
			<td style="width:240px;">for surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Vetbond</td>
			<td style="width:165px;">3M</td>
			<td style="width:64px;">1469SB</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:125px;">Betadine Solution (10% Providine-Iodine Topical Solution)</td>
			<td style="width:165px;">Purdue Products L.P.</td>
			<td style="width:64px;">NDC 67618-150-08</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:125px;">Nair Hair remover lotion</td>
			<td style="width:165px;">Church &#38; Dwight Co., Inc.</td>
			<td style="width:64px;">NRSL-22329-05</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:125px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:165px;">Butler Schein</td>
			<td style="width:64px;">NDC 11695-6776-2</td>
			<td style="width:240px;">Drugs &#8211; for surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Marcaine</td>
			<td style="width:165px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:64px;">6E+06</td>
			<td style="width:240px;">Drugs &#8211; for surgery 1.0 mg/kg given subcutaneously&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Bupernex</td>
			<td style="width:165px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:64px;">121-7793</td>
			<td style="width:240px;">Drugs &#8211; for surgery buprenorphine 0.1 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="345" rowspan="6" style="height:345px;width:125px;">aCSF</td>
			<td rowspan="6" style="width:165px;">Chemicals from Sigma</td>
			<td style="width:64px;">119 mm NaCl</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:86px;width:64px;">26.2 mM NaHCO3</td>
			<td style="width:240px;">From Cold Spring Harbor Protocols</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:64px;">2.5 mM KCl</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:64px;">1 mM NaH2PO4</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:64px;">1.3 mM MgCl2</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:64px;">10 mM glucose&#160;</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">TRITC-dextran 150,000 MW</td>
			<td style="width:165px;">Sigma</td>
			<td style="width:64px;">T1287</td>
			<td style="width:240px;">For intravenous administration to label vasculature</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital imaging of axonal interactions with microglia and macrophages in a mouse dorsal column crush injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

תרשים סכמטי המתאר את הנגע למעוך עמודה הגבי מוצג באיור 1 א. לאחר הפגיעה, בעלי החיים מוכנים והתייצבו למיקרוסקופיה intravital באמצעות מהדק השדרה (איור 1). תמונה שצולמה מייד לאחר הפציעה למחוץ עמודה הגבי תערוכות נגע מלבני נראה בבירור עם נקודות החדרת שן מלקחיים שהם בבירור לזיהוי. האקסונים באתר הפציעה, נותקו על פני פרק הזמן של טור הגב כולו (איור 1 ג). שלמות כלי דם נותרה בשלמותה, ואין עדות לדליפת צבע הכלי זוהתה על ידי הקרינה. כדי לבצע הדמיה סידורי של אותו הנגע מעל שבועות, ניתן נתפרו השרירים והעור מעל laminectomy לחשיפה מחדש לאחר מכן. מורפולוגיה נגע דומה נצפית בנקודות זמן מאוחר יותר (1D דמויות, E). 5 ימים לאחר פציעה, אתרי החדרת מלקחיים עדיין נראים לעין אבל הנגע החל להגדיל בד הגודלue לפגיעה משנית הנגרמת על ידי דלקת. האקסונים בסוף הזנב של הנגע שחזרו מהאתר הראשוני של הפציעה באמצעות תהליך הנקרא &quot;dieback axonal&quot;. האקסונים בסוף מקורי של הנגע הציגו ניוון כמו-Wallerian (1D איור, E). בין ימים 5 ו -22 לאחר פציעה, בגודל של הנגע התייצב. במקביל, זרם גדול של CX3CR1 + תאים ניתן לראות שחדר ובמסביב לפצע למעוך בנקודתי הזמן הללו, אם כי זהותו של תאים אלה (מיקרוגליה לעומת מקרופאגים) לא ניתן להבחין בהכנה, כפי שמוצג באיור 1. כדי להבדיל את ההתנהגות של מיקרוגליה ומקרופאגים בתוך מייקרו-סביבת הנגע למעוך, מודל הכימרה הקרינה שימש (שמתואר באיור 2 א). ראשית, תאי אב במח העצם של עכבר + / GFP CX3CR1 מוחלפים בcel תורם לא פלורסנטls, כך microglia + GFP רק CNS-התושב גלוי על ידי הדמיה ניאון. היעילות של הכינון מחדש מח יכולה להיות מאושרת על ידי זרימת cytometry בחינת הדם ההיקפי 8 שבועות לאחר השתלת מח (איור 2 ב, ג). באיור 2, F4 / 80 ומקרופאגים החיוביים GFP, מסומן בכחול, המתגלים ב+ / GFP → C57BL / 6 עכבר chimeric CX3CR1, שבו כמה מונוציטים חיוביים שליליים אבל F4 / 80 GFP הם גם בהווה. באיור 2 ג, אין F4 הכפול חיובי / 80 ותאים חיוביים GFP נותרו לאחר החלפה של מח עצם נמען + / GFP CX3CR1 עם מח עצם מסוג בר. לפני פציעה, מיקרוגליה מופצים באופן שווה בתוך חוט השדרה, בו מוצגות מנוחה, מורפולוגיה מסועפת (איור 2 ד). 8 ימים לאחר פציעה, יכולים להתגלות רק כמה המיקרוגלים ובמסביב לפצע. microglia אלה להציג מורפולוגיה אמבואידית (איור 2E). שנית, עצםתאי אב במח בעכבר לא פלורסנט מוחלפים על ידי תאי מוח של עכבר + / GFP CX3CR1, לכן טיוח מח עצם נגזר CX3CR1 + מונוציטים / מקרופאגים הגלויים על ידי הקרינה GFP (איור 2 א). לפני פציעה, GFP + התאים זוהו רק במידה רבה perivascular, אשר כבר דיווחה להיות מח עצם נגזר ולהתהפך ללא הרף על בסיס קבוע 28 (איור 2F). לאחר פציעה למעוך, ניתן לראות תאים + / GFP CX3CR1 לאורך הצד הפנימי של כלי דם המקיפים את הנגע (איור 2H-J), ומרכז הנגע מלא בחדירת מקרופאגים CX3CR1 + / GFP (איור 2G). הדמיה הזמן לשגות של העמודות הגבי יכולה להתבצע עד 6 שעות. באיור 3, אנו מראים CX3CR1 אינו chimeric + / עכבר GFP מייד לאחר פציעה שבו תאים מהמחזור ניתן לראותn נע מכלי הדם לכיוון ליבת הנגע ומרגש באתר הפציעה (איור 3 א &#39;, ב&#39;; משלים סרט 1). ניתוח תמונת ניצול עוצמת הקרינה לזהות תאים יכול לעקוב אחר הנתיבים נלקחו על ידי מקרופאגים (איור 3 א &#39;, ב&#39;; משלים סרט 1). סטטיסטיקה נגזרת מניתוח ההדמיה מראה תנועתיות של מקרופאגים הממוצע בנגע היא 3.6 מיקרומטר / min (איור 3D). לבסוף, בעדיין ניתן לאתר 22 ימים לאחר פציעה, האקסונים, מיקרוגליה ומקרופאגים בתוך הנגע מפגין תחום ההדמיה יציב על פני תקופות זמן (סרט משלים 2) ארוכות. <img alt="איור 1" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig1highres.jpg" width="600" /> איור 1: יצירה והדמיה רציפה של הפציעה למחוץ עמודה הגבי. (א) הגבפציעה למחוץ עמודה מתבצעת על ידי הסרת תהליך הגב של החוליה ברמת העניין. מלקחיים מוכנסים לתוך טור הגב של גזרי מ&quot;מ כבל 1 השדרה ולאחר מכן סגרו 3 פעמים כדי לייצר את הנגע שמוצג בסגול. (ב) בעלי החיים אז ממוקמים בחוט השדרה מלחציים להשיג יציבות להדמית intravital. (C) מייד לאחר פציעה, אתרי המלקחיים ההכנסה (סגלגל אדום) ומלבני פציעה למחוץ נפח (הקופסה האפורה) ניתן זיהו בבירור. האקסונים בשורשי הגב ניתן לראות (חצים לבנים), כמו גם את הקצוות הפצועים של האקסונים בצד הזנב של הנגע (ראשי חץ מלאים). (ד) 5 ימים לאחר פציעה, אתרי החדרת מלקחיים (סגלגל אדום ), ועדיין יכול להיות דמיין) המידה של הנגע (התיבה האפורה בקלות. הנגע גדל בגודל מאז העלבון הראשוני. האקסונים עוברים ניוון כמו-Wallerian ניתן לראות מקורי לנגע ​​(ראשי חץ פתוח) בadditiעל האקסונים בשורשים הגבי (חצים לבנים) ואת הקצוות של אקסונים נפצעו (ראשי החץ לבנים). (E) 22 ימים לאחר פציעה, אתר הנגע עדיין מזוהה עם ממדים דומים לפציעה לאחר 5 ימים. שים לב למספר הגדול של CX3CR1 + תאים ובסביב האתר נפצע. תכונות שכותרתו הן אותו הדבר כמו ב( D). כל הברים בקנה מידה = 200 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52228/52228fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" width="600" /> איור 2: בנייה של עכברי chimeric כדי לעקוב אחר CX3CR1 + / GFP להביע מקרופאגים נגזרות מח CNS-תושב microglia או עצם בנגע למעוך עמודה הגבי. תרשים סכמטי של דור עכברי chimeric עם או CX3CR1 + / GFP להביע מיל ()croglia או מקרופאגים. ראשית, עכברי Thy-1 YFP H הם מוקרנים ובמח העצם מחדש עם תאי מח מבודדים מעכבר + / GFP CX3CR1, וכתוצאה מכך עכבר chimeric מקרופאגים שהם + GFP. שנית, Thy-1 עכברי H / CX3CR1 + / GFP YFP הם מוקרנים ובמח העצם מחדש עם תאי מח מבודדים מעכבר לא פלורסנט, הפקת עכבר chimeric המיקרוגלים שהם + GFP. (ב) דוגמא של זרימת cytometry נתונים עם תאי F4 / 80 + וCX3CR1 GFP + בדם מבעלי חי chimeric עם תורם מח + / GFP CX3CR1 הושתלו C57BL / 6 נמען מוקרן. דוגמא תאים שמקורם בתורמים החיוביים CX3CR1 כי הם חיוביים עבור שני GFP וF4 / 80 מוצגים בכחול מודגש אזור. (C) של זרימת cytometry נתונים עם F4 / 80 + וCX3CR1 GFP + תאים בבעלי חי chimeric עם C57BL6 מח תורם הושתלו irהמוקרן CX3CR1 נמען + / GFP. שים לב לחוסר CX3CR1 + / GFP החיובי הכפול וF4 / 80 תאים בתוך הכחול מודגש אזור. (ד &#39;) תמונת מצב מיקרוסקופית שני פוטונים intravital של עכבר מתכנית chimeric הראשונה, מראה GFP + מיקרוגליה עם מורפולוגיה מסועפת בתוך הגב עמודה (ראש חץ). תאים אלה ובין בין האקסונים (צהוב) בשורש הגבי ועמודה הגבי. בר סולם = 100 מיקרומטר. (E) ההדמיה Intravital של אותו העכבר ב( B) 8 ימים לאחר פציעת טור הגבי מגלה כמה CX3CR1 + מיקרוגליה עם גופי תא גדולים ואמבואידית בצורה שחסרות תהליכים (ראש חץ). בר סולם = 100 מיקרומטר (F) Snapshot. של עכבר מתכנית chimeric השנייה ב (א), מראה GFP + מקרופאגים זעומים, בתוך parenchyma CNS. בר סולם = 100 מיקרומטר. (G) ההדמיה Intravital של אותו העכבר ב( F) 8 ימים לאחר פציעת טור הגבי מגלים אלזרם arge של מקרופאגים ובמסביב לפצע. בר סולם = 100 מיקרומטר. תמונה בהגדלה גבוהה יותר של תאי דם + CX3CR1 נגזרים במגע עם הכלים בבעלי החיים ללא כל הפגע (H). בר סולם = 30 מיקרומטר. שיקום (I) של תאי CX3CR1 במגע עם הכלי, מבט מבפנים על הספינה. בר סולם = 30 מיקרומטר. (J) שחזור של תאי CX3CR1 במגע עם הכלי, מבט מבחוץ של כלי השיט. בר סולם = 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" width="600" /> איור 3 :. נתוני מעקב תא נציג בCX3CR1 אינו chimeric + / GFP עכבר מייד לאחר למחוץ עמודה הגביפציעה. (א) תמונת מצב של CX3CR1 מיקרוגליה + ומקרופאגים האקסונים סביב פגומים (צהובים) מסרט משלים 1 מייד לאחר פציעה למחוץ טור גב. (B) הנתיבים (האפורים) שצולם על ידי + תאי CX3CR1 ב (א) במהלך 110 דקות פגישת ההדמיה intravital. ייצוג מקודד זמן של המסלולים ב( ב) (ג). מסלולים הם בצבע המבוססים על הזמן שלהם בתוך הסרט כולו 110 דקות, כפי שמוצגים בסרגל הזמן. היסטוגרמה (D) של תנועתיות הכוללת של התאים + CX3CR1. כל הברים בקנה מידה הם 30 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52228/52228fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> סרט משלים 1: סרט intravital נציג מייד לאחר פציעה למחוץ עמודה הגבי בheterozygote הכפול Thy-1 YFP / + <stרונג&gt; / CX3CR1 GFP / + עכבר. הדמיה של עמוד השדרה Intravital בוצעה מייד לאחר פציעה למחוץ עמודה הגבי ברמת T11. פנל ימני מראה התנועה של מיקרוגליה CX3CR1 + ומקרופאגים. נתיבי תנועת התא מוצגים כפסים לבנים על הלוח השמאלי. הפציעה ממוקמת בפינה השמאלית העליונה. ניתן לראות CX3CR1 + תאים עוברים לאתר של הפגיעה במסלולים אלה. האקסונים מוצגים בצהוב. בר סולם = 40 מיקרומטר. סה&quot;כ זמן: 110 דקות. מהירות השמעה: 300x. סרט משלים 2:. סרט intravital נציג ב 22 ימים לאחר נגע למעוך עמודה הגבי בheterozygote הכפול Thy-1 YFP / + / CX3CR1 GFP / + העכבר המוצג כאן הוא סרט נציג שצולם בעכבר 22 ימים לאחר למעוך עמודה הגבי הראשונית פגיעה ברמה T11 השדרה. Injאורי ממוקם בפינה הימנית העליונה של המסגרת. האקסונים עולים (צהוב) rostrally מוצגים בפינה הימנית התחתונה. כלי וריד הגבי ודם מסומנים עם TRITC-dextran (אדום). CX3CR1 + תאים בתוך מהלך הנגע במהירות איטית יותר בהשוואה לאלו מייד לאחר פציעה. בר סולם = 50 מיקרומטר. סה&quot;כ זמן: 90 דקות. מהירות השמעה: 600x.

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury at JoVE.com

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

ההדמיה Intravital של axonal אינטראקציות עם Microglia והמקרופאגים בפגיעת Crush טור העכבר הגבי

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

intravital-imaging-axonal-interactions-with-microglia-macrophages

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.4K Views.  Case Western Reserve University. Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury. 

Video: Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

מרובה עכבר Neuroanatomical תהודה מגנטית

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after injury (Teng et al., 2006). It is recognized that transcriptional programs essential for neurite and axonal outgrowth are 
reactivated upon injury in the PNS (Makwana et al., 2005). However the tools available to analyze neuronal gene regulation in vivo are limited and 
often challenging.
The dorsal root ganglia (DRG) offer an excellent injury model system because both the CNS and PNS are innervated by a 
bifurcated axon originating from the same soma. The ganglia represent a discrete collection of cell bodies where all transcriptional events occur, 
and thus provide a clearly defined region of transcriptional activity that can be easily and reproducibly removed from the animal. Injury of nerve 
fibers in the PNS (e.g. sciatic nerve), where axonal regeneration does occur, should reveal a set of transcriptional programs that are distinct from 
those responding to a similar injury in the CNS, where regeneration does not take place (e.g. spinal cord). Sites for transcription factor binding, 
histone and DNA modification resulting from injury to either PNS or CNS can be characterized using chromatin immunoprecipitation (ChIP). 
Here, we describe a ChIP protocol using fixed mouse DRG tissue following axonal injury. This powerful combination provides a means for characterizing the pro-regeneration chromatin environment necessary for promoting axonal regeneration.

We present a method for chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury. The approach can be used to identify specific transcription factor binding sites and epigenetic modification of histone and DNA important for the regeneration of injured axons in both the peripheral and central nervous system.

הכרומטין immunoprecipitation מרקמות השורש הגבי הגרעינים בעקבות פציעה axonal

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

עכבר לשחזור Sciatic עצב קראש והערכה לאחר ההתחדשות של ניתוח הר שלם שריר

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

הזרקת גנגליון שורש הגבה ו שורש הגבה Crush פגיעה כמודל להתחדשות החושית אקסון

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

בידוד והפקת RNA של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח זחל דג זברה

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous variability and heterogeneity (age, gender, type of trauma, other possible pathologies, etc.), animal models play a key role in unraveling factors that are limitations in clinical research. They provide a standardized and controlled setting to investigate the biological mechanisms of injury and repair following TBI. However, not all animal models mimic the diffuse and subtle nature of mTBI effectively. For example, the commonly used controlled cortical impact (CCI) and lateral fluid percussion injury (LFPI) models make use of a craniotomy to expose the brain and induce widespread focal trauma, which are not commonly seen in mTBI. Therefore, these experimental models are not valid to mimic mTBI. Thus, an appropriate model should be used to investigate mTBI. The Marmarou weight drop model for rats induces similar microstructural alterations and cognitive impairments as seen in patients who sustain mild trauma; therefore, this model was selected for this protocol. Conventional computed tomography and magnetic resonance imaging (MRI) scans commonly show no damage following a mild injury, because mTBI induces often only subtle and diffuse injuries. With diffusion weighted MRI, it is possible to investigate microstructural properties of brain tissue, which can provide more insight into the microscopic alterations following mild trauma. Therefore, the goal of this study is to obtain quantitative information of a selected region-of-interest (i.e., hippocampus) to follow up disease progression after obtaining a mild and diffuse brain injury.

The overall goal of this procedure is to obtain quantitative microstructural information of the hippocampus in a rat with mild traumatic brain injury. This is done using an advanced diffusion-weighted magnetic resonance imaging protocol and region-of-interest based analysis of parametric diffusion maps.

הדמיה מתקדמת דיפוזיה בהיפוקמפוס של חולדות עם פגיעה מוחית טראומטית מתון

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

הבידוד המהיר של הקרופאגים של השורש

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

3D ניתוח קימטי עבור הערכה פונקציונלית במודל חולדה של פציעה העצבים הגיד מעיכה

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Induction of Diffuse Axonal Brain Injury in Rats Based on Rotational Acceleration

Traumatic brain injury (TBI) is a major cause of death and disability. Diffuse axonal injury (DAI) is the predominant mechanism of injury in a large percentage of TBI patients requiring hospitalization. DAI involves widespread axonal damage from shaking, rotation or blast injury, leading to rapid axonal stretch injury and secondary axonal changes that are associated with a long-lasting impact on functional recovery. Historically, experimental models of DAI without focal injury have been difficult to design. Here we validate a simple, reproducible and reliable rodent model of DAI that causes widespread white matter damage without skull fractures or contusions.

This protocol validates a reliable, easy-to-perform and reproducible rodent model of brain diffuse axonal injury (DAI) that induces widespread white matter damage without skull fractures or contusions.

אינדוקציה של פגיעה מוחית Axonal בחולדות מבוסס על האצת הסיבוב

Traumatic brain injury (TBI) is a major cause of death and disability. Diffuse axonal injury (DAI) is the predominant mechanism of injury in a large ...