The following agencies provided critical funding support for this study: MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), Dana Foundation (A.Y.H.), St. Baldrick&#8217;s Foundation (A.Y.H.), Alex&#8217;s Lemonade Stand Foundation (A.Y.H.), Gabrielle&#8217;s Angel Foundation (A.Y.H.) and Hyundai Hope-on-Wheels Program (A.Y.H.). The authors are thankful for the indispensable help of Jerry Silver and Sarah Busch in learning the Dorsal Column Crush (DCC) injury. The authors are also grateful to Jingquang You, Elisabeth Hare and Hongmei Hu for technical help with genotyping and Ross Anderson for mounting the spinal stabilizing unit.

NOTA: Todos los animales deben ser alojados y utilizados de acuerdo con el comité de cuidado y uso de animales (IACUC) en la institución. Todos los procedimientos descritos aquí son aprobados por la Universidad Case Western Reserve IACUC. 1. Animales Transgénicos <ol><li> Utilice reportero ratones fluorescentes disponibles comercialmente para etiquetar axones (Thy-1 YFP H) 50 y microglia / monocitos (CX3CR1 GFP / GFP 51; véase la lista de materiales). Estos ratones deben entrecruzaron y mantenidos como colonias de cría individuales de acuerdo a las políticas de cuidado de los animales institucionales. </li></ol> 2. Médula Ósea Quimeras <ol><li> Identificar a los animales que son al menos 8 semanas de edad para su uso como animales receptores. </li><li> Coloque los animales huéspedes en una jaula irradiación celebración circular diseñado para sostener el ratón en condiciones de garantizar incluso, la irradiación de todo el cuerpo. </li><li> Ajuste del temporizador en una de cesio (Cs-137) irradiador para administrar un dos radiación en todo el cuerpoedad de 800-1.000 Rads a los animales de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ejemplos mostrados aquí son 980 rads). </li><li> Vuelta de los animales a sus jaulas para descansar durante un mínimo de 4 horas. </li><li> Elige animales donantes del genotipo apropiado (véase la Figura 2A) como la fuente de células progenitoras de la médula. NOTA: Los donantes adecuados son animales que expresan diferentes reporteros fluorescentes específicos de linaje desde el host para identificar diferentes poblaciones de células, o uno del mismo genotipo como controles. </li><li> Llene una caja de Petri con 70% de alcohol, y un segundo plato con 10 ml de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medios de comunicación y un colador de 40 micras celular empapado en los medios de comunicación. Llenar un tubo cónico de 15 ml con medio RPMI. Mantenga los platos y tubo en hielo. </li><li> Sacrificar los animales donantes por asfixia de CO 2 de acuerdo con las directrices institucionales. Limpiar la piel y el pelo empapando todo el animal con etanol al 70% hasta que todo piel está húmeda. </li><li> Retire el skdesde la mitad inferior del animal mediante el corte alrededor de la sección media y tirando de la piel hacia abajo sobre las patas traseras para exponer completamente los músculos de la pierna. </li><li> Retire la tibia por sobreextensión anterior en la articulación de la rodilla para dislocar el hueso, entonces el uso de fórceps y tijeras estériles, pelar y cortar los músculos de distancia desde ambos extremos de la tibia. Coloque el hueso en la placa de Petri con el alcohol durante un máximo de 30 segundos y luego traslado al filtro de células en el interior de la placa de Petri que contiene los medios de comunicación. </li><li> Dislocar la articulación de la cadera y pelar lejos los músculos unidos al fémur, colocada brevemente fémur en alcohol y luego se coloca en el mismo filtro de células dentro del plato. </li><li> En una campana de cultivo de tejidos, utilizar tijeras estériles para cortar ambos extremos de los huesos e insertar una aguja de calibre 21 en una jeringa de 1 ml en el extremo del hueso. Enjuague la médula hacia el cónico de 15 ml con medios de comunicación. Repita el procedimiento para los huesos restantes. </li><li> El uso de la parte posterior del émbolo de una jeringa de 3 ml, hueso aplastamiento termina en la célulacolador en la placa de Petri para extraer más células. </li><li> Colocar el filtro en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml y transferir los medios de comunicación con las células aspiradas de la tubo cónico de 15 ml. Utilice la parte posterior del émbolo para aplastar la médula ósea con el fin de obtener una suspensión de células individuales. Lavar las 15 ml tubo cónico, fragmentos de hueso y el filtro de células con 30 ml de medio en un tubo cónico de 50 ml. </li><li> Centrifugar las células durante 5 min a 500 xg para sedimentar las células. </li><li> Lisar las células rojas de la sangre con 2 ml de amonio-cloruro de potasio (ACK) tampón de lisis durante 2 min. Se inactiva el tampón de lisis con 10 ml de medio que contiene suero bovino fetal al 10%. Centrifugar a 500 xg durante 5 a 10 minutos para sedimentar. </li><li> Lavar las células una vez en 10 ml de medio RPMI y dos veces en solución salina, centrifugación a 500 xg durante 5-10 min para sedimentar para cada lavado. </li><li> Resuspender las células a una concentración final de 3 x 10 6 células en 200 l de solución salina. </li><li> Transferencia de 3 x 10 6 células de la médula a través de inyección en la vena de la cola en irrratones receptores adiated. </li><li> Coloque agua acidificada (pH 3,0) en la jaula destinatario y permiten ratones para recuperarse. NOTA: Los ratones que no pasa el trasplante va a morir dentro de 10 a 14 días después del procedimiento. </li><li> Después de 8 semanas, verificar la reconstitución ósea mediante el examen de las células inmunes de la sangre periférica mediante citometría de flujo (Figura 2B-C). </li></ol> 3. Dorsal Crush Columna Lesión NOTA: Elija animales quimera apropiados o animales transgénicos dobles para la cirugía sobre la base de la experiencia deseada. Los animales con células derivadas de médula ósea residentes o bien marcadas fueron creados en los pasos anteriores. <ol><li> Preparar y esterilizar en autoclave herramientas quirúrgicas, incluyendo gubia, Dumont # 4 pinzas, tijeras iris, pinzas para tejidos que sostienen, conductores de agujas y clips de la herida. </li><li> Preparar medicamentos para administrar a los ratones para controlar el dolor. Bupernex y bupivacaína son comúnmente utilizados para el control del dolor. Use medicamentos adecuados según se requiera unand aprobado por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC). </li><li> Inducir la anestesia con 4% de isoflurano y mantener con 1-2% de isoflurano para lograr una tasa de respiración de 60-100 respiraciones por min. Aplicar lubricante ocular para los ojos del animal para evitar la sequedad bajo anestesia y confirmar la falta de respuesta por parte pizca pie. Mantener la temperatura utilizando una almohadilla de calefacción y monitorizar la temperatura usando una sonda rectal. </li><li> Afeitarse la parte posterior del ratón con una afeitadora eléctrica sobre el nivel de la médula espinal objetivo, y luego limpie el área tres veces con povidona-yodo seguido por dos veces con 70% de alcohol. Colocar el animal en un campo estéril, y cubrir el animal con otro paño estéril con un agujero cortado en un lugar apropiado para visualizar el sitio quirúrgico. Mantenga todas las herramientas en paños estériles durante toda la cirugía. </li><li> Cortar la piel a lo largo de la línea media a nivel espinal deseado con tijeras iris para exponer el músculo en la parte posterior del animal. </li><li> Bajo un disseja microscopio, cortar los músculos de la espalda, incluyendo el trapecio y los ligamentos de la dorsal ancho a lo largo de la línea media donde se unen a los procesos espinales dorsales, y exponer la columna vertebral. </li><li> Quitar los músculos rotadores entre los procesos dorsales y transversal de la vértebra para revelar la lámina de la vértebra específica a eliminar (T11 en este caso). Identificar T11 mediante la inserción de la última costilla no flotante en este proceso. </li><li> Inserte consejos de gubia en el espacio por encima y por debajo del proceso que desea eliminar y levantar ligeramente para asegurarse de que están en su lugar alrededor de la lámina vertebral, pero no demasiado profunda como para lesionar la columna vertebral. Cerrar gubia en un solo movimiento para quitar la lámina. </li><li> Agrandar la laminectomía, según sea necesario utilizando las gubias para eliminar pequeñas partes de la vértebra restante. </li><li> Mida 1 mm desde la punta de un # 4 fórceps sosteniéndolos contra un gobernante y marcado con un marcador permanente. Medir un 1 mm de separación apuestaWeen los dos dientes mediante la celebración de la pinza contra el gobernante y fijar la anchura máxima de las puntas a 1 mm deslizando un anillo fórceps de goma en su lugar sobre el eje de la pinza. </li><li> Crear un pequeño agujero mediante la inserción de una aguja de calibre 30 a través de la duramadre en los dos puntos de inserción para los dientes de las pinzas para acceder a la médula espinal. </li><li> Insertar las púas fórceps en un ángulo de 90 ° a la duramadre a través de los agujeros a la profundidad de 1 mm marcados en los lados de las pinzas, asegurándose de que la marca está por encima de la duramadre. Una pizca de cerrar la pinza y aguante por 10 segundos. Liberación, y la repetición fórceps exprimir dos veces más para un total de tres bodegas. Eliminar fórceps de la médula espinal. </li><li> Remoje un pedazo de gelatina absorbible comprimido esponja en solución salina y el lugar sobre el sitio de la lesión. </li><li> Usando una puntada corriente, suturar el músculo en su lugar sobre la laminectomía y empapado esponja de gelatina con # 4 suturas de nylon no absorbibles sintéticos. </li><li> Clip de la piel en su lugar con 5 mm cli heridaps. </li><li> Inyectar 10 l de bupivacaína (1,0 mg / kg) en 490 l de solución salina por vía subcutánea alrededor del sitio de la incisión y 5 l Bupernex (0,1 mg / kg) por vía intramuscular en los músculos de los glúteos. </li><li> Deje que los animales se recupere en una compresa caliente y monitorear para cualquier dificultad en el movimiento o signos de parálisis en las extremidades posteriores. No deje de animales desatendidos o en presencia de otros animales hasta que se recupere completamente de la anestesia. No utilice animales que muestran déficits motores observables. NOTA: Aunque esta lesión de aplastamiento se puede realizar en cualquier nivel a lo largo de la médula espinal, prácticamente, T10-L4 plantean menos problemas técnicos para formación de imágenes con respecto a la respiración y estabilizar el movimiento del cuerpo usando abrazaderas. Colocación de la abrazadera debe ser modificado alrededor de la caja torácica a la imagen en los niveles torácicos. </li></ol> 4. intravital Imaging <ol><li> Preparar y esterilizar en autoclave herramientas quirúrgicas, incluyendo Dumont # 4 pinzas, tijeras iris, pinzas para sujetar el tejido, la aguja dríos y clips de la herida. </li><li> Anestesiar el ratón como antes con isoflurano. Inducir la anestesia en el 4-5% y se mantiene a 1-2% según sea necesario para mantener una tasa de respiración de 60 a 100 veces por minuto y la falta de respuesta a la pizca pie. Mantenga el ratón climatizada, monitorear la frecuencia respiratoria cuando no la formación de imágenes y un seguimiento continuo de la temperatura de los animales con una sonda rectal. </li><li> Limpie la piel alrededor de los clips de la herida con Betadine y luego el alcohol y eliminar los clips de la herida de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una vez que se eliminan los clips de la herida, quitar el pelo con Nair si es necesario limpiar el sitio de nuevo con alcohol de povidona yodada y el 70%. </li><li> Vuelva a abrir la piel con unas tijeras. Retire cualquier suturas restantes de músculo y tire muscular aparte con fórceps, cortar con tijeras si es necesario. </li><li> Bajo un microscopio de disección, crear bolsas para la médula espinal abrazaderas cortando el músculo con tijeras en el lado de los procesos transversos de la vértebra un nivel vertebral por encima y por debajo de la laminectomy. </li><li> Coloque las abrazaderas alrededor de cada una de estas vértebras y apriete. Ajuste según sea necesario para dejar espacio para objetivo de microscopio para llegar a la médula espinal. Asegúrese de que la médula espinal es paralelo a la plataforma de formación de imágenes, y mantener la estabilidad del tejido para formación de imágenes. Si se observa artefacto respiración, vuelva a ajustar las abrazaderas en consecuencia para minimizar el movimiento en el campo de la imagen. </li><li> Cubra las abrazaderas con parafina. </li><li> Retire la gelatina comprimido esponja absorbible de la médula espinal con pinzas, con delicadeza secuestrando tantas piezas como sea posible, también la eliminación de la mayor cantidad de tejido cicatricial en los meninges como sea posible. Cubierta expuesta la médula espinal con solución salina y esponja nueva si es necesario. NOTA: Si el sangrado se produce desde el músculo circundante, ya sea firme con esponja o cauterizar según sea necesario. Sin embargo, tenga cuidado de no tocar la médula espinal con el cauterio. Cubrir la médula espinal, ya sea con un pedazo de tejido humedecido o gelatina comprimido esponja cuando la cauterización. </li><li> Crear un well para mantener el fluido de inmersión por primera sellado de la piel y el tejido con Vetbond y, a continuación, usando el acrílico dental para construir un pozo entre las dos abrazaderas del titular de la médula espinal y los lados del animal. Espere hasta que los curas de acrílico. </li><li> Llene el bien con el líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) y comprobar de nuevo para cualquier sangrado alrededor del sitio de la cirugía. </li><li> Opcionalmente en este punto, inyectar colorantes fluorescentes de los vasos por vía intravenosa por inyección en la vena de la cola para resaltar los vasos sanguíneos durante la exploración. NOTA: dextrano fluorescente por encima de 70 kDa se utiliza a menudo, a pesar de los puntos cuánticos y lectinas marcadas con fluorescencia también sirven como colorantes vasos útiles. 50 l de 150.000 WM TRITC-dextrano normalmente se inyecta por vía intravenosa. </li><li> Para obtener la motilidad celular inmune fisiológicamente relevante, la temperatura del ratón se debe mantener a 37 ° C. Mueve el ratón para un ambiente de temperatura controlada bajo el microscopio para la imagen y controlar al animal para anes correctosnivel tesia por la frecuencia respiratoria y la pizca pie. Monitorear el animal con frecuencia durante la exploración para determinar la profundidad de la anestesia, con el objetivo de alcanzar una frecuencia respiratoria de 60 a 100 veces por minuto. </li><li> Busque el sitio de formación de imágenes a través del ocular del microscopio. </li><li> Ajuste el 2 fotones microscopio de barrido láser para tomar una imagen de z-pila cada 30 a 60 segundos para obtener datos de imágenes dinámicas. </li><li> Una vez que se haya completado la sesión de imágenes quitar el animal de la caja caliente. </li><li> Afloje las abrazaderas de la columna vertebral y quitar el ratón de las abrazaderas. Tire del acrílico bien lejos de la piel, mientras que la eliminación de las abrazaderas. </li><li> Si el ratón es a ser fotografiado de nuevo, colocar solución salina empapado de gelatina comprimido esponja sobre la médula espinal. Cierre el músculo y la piel sobre el sitio de la cirugía. No dejar al animal sin supervisión o en presencia de otros animales, mientras se recupera de la anestesia. Si el animal muestra signos de déficit neurológico después de la recuperación, el animal debe ser sacrificado. De lo contrario, la eutanasiael ratón en una cámara de CO 2 antes de que emerja de la anestesia, según el protocolo aprobado por el IACUC la eutanasia. </li><li> Analizar imágenes fluorescentes con software de análisis, siguiendo las instrucciones del fabricante. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Interacciones de imágenes de diferentes tipos de células en sus compartimentos de tejidos nativos durante consiguiente patología en tiempo real ha generado un gran interés. Dentro de la densa red de la CNS, contacto célula-célula y la señalización con las células adyacentes son esenciales para la función normal y para la comprensión de la patología del SNC. Aquí, describimos el uso de 2-fotón microscopía de escaneo láser para la observación de movimiento celular dentro de una lesión mecánica en la médula espinal. Además de la calidad de la preparación de la cirugía y el tejido, la estabilidad mecánica del tejido es de suma importancia para el éxito de la microscopía de lapso de tiempo, en particular el aislamiento de la médula espinal de la respiración artefacto de movimiento. La estabilidad puede evaluarse mediante la búsqueda de movimiento de la médula espinal en un microscopio de disección que corresponde a la frecuencia cardíaca o la respiración del animal. Estabilidad debe evaluar tanto el desempeño de la cirugía y también inmediatamente antes de comenzar la proyección de imagen. Si el ánimal no es estable, se deben hacer ajustes a la colocación y el apriete de las abrazaderas de la médula espinal. Modelos fluorescente específico reportero ratón de tipo celular, junto con enfoques quimeras de médula ósea han permitido la identificación de las células monocíticas frente microglia y axones. Estudios previos han revelado que los monocitos derivados de la sangre y no microglia son responsables de daño axonal secundaria después de un traumatismo utilizando la metodología descrita aquí 43. El dextrano tinte buque conjugado permite la identificación del buque, tanto para proporcionar puntos de referencia y de detectar infracciones de integridad de los vasos. La selección del modelo de ratón reportero fluorescente apropiado es crítico para permitir la correcta identificación de los tipos de células deseados a explorar. Desarrollo de modelos de ratón fluorescentes que son apropiados para los estudios que está realizando también es fundamental para el éxito de los experimentos. Distinguir entre las dos poblaciones fagocíticas del CX3CR1 + / GFP </sup&gt; Células en el SNC ha sido tradicionalmente difícil. Como se muestra aquí, una técnica inmunológica común, quimeras de irradiación, se puede utilizar para distinguir la radio-resistentes, microglia residente CNS de los macrófagos derivados de médula ósea. El procedimiento de irradiación tiene el potencial de dañar la barrera hematoencefálica y alterar fenotipos de células, por lo que el uso de este modelo debe ser considerado cuidadosamente. El alcance de estos cambios se diferencia con dosis de irradiación, así como la duración del período de recuperación, y su impacto en diferentes modelos inflamatorios no se ha estudiado completamente. Los efectos de la irradiación sobre CNS barrera hematoencefálica pueden ser minimizados mediante el blindaje de la cabeza durante la irradiación, y esto se ha demostrado que disminuye la infiltración de células en la médula espinal después de la irradiación, incluso si la médula espinal no está directamente protegido 52. Aquí hemos observado que el número de células infiltrantes en el SNC en estado de equilibrio como resultado de la generación de quimera es insignificante en contraste con el entumecidaer de las células que entran en la lesión. Otros modelos alternativos a considerar incluyen quimeras inducidas por fármacos 52 o modelos parabiotic ratón 53. Aquí, hemos presentado un modelo de lesión específica pequeño, simple y reproducible, que resulta en una lesión de la materia blanca dorsal de la médula espinal que es fácil de imagen utilizando la microscopía de 2-fotón. Este método también proporciona una lesión cuantificable en analizar el grado de muerte regresiva axonal en las columnas dorsales que en la literatura ha sido, junto con el análisis complementario tejido fijado 16,18,43,48,54. En este modelo, los animales muestran sólo los déficits mínimos y no requieren cuidados especiales después de una lesión. Los estudios futuros que utilizan las técnicas de lesión por aplastamiento de la columna y de imágenes dorsales aquí descritos pueden ser poderosas herramientas de evaluación para evaluar la eficacia del tratamiento para la lesión de la médula espinal. Estos tratamientos pueden incluir inhibidores de moléculas pequeñas, fármacos, productos celulares, injertos de tejido y tratamiento combinatorios. La interacción entre macrófagos, microglia y neuronas son también probable que desempeñe un papel en otros modelos de enfermedad en la médula espinal, incluyendo esclerosis múltiple, tumores, meningitis y la esclerosis lateral amiotrófica, y esta técnica puede ser útil en el estudio de estas enfermedades, así .

La reacción inflamatoria a la enfermedad o lesión en el sistema nervioso central (CNS) es poco conocida, especialmente con respecto a las interacciones entre las células inmunes y residentes dentro del tejido. Las investigaciones de estas interacciones celulares en la médula espinal son de particular interés en el animal vivo. El único de fácil acceso CNS blanco tracto asunto está en las columnas dorsales de la médula espinal, haciendo de este un área importante en la que centrar los esfuerzos en mejorar el enfoque experimental factible. Estas investigaciones han sido limitadas debido a la dificultad técnica en el acceso y la estabilización de la CNS para formación de imágenes. Imágenes en vivo en la médula espinal ha sido descrita movimiento celular previamente 1-13, sin embargo, pocos estudios han abordado en una lesión de la médula espinal más allá de unas pocas horas después de la lesión inicial. La lesión traumática de la médula espinal es un entorno complejo, con las neuronas, astrocitos, fibroblastos, células progenitoras NG2, y las células inmunitarias including microglía, neutrófilos, macrófagos, células T, células B y células dendríticas 14,15. Los macrófagos son el subconjunto de células inmunes responsables de la fagocitosis en la lesión, la infiltración de la circulación. El papel de estas células fagocíticas se ha debatido, con informes que indican que estas células pueden asumir ambos roles perjudiciales y protectores en el tejido lesionado. Estas funciones van desde el aumento de muerte regresiva axonal secundaria después de una lesión y actuar de una manera fagocítica 16-22, para asumir una cicatrización de heridas fenotipo y la disminución de los déficits funcionales en el animal herido 21,23,24. Anteriormente, los intentos para distinguir los macrófagos de microglia se han basado principalmente en la morfología en el tejido sano. Sin embargo, la microglía y macrófagos activados expresan muchos de los mismos marcadores y muestran morfología indistinguibles después de la lesión 25-29, haciendo que la separación de las diferentes actividades de estas células difíciles de estudiar based en estos factores por sí solos 30. Estas células se pueden separar por la expresión diferencial de CD45 usando citometría de flujo 33,34, aunque este enfoque es menos útil en la discriminación de estos tipos de células in vivo. Utilizando la expresión diferencial de CCR2 y CX3CR1 en la microglía y los macrófagos también ha sido explorado, aunque los cambios dinámicos en la expresión de estos marcadores como los monocitos se diferencian en macrófagos puede complicar el análisis preciso 35,36. La microglía son las células inmunes residentes en el SNC y surgen a partir de progenitores saco vitelino durante el desarrollo fetal, mientras que los macrófagos se derivan a partir de progenitores de médula ósea y entran en el SNC lesionado después de un insulto 31,32. Un enfoque alternativo a la utilización de la morfología de distinguir estos dos tipos de células es reemplazar la médula ósea con células progenitoras a partir de un animal donante que expresa un marcador detectable en los macrófagos derivados de los progenitores de los donantes, preservando al mismo tiempo el residente CNS, recipient derivado de microglia. Estos modelos quiméricos de la médula ósea se utilizan comúnmente en muchas otras aplicaciones 37-40. Este método tiene advertencias únicas asociadas con el daño a la integridad de la barrera sangre-cerebro causada por irradiación o citotóxicos fármacos utilizados para erradicar progenitores de médula ósea en el huésped, lo que limita su uso en ciertas aplicaciones. Recientemente, las distinciones funcionales entre los macrófagos y microglia en el SNC están comenzando a ser discernido mediante citometría de flujo, el análisis conjunto de chips de genes y métodos quimerismo 24,26,41-44, que resultará muy útil en el futuro. Aunque la separación de estos dos tipos de células sigue siendo difícil, la comprensión de sus funciones únicas es importante en llevar a tratamientos más específicos de los trastornos que involucran tanto a los macrófagos y microglia en el SNC. Descripción de las interacciones celulares dentro de la lesión de la médula espinal ha venido principalmente de estudios con modelos de cultivo celular. Esto es due a los desafíos implicados con imágenes tanto de la lesión de la médula espinal y células inmunes juntos en un animal vivo. Modelos de roedores actuales de lesión de la médula espinal de variar el tipo y la gravedad incluyen modelos contusión 45,46, lesiones pinchazo 2, laceración 47, y la lesión por aplastamiento de la columna dorsal descrito aquí 16,18,48. La inflamación de las meninges aumenta con la gravedad de la lesión y plantea desafíos únicos para la implantación de las ventanas o cirugías para imágenes en serie. Algunos de estos desafíos incluyen la infiltración de células fagocíticas, así como la generación de tejido fibroso sobre el sitio quirúrgico. Algunos de estos problemas pueden ser superados mediante la creación de lesiones más pequeñas y que cubre la médula espinal expuesta con apósito quirúrgico no inmunogénica entre la duramadre y los músculos paravertebrales para permitir la cirugía reapertura posterior, como se hace aquí a estudiar la columna de la lesión por aplastamiento dorsal . La capacidad de imagen sólo la porción dorsal de la escisiónal cable también limita la elección de la lesión, ya que los modelos contusiones causan principalmente daños en el cable central, a menudo ahorra la parte más dorsal de la columna dorsal, especialmente en los puntos de tiempo tempranos después de la lesión 45,49. Por lo tanto, se describe un modelo de lesión simple que produce una lesión limpio, repetible, de forma rectangular que es útil tanto para la observación de movimiento de las células dentro de la lesión y para facilitar la cuantificación de la posición axonal en relación con la lesión.

<table><tbody><tr><td>CX3CR1 GFP mice</td><td>Jackson laboratories</td><td>5582</td><td></td></tr><tr><td>Thy-1 YFP H mice</td><td>Jackson laboratories</td><td>3782</td><td></td></tr><tr><td>Mouse pie cage</td><td>Braintree Scientific</td><td>MPC 2 set</td><td></td></tr><tr><td>60 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Petri dish</td><td>Corning</td><td>430166</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>Falcon 40 &amp;mu;m cell filter</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>1 x 15 ml and 1 x 50 ml conical tube</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>21 gauge needle</td><td>BD</td><td>305177</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>BD</td><td>309628</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>ACK lysis buffer</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-022-CV</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>RPMI media</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>F4/80 antibody</td><td>Ebioscience</td><td>12-4801 PE</td><td>For FACS verification of chimeras</td></tr><tr><td>30 gauge insulin syringe</td><td>BD</td><td>328280</td><td>For tail vein injection</td></tr><tr><td>Spinal Cord Clamps</td><td>Narshinge</td><td>STS-A</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>Ortho-Jet Dental Acrylic powder</td><td>Lang Dental</td><td>REF1320</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>Ortho-Jet Dental Acrylic liquid</td><td>Lang Dental</td><td>REF1404</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>Gelfoam gelatin sponges</td><td>Pfizer</td><td>9034201</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>4-0 Ethilon sutures</td><td>Ethilon</td><td>1667G</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Reflex Clips, 7 mm</td><td>Kent Scientific</td><td>INS750344</td><td>For surgery. Sterilize before use</td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-09</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>45/5 Forceps, Dumoxel</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>30 gauge needle</td><td>BD</td><td>305106</td><td>For making access holes in dura</td></tr><tr><td>Forceps Dumont #4 Biology tips</td><td>Dumont</td><td>11242-40</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Needle Drivers</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Michel Wound Clip Forceps</td><td>Kent Scientific</td><td>INS700753</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Wound clip remover</td><td>Fine Science Tools</td><td>12033-00</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>O-rings for Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-00</td><td>For surgery, Often provided with #4 forceps, can also be ordered separately</td></tr><tr><td>Cordless Rechargable Animal trimmer</td><td>Wahl</td><td>Series 8900</td><td>for surgery</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Betadine Solution (10% Providine-Iodine Topical Solution)</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>NDC 67618-150-08</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Nair Hair remover lotion</td><td>Church &amp;amp; Dwight Co., Inc.</td><td>NRSL-22329-05</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Butler Schein</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td>Drugs &amp;ndash; for surgery</td></tr><tr><td>Marcaine</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 0409-1587-50</td><td>Drugs &amp;ndash; for surgery 1.0 mg/kg given subcutaneously</td></tr><tr><td>Bupernex</td><td>Henry Schein</td><td>121-7793</td><td>Drugs &amp;ndash; for surgery buprenorphine 0.1 mg/kg</td></tr><tr><td>aCSF</td><td>Chemicals from Sigma</td><td>119 mM NaCl&lt;br /&gt;26.2 mM NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&lt;br /&gt;2.5 mM KCl&lt;br /&gt;1 mM NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;br /&gt;1.3 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br /&gt;10 mM glucose</td><td>For surgery&lt;br /&gt;From Cold Spring Harbor Protocols</td></tr><tr><td>TRITC-dextran 150,000 MW</td><td>Sigma</td><td>T1287</td><td>For intravenous administration to label vasculature</td></tr></tbody></table>

intravital imaging of axonal interactions with microglia and macrophages in a mouse dorsal column crush injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

Un diagrama esquemático que representa el dorsal lesión de aplastamiento columna se muestra en la Figura 1A. Después de la lesión, el animal se prepara y se estabilizó para microscopía intravital con abrazaderas de la columna vertebral (Figura 1B). Una imagen tomada inmediatamente después de la lesión dorsal aplastamiento columna muestra una lesión rectangular claramente visible con los puntos de inserción fórceps de dientes que son claramente identificables. Los axones en el sitio de la lesión se cortan a través del ciclo de la columna dorsal entero (Figura 1C). La integridad de los vasos sanguíneos se mantiene intacta, y no hay evidencia de tinte recipiente de fuga se detectó por fluorescencia. Para realizar las imágenes de serie de la misma lesión en cuestión de semanas, los músculos y la piel se pueden suturar sobre la laminectomía para su posterior re-exposición. Similar morfología de las lesiones se ve en los puntos más tarde (Figuras 1D, E). 5 días después de la lesión, los sitios de inserción fórceps son todavía visibles, pero la lesión ha comenzado a aumentar de tamaño due a la lesión secundaria causada por la inflamación. Los axones en el extremo caudal de la lesión han retraído desde el sitio inicial de la lesión a través de un proceso llamado &quot;muerte regresiva axonal&quot;. Los axones en el extremo rostral de la lesión exhibieron walleriana-como la degeneración (Figura 1D, E). Entre los días 5 y 22 después de la lesión, el tamaño de la lesión se ha estabilizado. Al mismo tiempo, una gran afluencia de células CX3CR1 + se puede ver infiltrarse en y alrededor de la lesión de aplastamiento durante estos momentos, a pesar de la identidad de estas células (microglia frente a macrófagos) no se puede distinguir en la preparación, como se muestra en la Figura 1. A fin de distinguir el comportamiento de microglia y macrófagos dentro de la lesión microambiente aplaste, se utilizó un modelo quimera de radiación (se indica en la Figura 2A). En primer lugar, las células progenitoras de la médula ósea de un CX3CR1 + / GFP ratón se sustituyen con cel donante no fluorescentels, por lo que sólo las buenas prácticas agrarias + microglia CNS residente son visibles por imágenes fluorescentes. La eficiencia de la reconstitución ósea puede ser confirmado por citometría de flujo examen de la sangre periférica 8 semanas después del trasplante de médula (Figura 2B, C). En la Figura 2B, F4 / 80 y macrófagos positivas para GFP, resaltada en azul, se detectan en un CX3CR1 + / GFP → C57BL / 6 quimérico ratón, en el que algunos monocitos positivos negativos, pero F4 / 80 GFP también están presentes. En la Figura 2C, no F4 doble positivo / 80 y células GFP positivas se quedan después de la sustitución de CX3CR1 + / GFP médula ósea destinatario con el tipo salvaje de la médula ósea. Antes de la lesión, microglia se distribuyen uniformemente dentro de la médula espinal, mostrando un descanso, la morfología ramificada (Figura 2D). 8 días después de la lesión, sólo unos pocos microglia pueden ser detectados en y alrededor de la lesión. Estos microglia muestran una morfología ameboide (Figura 2E). En segundo lugar, el huesocélulas progenitoras de médula en un ratón no fluorescente se sustituyen por células de la médula de un CX3CR1 + / GFP ratón, por lo tanto, la prestación de médula ósea deriva CX3CR1 + monocitos / macrófagos visibles por la fluorescencia de GFP (Figura 2A). Antes de la lesión, las únicas células GFP + detectadas son en gran parte perivascular, que se han notificado a ser derivadas de médula ósea y continuamente vuelca sobre una base regular 28 (Figura 2F). Después de una lesión por aplastamiento, las células + / GFP CX3CR1 pueden ser vistos a lo largo del interior de los vasos sanguíneos que rodean la lesión (Figura 2H-J), y el centro de la lesión se llena con la infiltración de macrófagos CX3CR1 + / GFP (Figura 2G). Tiempo lapse de imágenes de las columnas dorsales se puede realizar durante un máximo de 6 horas. En la Figura 3, se muestra un CX3CR1 no quimérico + / GFP ratón inmediatamente después de la lesión en el que las células de la circulación se pueden vern moviendo fuera del vaso sanguíneo hacia el núcleo de la lesión y en movimiento dentro del sitio de la lesión (Figura 3A, B; Suplementario Movie 1). El análisis de imágenes utilizando la intensidad de fluorescencia para identificar las células pueden seguir las trayectorias tomadas por los macrófagos (Figura 3a, b; Suplementario Movie 1). Estadísticas derivadas del análisis de imágenes muestran la motilidad promedio de los macrófagos en la lesión es de 3,6 micras / min (Figura 3D). Finalmente, a los 22 días después de la lesión, los axones, macrófagos y microglia todavía se pueden detectar dentro de la lesión que demuestra el área de la imagen es estable durante largos períodos de tiempo (Película complementaria 2). <img alt="Figura 1" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1: Creación e imágenes secuenciales de la lesión dorsal aplastamiento columna. (A) El dorsallesión por aplastamiento columna se lleva a cabo mediante la eliminación del proceso de la vértebra dorsal en el nivel de interés. Fórceps se insertan en la columna de la dorsal de la médula espinal 1 mm entre sí y luego se cierran 3 veces para producir la lesión se muestra en púrpura. (B) El animal se coloca luego con la médula espinal abrazaderas para obtener estabilidad para formación de imágenes intravital. (C) Inmediatamente después de la lesión, los sitios de inserción (fórceps ovales de color rojo) y el volumen de la lesión por aplastamiento rectangular (caja gris) pueden ser claramente identificados. Los axones en las raíces dorsales pueden ser vistos (flechas blancas), así como los extremos de los axones lesionados en el lado caudal de la lesión (cabezas de flecha rellenos). (D) 5 días después de la lesión, los fórceps sitios de inserción (óvalo rojo ), y la extensión de la lesión (caja gris) todavía puede visualizarse fácilmente. La lesión ha aumentado su tamaño desde la lesión inicial. Los axones sometidos Walleriana-como la degeneración pueden verse rostral a la lesión (cabezas de flecha abierta) en additia los axones en las raíces dorsales (flechas blancas) y los extremos de los axones lesionados (puntas de flecha blancas). (E) 22 días después de la lesión, el sitio de lesión aún es identificable con dimensiones similares a la lesión después de 5 días. Tenga en cuenta el gran número de células CX3CR1 + en y alrededor del sitio de la lesión. Características etiquetados son los mismos que en (D). Todas las barras de escala = 200 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52228/52228fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2: Construcción de ratones quiméricos para rastrear CX3CR1 + / GFP expresando macrófagos derivados de médula ósea o microglia CNS residentes en la lesión dorsal aplastamiento columna. (A) Un diagrama esquemático de la generación de ratones quiméricos con cualquiera de CX3CR1 + / GFP expresar microglia o macrófagos. En primer lugar, los ratones Thy-1 H YFP se irradian y la médula ósea se reconstituye con células de la médula aisladas de un CX3CR1 + / GFP ratón, resultando en un ratón quimérico cuya macrófagos son GFP +. En segundo lugar, Thy-1 YFP ratones H / CX3CR1 + / GFP se irradian y la médula ósea se reconstituye con células de la médula aisladas a partir de un ratón no fluorescente, produciendo un ratón quimérico cuya microglia son GFP +. (B) Ejemplo de citometría de flujo de datos con células F4 / 80 + y CX3CR1 GFP + en la sangre de un animal quimérico con un donante de médula + / GFP CX3CR1 trasplantado en un irradiado C57BL / 6 destinatario. Las células derivadas de los donantes positivos CX3CR1 que son positivas tanto para GFP y F4 / 80 se muestran en el área azul resaltado. (C) Ejemplo de citometría de flujo de datos con células F4 / 80 + y CX3CR1 GFP + en un animal quimérico con una C57BL6 donantes de médula ósea trasplantada a una IRradiada CX3CR1 destinatario + / GFP. Tenga en cuenta la falta de doble CX3CR1 + / GFP positivas y células F4 / 80 dentro de la zona azul resaltado. (D) Una de dos fotones instantánea microscópica intravital de un ratón desde el primer esquema quimérico, mostrando GFP + microglia con morfología ramificada en el dorsal columna (cabeza de flecha). Estas células se intercalan entre los axones (amarillo) en la raíz dorsal y la columna dorsal. La barra de escala = 100 micras. (E) intravital de imágenes del mismo ratón en (B) 8 días después de la lesión de la columna dorsal revela algunos CX3CR1 + microglia con cuerpos celulares grandes y en forma de ameboides que faltan procesos (cabeza de flecha). Barra de escala = 100 micras. (F) Instantánea de un ratón desde el segundo esquema de quimérico en (A), mostrando escasa GFP + macrófagos, en el parénquima del SNC. La barra de escala = 100 micras. (G) de imágenes intravital del mismo ratón en (F) 8 días después de la lesión de la columna dorsal revela alarge afluencia de macrófagos en y alrededor de la lesión. La barra de escala = 100 micras. (H) Una imagen más ampliada de células derivadas + sangre CX3CR1 en contacto con los buques en el animal está sano. Barra de escala = 30 m. (I) Una reconstrucción de células CX3CR1 en contacto con el recipiente, visto desde el interior del recipiente. Barra de escala = 30 m. (J) Una reconstrucción de células CX3CR1 en contacto con el recipiente, visto desde fuera del vaso. La barra de escala = 20 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 3 :. Datos de seguimiento de la célula de representación en un CX3CR1 no quimérico + / GFP ratón inmediatamente después de aplastar la columna dorsallesión. (A) Una instantánea de CX3CR1 + macrófagos y microglia axones dañados alrededor (amarillo) de la película complementaria 1 inmediatamente después de una lesión por aplastamiento de la columna dorsal. (B) Los caminos (gris) tomado por las células CX3CR1 + en (A) durante una 110 min sesión de imágenes intravital. (C) Una vez representación codificada de las pistas en (B). Las pistas son de color en función de su tiempo dentro de toda la película 110 minutos, como se muestra en la barra de tiempo. (D) Histograma de la motilidad global de las células CX3CR1 +. Todas las barras de escala son 30 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52228/52228fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Película complementaria 1: película intravital Representante inmediatamente después de la lesión por aplastamiento de la columna dorsal en el doble heterocigoto Thy-1 YFP / + <strong&gt; / CX3CR1 GFP / + ratón. imágenes médula intravital se realizó inmediatamente después de una lesión por aplastamiento columna dorsal a nivel T11. El panel derecho muestra el movimiento de CX3CR1 + microglia y macrófagos. Los caminos del movimiento de las células se muestran como pistas blancas en el panel izquierdo. La lesión se encuentra a la esquina superior izquierda. Células CX3CR1 + se puede ver en movimiento en el sitio de la lesión a lo largo de estas pistas. Los axones se muestran en amarillo. La barra de escala = 40 micras. Tiempo total: 110 min. La velocidad de reproducción: 300x. Película complementaria 2:. Película intravital Representante a los 22 días después de la lesión de aplastamiento de la columna dorsal en el doble heterocigoto Thy-1 YFP / + / CX3CR1 GFP / + ratón Aquí se muestra una película representativa tomada en un ratón 22 días después de la aglomeración inicial columna dorsal lesión en T11 nivel espinal. El injUry se encuentra en la esquina superior derecha del marco. Los axones (amarillo) ascendente rostral se muestran en la parte inferior derecha. Los vasos de la vena dorsal y la sangre son etiquetados con TRITC-dextrano (rojo). + Células CX3CR1 dentro de la lesión movimiento a una velocidad más lenta en comparación con los inmediatamente después de la lesión. La barra de escala = 50 micras. Tiempo total: 90 min. La velocidad de reproducción: 600x.

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury at JoVE.com

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

Imaging intravital de axonales Interacciones con macrófagos y microglia en un ratón Dorsal Crush Columna Lesión

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

intravital-imaging-axonal-interactions-with-microglia-macrophages

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.4K vistas.  Case Western Reserve University. Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury. 

Video: Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Imágenes in vivo de la médula espinal de ratón Utilizando microscopía de dos fotones

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Investigación

Neurociencias

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Imágenes en vivo de los axones de la raíz dorsal después de rizotomía

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as multiple sclerosis. Here we present a low-cost and reproducible glass window implantation protocol that is suitable for intravital microscopy and studying the dynamics of spinal cord cytoarchitecture with subcellular resolution in live adult mice with EAE. Briefly, we surgically expose the vertebrae T12-L2 and construct a chamber around the exposed vertebrae using a combination of cyanoacrylate and dental cement. A laminectomy is performed from T13 to L1, and a thin layer of transparent silicone elastomer is applied to the dorsal surface of the exposed spinal cord. A modified glass cover slip is implanted over the exposed spinal cord taking care that the glass does not directly contact the spinal cord. To reduce the infiltration of inflammatory cells between the window and spinal cord, anti-inflammatory treatment is administered every 2 days (as recommended by ethics committee) for the first 10 days after implantation. EAE is induced only 2-3 weeks after the cessation of anti-inflammatory treatment.
Using this approach we successfully induced EAE in 87% of animals with implanted windows and, using Thy1-CFP-23 mice (blue axons in dorsal spinal cord), quantified axonal loss throughout EAE progression. Taken together, this protocol may be useful for studying the recruitment of various cell populations as well as their interaction dynamics, with subcellular resolution and for extended periods of time. This intravital imaging modality represents a valuable tool for developing therapeutic strategies to treat autoimmune demyelinating diseases such as EAE.

We describe a method for implanting and maintaining glass windows over the exposed spinal cords of adult mice for studying experimental autoimmune encephalomyelitis. These windows provide chronic optical access to the spinal cord for monitoring cell dynamics at the subcellular level in live animals using two-photon microscopy.

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

Medicina

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no effective treatment for it yet. Limitations of currently used animal models impede understanding of the pathology mechanism. Multiphoton microscopy allows studying cells and tissues within intact animal brains longitudinally under physiological and pathological conditions. Here, we describe two models of acute brain injury studied by means of two-photon imaging of brain cell behavior under posttraumatic conditions. A selected brain region is injured with a sharp needle to produce a trauma of a controlled width and depth in the brain parenchyma. Our method uses stereotaxic prick with a syringe needle, which can be combined with simultaneous drug application. We propose that this method can be used as an advanced tool to study cellular mechanisms of pathophysiological consequences of acute trauma in mammalian brain in vivo. In this video, we combine acute brain injury with two preparations: cranial window and skull thinning. We also discuss advantages and limitations of both preparations for multisession imaging of brain regeneration after trauma.

Acute brain trauma is a severe injury that has no adequate treatment to date. Multiphoton microscopy allows studying longitudinally the process of acute brain trauma development and probing therapeutical strategies in rodents. Two models of acute brain trauma studied with in vivo two-photon imaging of brain are demonstrated in this protocol.

Trauma cerebral aguda en ratones seguido de Longitudinal dos fotones de imágenes

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Una<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Médula espinal inducida por láser Lesiones modelo para evaluar los mecanismos de degeneración axonal en tiempo real

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Un procedimiento para el implante Cámara Espinal para Longitudinal<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de la médula espinal de ratón

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

Un en Vivo Dúo color método de proyección de imagen dinámica Vascular tras lesión medular contundente

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. Although studying these cells in isolation in vitro or together ex vivo provides useful physiological information; salient features of neural cell physiology will be missed in such contexts. Therefore, there is a need for studying neural cells in their native in vivo environment. The protocol detailed here describes repetitive in vivo two-photon imaging of neural cells in the rodent cortex as a tool to visualize and study specific cells over extended periods of time from hours to months. We describe in detail the use of the grossly stable brain vasculature as a coarse map or fluorescently labeled dendrites as a fine map of select brain regions of interest. Using these maps as a visual key, we show how neural cells can be precisely relocated for subsequent repetitive in vivo imaging. Using examples of in vivo imaging of fluorescently-labeled microglia, neurons, and NG2+ cells, this protocol demonstrates the ability of this technique to allow repetitive visualization of cellular dynamics in the same brain location over extended time periods, that can further aid in understanding the structural and functional responses of these cells in normal physiology or following pathological insults. Where necessary, this approach can be coupled to functional imaging of neural cells, e.g., with calcium imaging. This approach is especially a powerful technique to visualize the physical interaction between different cell types of the CNS in vivo when genetic mouse models or specific dyes with distinct fluorescent tags to label the cells of interest are available.

This protocol describes a chronic cranial window implantation technique that can be used for longitudinal imaging of neuro-glio-vascular structures, interactions, and function in both healthy and diseased conditions. It serves as a complementary alternative to the transcranial imaging approach that, while often preferred, possesses some critical limitations.

Mapeo cerebral preciso para realizar imágenes in vivo repetitivas de dinámica neuroinmunitaria en ratones

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...

Inmunología e Infección

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope

The goal of this protocol is to demonstrate how to longitudinally visualize the expression and localization of a protein of interest within specific cell types of an animal's brain, upon exposure to exogenous stimuli. Here, the administration of a closed-skull traumatic brain injury (TBI) and simultaneous implantation of a cranial window for subsequent longitudinal intravital imaging in mice is shown. Mice are intracranially injected with an adeno-associated virus (AAV) expressing enhanced green fluorescent protein (EGFP) under a neuronal specific promoter. After 2 to 4 weeks, the mice are subjected to a repetitive TBI using a weight drop device over the AAV injection location. Within the same surgical session, the mice are implanted with a metal headpost and then a glass cranial window over the TBI impacting site. The expression and cellular localization of EGFP is examined using a two-photon microscope in the same brain region exposed to trauma over the course of months.

This study demonstrates delivery of a repetitive traumatic brain injury to mice and simultaneous implantation of a cranial window for subsequent intravital imaging of a neuron-expressed EGFP using two-photon microscopy.

Imágenes intravitales de la expresión de proteínas fluorescentes en ratones con una lesión cerebral traumática de cráneo cerrado y ventana craneal utilizando un microscopio de dos fotones

The goal of this protocol is to demonstrate how to longitudinally visualize the expression and localization of a protein of interest within specific cell ...

Imaging intravital de axonales Interacciones con macrófagos y microglia en un ratón Dorsal Crush Columna Lesión

Resumen

Explorar más videos

Capítulos en este video