אנו מודים פרופ &#39;ג&#39;ף Gerst ובוריס Slobodin עבור העצות המועילות שלהם בהקמת הפרוטוקול המהיר ומתן פלסמידים הדרושים. כמו כן, אנו מודים לד&quot;ר אביגיל עתיר-לנדה על עזרתה בהקמת פרוטוקול זה וד&quot;ר תמר זיו ממרכז פרוטאומיקה סמולר על עזרתה עם ניתוח LC-MS / MS. אנו מודים פרופ TG Kinzy (Rutgers) עבור נוגדן YEF3. עבודה זו נתמכה על ידי מענק 2011013 מהקרן הדו-לאומית למדע.

הערה: הכנס רצף המורכב 12 אתרים MS2 מחייב (MS2 לולאות; MS2L) לתוך מוקד גנומית הרצוי, בדרך כלל בין מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) ואת 3 &#39;UTR. פרוטוקול מפורט לצורך שילוב זה מסופק במקום אחר 22. אמת בנוגע להרכבה ביטוי הולם על ידי PCR, ניתוח הצפוני או RT-PCR 20,23. חשוב לוודא כי השילוב לא התערב עם הסינתזה של 3&#39;UTR. בנוסף, MS2-CP-לבטא פלסמיד התמזגו SBP תחת הביטוי של האמרגן מושרה (דלדול מתיונין) צריך גם להיות מוחדר לתאים 24. זן זהה, למעט לולאות MS12 הציגו, אמור לשמש כביקורת לצורך זיהוי של אותות שאינם ספציפיים. 1. טיהור מהירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול 500 מ&quot;ל של תאי שמרים (השתמש 250-1,000 מ&quot;ל של תאי שמרים בהתאם לרמת הביטוי של הגן של עניין) המבטא mRNA מתויג MS2 20MS2-CP-GFP-SBP היתוך חלבון 24 עד OD 600 0.8 - 1.0 ב 30 o C במדיום הגידול המתאים (למשל, דקסטרוז סינתטי (SD) מצע סלקטיבי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים צנטריפוגה ב 3,000 XG במשך 4 דקות ב RT וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף התאים בופר פוספט 1x (PBS), צנטריפוגות כמו קודם (שלב 1.2), resuspend בנפח שווה (שלב 1.1) של SD ללא מתיונין, דגירה במשך 45 - C 60 דקות ב 30 o להשרות ביטוי של MS2 -CP-GFP-SBP חלבון היתוך. הערה: זמן אינדוקציה ארוך עלול לגרום צבירה של GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בצד 10 מ&quot;ל של תאים ולחלץ RNA ממדגם זה על פי השיטה פשוטה &quot;פנול חם&quot; 25. זהירות: פנול הוא רעיל מאוד, יש לטפל בהתאם להוראות הבטיחות שלו. הערה: RNA זוהי התייחסות טובה איכות RNA הבודד (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור 500 מ&quot;ל תאים, להוסיף 1.35 מ&quot;ל 37% פורמלדהיד ג הסופיoncentration של 0.1% ל crosslink מתחמי-חלבון RNA. המשך דגירה על 30 מעלות צלסיוס למשך 10 דקות. זהירות: פורמלדהיד הוא רעיל מאוד, יש לטפל בהתאם להוראות הבטיחות שלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 26.5 מ&quot;ל של 2.5 מ &#39;גליצין לריכוז סופי של 0.125 M דגירה במשך 3 דקות כדי לעצור crosslinking. משלב זה ואילך, לשים את הכל על קרח כדי למזער השפלה RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב 3000 XG במשך 4 דקות ב 4 מעלות צלסיוס ולשטוף עם 45 מ&quot;ל קר 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 1 מ&quot;ל חיץ תמוגה מהירה לכל 100 מ&quot;ל של תרבית תאים ראשונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התפצלה aliquots של 500 μl צינורות microfuge בורג הכתיר ולהוסיף ~ 400 מ&quot;ג של חרוזי זכוכית מקורר לכל aliquot (בערך צינור PCR מלא 0.2 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse תאים חרוז מקצף במשך 3 דקות. מיד לשים את lysate על הקרח. הערה: משחרר תמוגה Cell RNases הסלולר, אשר הם הגורם העיקרי לפגיעה חמורה RNA. חיץ תמוגה מהירה מכיל ריכוז גבוה של RNase inhibitors, כגון הפרין המעכב RNase הספציפי ומעכבים ספציפיים. עבודה במהירות ושמירת הכל קר מומלץ גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את lysate צינורות חדשים. פירס חור קטן בתחתית כל צינור microfuge במחט חמה (0.8 מ&quot;מ x 40 מ&quot;מ) והמקום צינורות microfuge על גבי 15 צינורות מ&quot;ל. השתמש ראש מזרק 5 מ&quot;ל כמו מתאם בין צינורות microfuge ו -15 מ&quot;ל צינורות. צנטריפוגה הרכבת הצינורות ב 3000 XG דקות 1 ב 4 מעלות צלסיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת זרם דרך מהצינור 15 מ&quot;ל לצינור צנטריפוגות 1.5 מ&quot;ל חדש ב XG 10,000 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלסיוס כדי לנקות פסולת התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatants בריכה מכל צינורות 1.5 מ&quot;ל לתוך צינור 15 מ&quot;ל יחיד, ומניחים בצד 1/50 ו 1/100 נפח של lysate עבור RNA ובידוד חלבון, בהתאמה. הערה: אלה ישמשו את הדגימות &quot;קלט&quot; לניתוח שלאחר מכן (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 300 מיקרוגרם של avidin לכל 500 מ&quot;ל של iתרבית שמרי nitial דגירה למשך 30 דקות (זה יכול להיות מופחת עד 10 דק &#39;) בשעה 4 מעלות צלסיוס מתחת זמן התגלגל (10 סל&quot;ד). הערה: ביוטין בלוקים avidin וחלבונים biotinylated מלהיקשר החרוזים streptavidin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לשטוף את החרוזים streptavidin לפני הדגירה עם lysate התא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר כ -300 μl של streptavidin חרוזים בלועה לצינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל ולהסיר את supernatant העליון. זה יגרום 250 μl של חרוזים. שטפו את החרוזים פעמיים עם 1 מ&quot;ל של חיץ תמוגה מהירה. צנטריפוגה חרוזים streptavidin ב 660 XG במשך 2 דקות ב 4 o בין כל שלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את החרוזים על ידי דוגרים במשך שעה 1 עם 0.5 מ&quot;ל של חיץ תמוגה מהירה, 0.5 מ&quot;ל של 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​BSA ו -10 μl של 10 מ&quot;ג / tRNA שמרים מ&quot;ל. חרוזים ניתן להשאיר O / N בחסימת פתרון ב 4 o C עם רוטציה במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו פעמיים עם 1 מ&quot;ל של חיץ תמוגה מהירה. הערה: חרוזים מגנטיים גם יכול לשמש כדי להפחית את זמן background. יש אלה, עם זאת, קיבולת נמוכה יותר מאשר חרוזים sepharose. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של חרוזים streptavidin מראש שטף אל lysate המכיל avidin (משלב 1.14) ו דגירה שעה 1 ב 4 ° C עם רוטציה קבועה (10 סל&quot;ד). הערה: זמן דגירה זוהי פשרה בין מתן זמן מחייב מספיק ומזעור סיכויים שפל RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 660 XG במשך 2 דקות ב 4 מעלות צלסיוס כדי לנקות את החרוזים streptavidin ולהעביר את supernatant לצינור 15 מ&quot;ל חדש. מניחים בצד 1/50 ו 1/100 נפח של lysate עבור בידוד RNA וחלבון, בהתאמה. הערה: אלה יהיו הדגימות &quot;המאוגדות&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים עם 1 מ&quot;ל של חיץ תמוגה מהירה, לנער בעדינות, להעביר צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge חדש, צנטריפוגות כמו בשלב 1.17. חזור על פעולה זו שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים עם 1 מ&quot;ל של חיץ מהירה לשטוף, וסיבוב הפעם (10 סל&quot;ד) במשך 5 דקות ב 4 °. חזור על פעולה זו פעמיים. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים עם 1 מ&quot;ל של PBS ו צנטריפוגות 1x כנ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים שוב עם 120 μl של 1x PBS. צנטריפוגה כנ&quot;ל, ולקחת את supernatant כולו עבור רנ&quot;א מיצוי חלבון כמו המדגם &quot;לשטוף&quot;. הערה: מדגם לשטוף אחרון זה יציין את ההחמרה של הכביסות וצריך להיות של אותו נפח כמו מדגם Elution. זה יפשט עיבוד וטעינה מבחני הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי elute רנ&quot;א וחלבונים הקשורים RNA מהעמודה, להוסיף 120 μl של ביוטין 6 מ&quot;מ 1x PBS ו דגירה במשך 45 דקות ב 4 ° C עם רוטציה קבועה (10 סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה חרוז כנ&quot;ל ולהעביר את חומר eluted לצינור 1.5 מיליליטר חדש. ספין מדגם eluted שוב ולהעביר את השלב העליון לצינור 1.5 מיליליטר חדש על מנת להבטיח שום שריד של חרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח דגימות עבור RNA או מיצוי חלבון. הערה: הנפח נלקח להסתמך על נחות היסוד ברמת assay והביטוי הבאה של RNA או חלבון העניין. כקו מנחה, לניתוח הצפוני 26, לקחת 80% מהמדגם, עבור כתם המערבי 23,27 או RT-PCR 28, לקבל 20%, ועבור ספקטרומטריית מסה 29 לגלות חלבונים חדשים, לקחת את המדגם כולו. </li></ol> 2. RNA הפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של הצפת היפוך 2x Crosslinking דגירה במשך 45 דקות ב 65 מעלות צלזיוס. המשך ישירות להפקת RNA. הערה: היפוך Crosslinking ההצפה מכיל חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA), אשר משפרת באופן משמעותי מיצוי RNA 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פנול סטנדרטי: שיטת כלורופורם 26 לחלץ RNA מן &quot;הקלט&quot; דגימות &quot;מאוגדות&quot; (שלבי 1.13 ו 1.17). הערה: דגימות אלה מכילות כמות גדולה של הפרין המעכב RNase, אשר יכול לעכב Transcriptase- הפוך עוקבים (RT) מבחני ניצול (למשל, RT-PCR), ולכן, LiCl משקע 30 מומלצת להסיר אותו. את &quot;wash &quot;ו&quot; elution &quot;דגימות (שלבי 1.21 ו -1.24) מכילות כמויות נמוכות של רנ&quot;א הם זרזו באמצעות השלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של 8M guanidinium-HCl (GuHCl) ושני כרכים של אתנול 100% על &quot;לשטוף&quot; דגימות &quot;elution&quot;. דגירה ב -80 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 2. הערה: guanidinium יהיה לפגל חלבונים ביעילות ובכך לעכב RNases ו פרוטאזות במדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 20,000 XG, 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות וזורקים supernatant. שטוף את הכדור עם אתנול ו צנטריפוגות 80% קרים שוב ב -20,000 XG, 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממס את גלולת רנ&quot;א 400 μl מים חינם RNase המשקע שוב כדי להסיר כל שאריות GuHCl או מזהמים אחרים. הוסף 40 μl של 3 M נתרן אצטט, pH 5.2 ו 800 μl של אתנול 100%, דגירה ב -20 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ולשטוף כמו בשלב 2.4 ולהסיר כל אתנול עם טיפ 10 μl. Resuspend את פל RNAet ב 10 מים חינם μl RNase. לטפל נוסף כמו גלולת RNA היא בדרך כלל לא נראה לעין. הערה: דוגמאות ניתן להשתמש לצורך ניתוח הצפוני כמתואר 23 (איור 1). </li></ol> 3. חלבון הכנה כתם המערבי או ניתוח ספקטרומטריית מסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1/3 נפח של חיץ מדגם 4x Laemmli (LSB) כדי דגימות חלבון דגירה 45 דקות ב 65 מעלות צלזיוס כדי להפוך את crosslinking של רנ&quot;א וחלבונים. הערה: דוגמאות ניתן לאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבונים לרוץ על ג&#39;ל polyacrylamide SDS (SDS-PAGE) 31. התאם את אחוז הג&#39;ל בהתאם לגודל של חלבונים להיות מנותח. הערה: 10% ג&#39;ל acrylamide נותן מגוון רחב של נפרד והוא טוב כמו קירוב ראשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבר חלבונים בקרום כמו בניתוח immunoblot תקן 27 על שליטה יעילה בידוד (התרשים 1C). כתם עם או Coomassie הכחול Rכתם 250 או כסף לפני ניתוח ספקטרומטריית מסה. הערה: כתם כסף הוא הבחירה המועדפת, כי זה יותר רגיש ומאפשר זיהוי טוב יותר (איור 1 ב). מכתים ניתן לעשות עם באופן ידני פתרונות מוכנים או ערכות מסחריות. זמן הדגירה של ג&#39;ל הפתרון לצבוע הסופי צריך להיקבע באופן ניסיוני. דגירה ארוכה עשויה לחשוף חלבונים נמוכים בשפע, אבל יכולה לגרום חלבונים מבוטאים בכמות גבוהה כגון MS2-CP-SBP-GFP להיצבע שוב עלול להסוות חלבונים שמסביב בקרבתם. בנוסף, רקע גבוה עלול לגרום. בצע את התגובה בקפידה, ולהוסיף להפסיק פתרון בזמן המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגזור להקות מן הג&#39;ל ולהעבירם 1.5 מ&quot;ל צינורות. חנות דגימות ב -20 ° C, או לשלוח להפקת חלבונים העיכול טריפסין ואחריו LC-MS / MS ניתוח 32. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כגישה proteomic אלטרנטיבה שולל את הצעד ההפרדה ג&#39;ל, לעכל חומר eluted משלב 1.24 ב כךlution באמצעות טריפסין ובכפוף LC-MS / MS ניתוח 33. הערה: השמטת הפרדה SDS-PAGE מפשט את פרוטוקול ומגבירה התשואה. עם זאת, דגימות עשויות להכיל עקבות של חומר הניקוי NP-40, אשר מעכב ניתוח ספקטרומטריית מסה. כדי להתגבר על בעיה זו, בצע את הפעולות הבאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל חלבון על SDS-PAGE 31 במשך 10 - 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את החלק כולו של השביל (כלומר, שבו חלבונים נמצאים). הערה: מדגם החלבון עשוי לכלול כמות משמעותית של חלבון MS2-CP-SBP שעשוי לטשטש אותות של חלבונים בשפע נמוכים. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+RNA-binding+proteins+interact+with+functionally+related+sets+of+RNAs,+suggesting+an+extensive+regulatory+system.">Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system.</a> PLoS Biol. 6, e255 (2008).</li><li>Tsvetanova, N. G., Klass, D. M., Salzman, J., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+search+reveals+unexpected+RNA-binding+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Proteome-wide search reveals unexpected RNA-binding proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> PloS One. 5, (2010).</li><li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins.">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149, 1393-1406 (2012).</li><li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+RNA-binding+proteins.">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nat Rev Genet. 15, 829-845 (2014).</li><li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts.">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Mol Cell. 46, 674-690 (2012).</li><li>Mitchell, S. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+properties+of+eukaryotic+mRNPs.">Principles and properties of eukaryotic mRNPs.</a> Mol Cell. 54, 547-558 (2014).</li><li>Licatalosi, D. D., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+processing+and+its+regulation:+global+insights+into+biological+networks.">RNA processing and its regulation: global insights into biological networks.</a> Nat Rev Genet. 11, 75-87 (2010).</li><li>Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+chaperone+Ssa1+affects+mRNA+localization+to+the+mitochondria.">The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria.</a> FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).</li><li>Ascano, M., Gerstberger, S., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-disciplinary+methods+to+define+RNA-protein+interactions+and+regulatory+networks.">Multi-disciplinary methods to define RNA-protein interactions and regulatory networks.</a> Curr Opin Genet Dev. 23, 20-28 (2013).</li><li>Denman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNPs+take+shape+by+CLIPPING+and+PAIRING.">mRNPs take shape by CLIPPING and PAIRING.</a> BioEssays. 28, 1132-1143 (2006).</li><li>McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+comprehensive+experimental+identification+of+RNA-protein+interactions.">Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions.</a> Genome Biol. 15, 203 (2014).</li><li>Bernstein, D. S., Buter, N., Stumpf, C., Wickens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+mRNA-protein+complexes+using+a+yeast+three-hybrid+system.">Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system.</a> Methods. 26, 123-141 (2002).</li><li>SenGupta, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-hybrid+system+to+detect+RNA-protein+interactions+in+vivo.">A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 93, 8496-8501 (1996).</li><li>Yosefzon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+RNA+binding+specificity+of+yeast+Puf2p.">Divergent RNA binding specificity of yeast Puf2p.</a> RNA. 17, 1479-1488 (2011).</li><li>Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+yeast+mRNPs.">Global analysis of yeast mRNPs.</a> Nat Struct Mol Biol. 20, 127-133 (2013).</li><li>Zielinski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+identification+of+ribonucleoprotein-RNA+interactions.">In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1557-1562 (2006).</li><li>Bell, T. J., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell+Genomics:+RNA+Exon-Specific+RNA-Binding+Protein+Isolation.">Live Cell Genomics: RNA Exon-Specific RNA-Binding Protein Isolation.</a> Methods Mol Biol. 1324, 457-468 (2015).</li><li>Leppek, K., Stoecklin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+streptavidin-binding+RNA+aptamer+for+purification+of+ribonucleoprotein+complexes+identifies+novel+ARE-binding+proteins.">An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins.</a> Nucleic Acids Res. 42, e13 (2014).</li><li>Slobodin, B., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mRNA+affinity+purification+technique+for+the+identification+of+interacting+proteins+and+transcripts+in+ribonucleoprotein+complexes.">A novel mRNA affinity purification technique for the identification of interacting proteins and transcripts in ribonucleoprotein complexes.</a> RNA. 16, 2277-2290 (2010).</li><li>Samra, N., Atir-Lande, A., Pnueli, L., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elongation+factor+eEF3+(Yef3)+interacts+with+mRNA+in+a+translation+independent+manner.">The elongation factor eEF3 (Yef3) interacts with mRNA in a translation independent manner.</a> BMC Mol Biol. 16, 17 (2015).</li><li>Loya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3'-UTR+mediates+the+cellular+localization+of+an+mRNA+encoding+a+short+plasma+membrane+protein.">The 3'-UTR mediates the cellular localization of an mRNA encoding a short plasma membrane protein.</a> RNA. 14, 1352-1365 (2008).</li><li>Haim-Vilmovsky, L., Gadir, N., Herbst, R. H., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+integration+method+for+the+simultaneous+visualization+of+endogenous+mRNAs+and+their+translation+products+in+living+yeast.">A genomic integration method for the simultaneous visualization of endogenous mRNAs and their translation products in living yeast.</a> RNA. 17, 2249-2255 (2011).</li><li>Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+extensive+intra-molecular+associations+between+3'-UTRs+and+their+ORFs.">Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs.</a> Nucleic Acids Res. 36, 6728-6738 (2008).</li><li>Slobodin, B., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RaPID:+an+aptamer-based+mRNA+affinity+purification+technique+for+the+identification+of+RNA+and+protein+factors+present+in+ribonucleoprotein+complexes.">RaPID: an aptamer-based mRNA affinity purification technique for the identification of RNA and protein factors present in ribonucleoprotein complexes.</a> Methods Mol Biol. 714, 387-406 (2011).</li><li>Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simple+method+for+preparation+of+RNA+from+Saccharomyces+cerevisiae.">A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Res. 18, 3091-3092 (1990).</li><li>Eldad, N., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ribosomal+density-mapping+procedure+to+explore+ribosome+positions+along+translating+mRNAs.">A ribosomal density-mapping procedure to explore ribosome positions along translating mRNAs.</a> Methods Mol Biol. 419, 231-242 (2008).</li><li>Arava, Y., Seger, R., Fbeta Walker, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GRFbeta,+a+novel+regulator+of+calcium+signaling,+is+expressed+in+pancreatic+beta+cells+and+brain.">GRFbeta, a novel regulator of calcium signaling, is expressed in pancreatic beta cells and brain.</a> J Biol Chem. 274, 24449-24452 (1999).</li><li>Arava, Y., Adamsky, K., Ezerzer, C., Ablamunits, V., Walker, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+gene+expression+in+pancreatic+beta-cells:+cloning+and+characterization+of+differentially+expressed+genes.">Specific gene expression in pancreatic beta-cells: cloning and characterization of differentially expressed genes.</a> Diabetes. 48, 552-556 (1999).</li><li>Bavli-Kertselli, I., Melamed, D., Bar-Ziv, L., Volf, H., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+eukaryotic+initiation+factor+5+rescues+the+translational+defect+of+tpk1w+in+a+manner+that+necessitates+a+novel+phosphorylation+site.">Overexpression of eukaryotic initiation factor 5 rescues the translational defect of tpk1w in a manner that necessitates a novel phosphorylation site.</a> FEBS J. 282, 504-520 (2015).</li><li>Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+RNA+extracted+from+isolated+mitochondria.">Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria.</a> Methods Mol Biol. 714, 287-299 (2011).</li><li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-dimensional+SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis+(1D+SDS-PAGE).">One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE).</a> Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).</li><li>Gundry, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+proteins+and+peptides+for+mass+spectrometry+analysis+in+a+bottom-up+proteomics+workflow.">Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow.</a> Current protocols in molecular biology. Chapter 10, Unit 10.25 (2009).</li><li>Medzihradszky, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-solution+digestion+of+proteins+for+mass+spectrometry.">In-solution digestion of proteins for mass spectrometry.</a> Methods Enzymol. 405, 50-65 (2005).</li><li>Bachler, M., Schroeder, R., von Ahsen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=StreptoTag:+a+novel+method+for+the+isolation+of+RNA-binding+proteins.">StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-binding proteins.</a> RNA. 5, 1509-1516 (1999).</li><li>Oeffinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+steps+forward--one+step+back:+advances+in+affinity+purification+mass+spectrometry+of+macromolecular+complexes.">Two steps forward--one step back: advances in affinity purification mass spectrometry of macromolecular complexes.</a> Proteomics. 12, 1591-1608 (2012).</li><li>Ross, A. F., Oleynikov, Y., Kislauskis, E. H., Taneja, K. L., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+beta-actin+mRNA+zipcode-binding+protein.">Characterization of a beta-actin mRNA zipcode-binding protein.</a> Mol Cell Biol. 17, 2158-2165 (1997).</li><li>Deshler, J. O., Highett, M. I., Schnapp, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+Xenopus+Vg1+mRNA+by+Vera+protein+and+the+endoplasmic+reticulum.">Localization of Xenopus Vg1 mRNA by Vera protein and the endoplasmic reticulum.</a> Science. 276, 1128-1131 (1997).</li><li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast.">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Mol Cell. 2, 437-445 (1998).</li><li>Aizer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+mRNA+targeting+to+P-bodies+in+living+human+cells+reveals+their+dual+role+in+mRNA+decay+and+storage.">Quantifying mRNA targeting to P-bodies in living human cells reveals their dual role in mRNA decay and storage.</a> J Cell Sci. 127, 4443-4456 (2014).</li><li>Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+mRNAs+coding+for+mitochondrial+proteins+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 17, 1551-1565 (2011).</li><li>Lopez de Heredia, ., M, R. P., Jansen, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+integrity+as+a+quality+indicator+during+the+first+steps+of+RNP+purifications+:+a+comparison+of+yeast+lysis+methods.">RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications : a comparison of yeast lysis methods.</a> BMC Biochem. 5, 14 (2004).</li><li>Lee, J. S., Kallehauge, T. B., Pedersen, L. E., Kildegaard, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+integration+in+CHO+cells+mediated+by+CRISPR/Cas9+and+homology-directed+DNA+repair+pathway.">Site-specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway.</a> Sci Rep. 5, 8572 (2015).</li><li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair.">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome Res. 24, 142-153 (2014).</li><li>Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+quantitation+of+protein+expression+and+site-specific+phosphorylation.">Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 6591-6596 (1999).</li><li>de Godoy, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SILAC+yeast:+from+labeling+to+comprehensive+proteome+quantification.">SILAC yeast: from labeling to comprehensive proteome quantification.</a> Methods Mol Biol. 1156, 81-109 (2014).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

שיטות שונות להשתמש הבידוד של mRNAs ספציפי לזהות חלבונים הקשורים בהם 11,34 35. שיטות אלה חלות במבחנה אסטרטגיות vivo לחקור אינטראקציות RNA-חלבון. שיטות חוץ גופית דגירה עיבד אקסוגני RNA עם lysate התא כדי ללכוד RBPs ולבודד מתחמי RNP 36,37. גישה יעילה מסו?...

חלבונים קושרי RNA (RBPs) מייצגים כ -10% של ס חלבוני cerevisiae 1,2 וכ -15% של חלבונים יונקים 3-5. הם מעורבים תהליכים תאיים רבים כגון mRNA שלאחר תעתיק עיבוד ורגולציה, תרגום, biogenesis הריבוזום, tRNA aminoacylation ושינוי, שיפוץ הכרומטין, ועוד. בפלח חשוב של RBPs הוא חלבונים קושרי mRNA (mRNPs) 6,7. במהלך ההבשלה mRNA, RBPs שונים לקשור את התמליל ואת לתווך עיבוד הגרעין שלה, לייצא מתוך הגרעין, לוקליזציה הסלולר, תרגום והשפלה 6-8. לפיכך, הקבוצה הנפרדת של RBPs כבול תעתיק מסוים בכל נקודת זמן קובעת העיבוד שלו, ובסופו של דבר את גורלה. זיהוי של RBPs קשור mRNA עשוי לשפר באופן משמעותי את הבנתנו התהליכים שבבסיס תקנה שלאחר התעתיק שלהם. מגוונים גנטיים, מיקרוסקופי, שימשו שיטות ביוכימיות ביואינפורמטיקה לזהות חלבונים המעורבים בוויסות mRNA (הנסקרת ב 9-11). עם זאת, רק כמה שיטות אלה מאפשרים זיהוי של חלבונים הקשורים עם mRNA יעד מסוים. מן ראוי לציין כי הוא המערכת ההיברידית שמרים שלוש (Y3H), אשר מנצלת את ה- mRNA של עניין כפיתיון כדי להקרין ספריית ביטוי בתאי שמרים. שיבוטים חיוביים בדרך כלל הם נצפו באמצעות ביטוי בחירה או כתב צמיחת 12-14. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא מספר רב של חלבונים כי ניתן לסרוק בסביבה הסלולר והיכולת למדוד את עוצמת האינטראקציה RNA-חלבון. חסרונות כוללים מספר הגדול יחסית של תוצאות חיוביות שגויות עקב מחייב הלא ספציפי, ואת הפוטנציאל הגבוה תוצאות שליליות שגויות נובעות, בין שאר, כדי misfolding של טרף חלבון היתוך או RNA הפיתיון. חלופה לגישה הגנטית purifi זיקהקטיון של RNA עם החלבונים הקשורים שלה. פולי A-המכיל mRNAs ניתן לבודד באמצעות השימוש בעמודים dT אוליגו, וחלבונים הקשורים בהם מזוהים על ידי ספקטרומטריית מסה. האינטראקציה RNA חלבון נשמרת בהקשר הסלולר שלה על ידי crosslinking, מה שהופך קשרים קוולנטיים קצר-טווח. השימוש בעמודה אוליגו dT מניב בראיה גלובלית של proteome כולו המשויך כל פולי A-המכיל mRNA 3,5,15. עם זאת, זה אינו מספק רשימה של חלבונים הקשורים עם mRNA מסוים. מעט מאוד שיטות זמינות להשיג הזדהות כזאת. שיטת הזוג כרוכה transfection של חומצות גרעין עם השלמה ליעד mRNA 16,17. חומצת גרעין גם מחוברת פפטיד, אשר מאפשר crosslinking כדי RBPs באזור קרוב לאתר אינטראקציה. לאחר crosslinking, חומצת RBP-פפטיד-גרעין ניתן לבודד נתון ניתוח פרוטאומיקה. לאחרונה, מתודולוגיה מבוססת aptamer הייתהבהצלחה להחיל שואבת מן שורות תאים יונקות 18. Aptamer RNA עם זיקה משופרת streptavidin פותח התמזג רצף של עניין (אלמנט עשיר AU (ARE) במקרה זה). Aptamer-ARE RNA צורף חרוזים streptavidin ו מעורבב עם lysate התא. חלבונים כי קשור ההשתלשלות אינה טוהרו וזוהו על ידי ספקטרומטריית מסה (MS). אמנם שיטה זו זוהתה עמותות המתרחשות מחוץ הגדרות הסלולר (כלומר, במבחנה), היא עשויה להיות שונה בעתיד כדי להציג את aptamers לתוך הגנום ובכך לאפשר את הבידוד של חלבונים הקשורים mRNA בעוד המילייה הסלולר (כלומר, in vivo). בשמרים, שבו מניפולציות גנטיות מבוססות היטב, את השיטה המהירה (שפותחה במעבדתו של פרופ &#39;ג&#39;ף Gerst) מספקת תצוגה של עמותות vivo ב -19. מהירה משלב הכריכה ספציפי וחזק של חלבון מעיל MS2 (MS2-CP) אל רצף הרנ&quot;א MS2, ושל תחום מחייב streptavidin (SBP) streptavidin בשילוב חרוזים מצומדות. זה מאפשר טיהור יעילה של mRNAs מתויג MS2 באמצעות חרוזי streptavidin. יתר על כן, הביטוי של 12 עותקים של MS2 לולאות מאפשר עד שישה MS2-CPS להיקשר בו זמנית אל RNA ולהגדיל את יעילות הבידוד שלה. פרוטוקול זה ולכן הוצע לאפשר זיהוי של חלבונים הקשורים mRNA הרומן פעם דגימות eluted חשופים ניתוח proteomics ידי ספקטרומטריית מסה. אנחנו לאחרונה מנוצלים מהירים לזהות חלבונים חדשים קשורים שמרים PMP1 mRNA 20. PMP1 mRNA הוצגה בעבר יקושר עם קרום ER וסביבתה 3 &#39;המתורגמת (UTR) נמצאה להיות קובע עיקרי בשיתוף זה 21. לפיכך, RBPs אשר נקלט PMP1 3 &#39;UTR צפוי לשחק תפקיד חשוב הלוקליזציה שלה. מהיר ובעקבותיו כרומטוגרף נוזליy-המוני ספקטרומטריית / ספקטרומטריית מסה (LC-MS / MS) גרמה לזיהויו של חלבונים חדשים רבים כי אינטראקציה עם PMP1 20. בזאת, אנו מספקים פרוטוקול מפורט של המתודולוגיה המהירה, שולטים חשוב שצריכים להיעשות, וטיפים טכניים שעלולות לשפר את התשואה וספציפית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="632">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Tris</td>
			<td style="width:107px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS</td>
			<td>bio-lab</td>
			<td align="right">1981232300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTT</td>
			<td>sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acidic Phenol (pH 4.3)</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P4682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3)</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P1944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>bio-lab</td>
			<td align="right">3080521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde</td>
			<td>Frutarom</td>
			<td align="right">5551820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine</td>
			<td>sigma</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NP-40</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td align="right">492016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soybean Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pepstatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M610A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ribonuclease&#160; Inhibitor</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Beads</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>BBI-8541701</td>
			<td>0.4-0.6mm diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini BeadBeater</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td colspan="2">Mini BeadBeater 16</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanidinium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Avidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin Beads</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17-5113-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast tRNA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td>Bacto</td>
			<td dir="LTR">288620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">peptone</td>
			<td>Bacto</td>
			<td dir="LTR">211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 x Phosphate-Buffered saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 M NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4 x Laemmli Sample Buffer (LSB)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hot phenol lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3 M Sodium Acetate pH 5.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100% and 70% Ethanol (EtOH)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase-free water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">RaPID lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 &#181;g/ml Leupeptin, 10 &#181;g/ml Aprotinin, 10 &#181;g/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 &#181;g/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease&#160; Inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2x Cross-linking reversal buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td dir="LTR">100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RaPID wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7.5,&#160; 300 mM NaCl, 0.5% NP-40</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EDTA pH 8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silver Stain Plus Kit</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>161-0449</td>
			<td>For detecting proteins in polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SD selective medium&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-eEF3 (EF3A,YEF3)</td>
			<td colspan="2">Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School)</td>
			<td>1:5,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti GFP antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8334</td>
			<td>1:3,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti rabbit IgG-HRP conjugated</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A9169</td>
			<td>1:10,000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel rna-binding proteins isolation by the rapid methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

מהיר מאפשר הבידוד של רנ&quot;א יעד ספציפי עם החלבונים הקשורים שלה. ההצלחה קריטית שלה הוא שמירה על רנ&quot;א ללא פגע ככל האפשר, ועל ידי כך הושגה כמות של חלבונים מספיק. כדי לקבוע את יעילות הבידוד ואיכות RNA, ניתוח צפון מתבצע (איור 1 א). יש ניתוח צפון הית...

Watch this Scientific Journal Video about Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology at JoVE.com

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

RNA מחייב רומן בידוד חלבונים לפי שיטת RAPID

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

novel-rna-binding-proteins-isolation-by-the-rapid-methodology

Research

JoVE Journal

Genetics

8.9K Views.  Technion - Israel Institute of Technology. RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell. 

Video: Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

מבחני מזווג Conjugative עבור ניתוח רצף ספציפי של חלבוני העברה מעורבים קוניוגציה

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

קינטיקה של סינתזת DNA מפגר גדיל<em&gt; במבחנה</em&gt; על ידי חלבונים שכפול bacteriophage T7

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral gene therapy studies, IS assays, in combination with next-generation sequencing, have been used as a cell-tracking tool to characterize clonal stem cell populations sharing the same IS. For the accurate comparison of repopulating stem cell clones within and across different samples, the detection sensitivity, data reproducibility, and high-throughput capacity of the assay are among the most important assay qualities. This work provides a detailed protocol and data analysis workflow for bidirectional IS analysis. The bidirectional assay can simultaneously sequence both upstream and downstream vector-host junctions. Compared to conventional unidirectional IS sequencing approaches, the bidirectional approach significantly improves IS detection rates and the characterization of integration events at both ends of the target DNA. The data analysis pipeline described here accurately identifies and enumerates identical IS sequences through multiple steps of comparison that map IS sequences onto the reference genome and determine sequencing errors. Using an optimized assay procedure, we have recently published the detailed repopulation patterns of thousands of Hematopoietic Stem Cell (HSC) clones following transplant in rhesus macaques, demonstrating for the first time the precise time point of HSC repopulation and the functional heterogeneity of HSCs in the primate system. The following protocol describes the step-by-step experimental procedure and data analysis workflow that accurately identifies and quantifies identical IS sequences.

This manuscript describes the experimental procedure and software analysis for a bidirectional integration site assay that can simultaneously analyze upstream and downstream vector-host junction DNA. Bidirectional PCR products can be used for any downstream sequencing platform. The resulting data are useful for a high-throughput, quantitative comparison of integrated DNA targets.

דו כיווני Retroviral אינטגרציה אתר PCR מתודולוגיה וניתוח נתונים כמותיים זרימת עבודה

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

מתודולוגיה סטנדרטי כדי לבדוק באתר המוטגניות כפונקציה של תיקון נקודת מוטציה על ידי CRISPR/Cas9 ו- SsODN בתאי אדם

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

מתודולוגיה עבור איתור מדויק של מתילציה DNA מיטוכונדריאלי

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a larger genomic context. Subtractive genomics enables a researcher to isolate a target sequence of interest (T) by comprehensive sequencing and subtracting out known genetic elements (reference, R). The method can be used to identify novel sequences such as mitochondria, chloroplasts, viruses, or germline restricted chromosomes, and is particularly useful when T cannot be easily isolated from R. Beginning with the comprehensive genomic data (R + T), the method uses Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) against a reference sequence, or sequences, to remove the matching known sequences (R), leaving behind the target (T). For subtraction to work best, R should be a relatively complete draft that is missing T. Since sequences remaining after subtraction are tested through quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR), R does not need to be complete for the method to work. Here we link computational steps with experimental steps into a cycle that can be iterated as needed, sequentially removing multiple reference sequences and refining the search for T. The advantage of subtractive genomics is that a completely novel target sequence can be identified even in cases in which physical purification is difficult, impossible, or expensive. A drawback of the method is finding a suitable reference for subtraction and obtaining T-positive and negative samples for qPCR testing. We describe our implementation of the method in the identification of the first gene from the germline-restricted chromosome of zebra finch. In that case computational filtering involved three references (R), sequentially removed over three cycles: an incomplete genomic assembly, raw genomic data, and transcriptomic data.

The purpose of this protocol is to use a combination of computational and bench research to find novel sequences that cannot be easily separated from a co-purifying sequence, which may be only partially known.

גילוי רצף הרומן מאת גנומיקה מופחתים

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

רצף של mRNA מתוך דם שלם באמצעות רצפי Nanopore

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame (ORF) annotation impose two arbitrary criteria: a minimum length of 100 codons and a single ORF per transcript. However, a growing number of studies report expression of proteins from allegedly non-coding regions, challenging the accuracy of current genome annotations. These novel proteins were found encoded either within non-coding RNAs, 5' or 3' untranslated regions (UTRs) of mRNAs, or overlapping a known coding sequence (CDS) in an alternative ORF. OpenProt is the first database that enforces a polycistronic model for eukaryotic genomes, allowing annotation of multiple ORFs per transcript. OpenProt is freely accessible and offers custom downloads of protein sequences across 10 species. Using OpenProt database for proteomic experiments enables novel proteins discovery and highlights the polycistronic nature of eukaryotic genes. The size of OpenProt database (all predicted proteins) is substantial and need be taken in account for the analysis. However, with appropriate false discovery rate (FDR) settings or the use of a restricted OpenProt database, users will gain a more realistic view of the proteomic landscape. Overall, OpenProt is a freely available tool that will foster proteomic discoveries.

OpenProt is a freely accessible database that enforces a polycistronic model of eukaryotic genomes. Here, we present a protocol for the use of OpenProt databases when interrogating mass spectrometry datasets. Using OpenProt database for analysis of proteomic experiments allows for discovery of novel and previously undetectable proteins.

ניתוחים פרוטאומיקס מבוססי ספקטרומטר מסה משימוש במסד הנתונים OpenProt לחשוף את הרומן חלבונים מתורגם ממסגרות קאנונית קריאה פתוחה

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

שיטת בדיקת מעטפת חלבון-RNA כריכת חיידקים

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational steps are used to regulate specific genes. Sequence-specific nucleic acid-binding proteins target specific sequences to control spatial or temporal gene expression. The binding sites in nucleic acids are typically characterized by mutational analysis. However, numerous proteins of interest have no known binding site for such characterization. Here we describe an approach to identify previously unknown binding sites for RNA-binding proteins. It involves iterative selection and amplification of sequences starting with a randomized sequence pool. Following several rounds of these steps-transcription, binding, and amplification-the enriched sequences are sequenced to identify a preferred binding site(s). Success of this approach is monitored using in vitro binding assays. Subsequently, in vitro and in vivo functional assays can be used to assess the biological relevance of the selected sequences. This approach allows identification and characterization of a previously unknown binding site(s) for any RNA-binding protein for which an assay to separate protein-bound and unbound RNAs exists.

Sequence specificity is critical for gene regulation. Regulatory proteins that recognize specific sequences are important for gene regulation. Defining functional binding sites for such proteins is a challenging biological problem. An iterative approach for identification of a binding site for an RNA-binding protein is described here and is applicable to all RNA-binding proteins.

סיור במרחב הרצף כדי לזהות אתרי כריכה עבור חלבונים כריכת רנ א תקינה

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...