ברצוננו להודות לד&quot;ר דוד Olivieri לבחינה ביקורתית של כתב היד הזה, ד&quot;ר נונו מורנו על העזרה לוגיסטית לבנות בעל חיים שלנו כריות חימום ד&quot;ר ויג&#39;אי ק Kuchroo על התרומה סוג של Foxp3 KI-GFP / GFP עכברים. עבודה זו נתמכת על ידי &quot;Fundação פסקה Ciência דואר Tecnologia&quot; (FCT, פורטוגל), מענק # PTDC/EBB-BIO/115514/2009.

1. בעלי חיים הכנה הערות חשובות: המתלים תא רות השתלות הרתי בוצעו בתנאים aseptic. המתלים BM היו מוכנים בתוך מכסי המנוע של החדר שלנו התא התרבות, ואילו השתלת הרתי בוצע בחדר ניתוח הממוקם בתוך מתקן חיה שלנו. על מנת לשמור ולהבטיח תנאים אלו מזוהם, אסור היה להקליט וידאו שלנו במקומות האלה. עם זאת, כל החומרים כירורגית היו autoclaved ואת ספסל כירורגית נוקה בעבר עם Virkon (Pharmacal מעבדות מחקר בע&quot;מ) ו 70% אתנול. כל הנהלים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש הוועדה (IACUC) והם היו הסכם עם הפדרציה האירופאית של המעבדה אגודות בעלי חיים מדע (FELASA) הנחיות. מספר מזהה האישור AO10/2010. כל הניסויים היו נהלים תמונה מסוף החיות היו מורדמים מיד לאחר תום תמונההרכישה. הנוהל המפורט הוא כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקרינים (עם irradiator-γ) 8 שבוע הישן עכברים עירום עם 900 rads להרוס את מבשרי hematopoietic אנדוגני בתוך העצם קישואים (BM). לאחר ההקרנה, להחזיר את החיות בכלובים שלהם עד להכנת תאים מתורם BM להזרקה תוך ורידית והרכבתה מחדש BM נוספת. העברה זו בוצעה BM 1 שעות לאחר ההקרנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את בעלי החיים תורם BM. Tibias ואת עצמות הירך של הגפיים האחוריות של החיה אחד הם בדרך כלל מספיק כדי לשחזר עד 3 חיות הנמען. לאחר המתת חסד עם CO 2, להסיר את הגפיים האחוריות ולאחר מכן להסיר את העור ואת השרירים מהעצמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הקצה הסגור של כל עצם ולשטוף אותו עם PBS (או RPMI) או לרסק את כולם במכתש, באמצעות העלי, עם 2 מ&quot;ל של PBS (או RPMI) כדי להסיר את BM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבש את המבנה BM ההשעיה לתוך תא בודד על ידי חזרות של שאיפה נמרצת USIng פיפטה P1000. לחלופין, ניתן גם להעביר את BM ברחבי מחט מזרק 21G מספר פעמים. צנטריפוגה (400 גרם, 5 דקות, RT), מחדש תאים להשעות PBS, וכן להזריק לווריד אל הנמענים עירום מוקרן שלך. בניסויים שלנו השתמשנו BM מ Foxp3 KI-GFP / עכברים GFP שבו כל התאים T רגולטוריים (Tregs) תביע GFP 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבלה של BM התורם מתרחשת בימים הראשונים לאחר ההעברה, שכן אי - BM-מחדש חיות לא יכול לשרוד יותר מ 14 ימים. עם זאת, יש לחכות 4 עד 6 שבועות על מנת לאפשר התאוששות מלאה של כל התאים BM. Bactrim (Roche) נוספה המים (2 מ&quot;ג / מ&quot;ל) במהלך השבוע הראשון לאחר קרינה כדי להקטין את הסיכון לזיהומים חיידקיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התימוס עובריים להשתלה תוארה כבר 2. בקיצור, להתחיל הרבייה זוגות של עכברים isogenic ולבדוק חיבור (עדות משגל) בכל יום. הפרד פקוק נקבות CO 2-להרדים אותם ביום 15 של pregnancy (תצפית של התקע יום 1 של ההריון). הסר את העוברים ואת thymuses. מניחים את thymuses עובריים בקור PBS עד ההעברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע את השתלת thymuses, להרדים BM-הנמען עכברים עירום עם ketamin (120 מיקרוגרם / גרם של משקל העכבר) / xylazine (16 מיקרוגרם / גרם של משקל העכבר) ולשמור אותם על גבי כרית חימום על 37 מעלות צלזיוס עד שהם מקבלים מודע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניתוח חושפים את הכליות לבצע את השתלת thymuses. ראשית לשפשף את העור עם ChloraPrep (Carefusion Inc) ואתנול 70%. ואז, לעשות 1 ס&quot;מ לחתוך על העור החלק האחורי לרוחב הגוף של החיה, 2 מ&quot;מ לשאוג הצלעות החזה שעברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את חלל הצפק ולשלוף את הכליה של חלל זה. ביצוע חתך שטחי קטן הקפסולה כליות עם להב אזמל. בעזרת מלקחיים עם קצה דק מאוד לעשות כיס מתחת הקפסולה כליות של העכבר הנמען להוסיף עד 4 האונות הרתי לתוך כיס זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את b כליה<html> ACK למקומה, תפר את חלל הצפק עם אחד או שני תפרים, ולאחר מכן לסגור את העור עכבר בשיטת תפר אותו. לחלופין, התפרים ניתן לעשות זאת באמצעות דבק כירורגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק משכך כאבים (Butorphanol על 5 מ&quot;ג / ק&quot;ג) תת עורי מיד לאחר שסיים את הניתוח כדי למנוע כאבים בעלי חיים לשמור על בעלי החיים כרית חימום עד שהם מתחילים להתאושש מן ההרדמה. עכברים הם בכלוב בנפרד במשך 3 הימים הראשונים לאחר ההשתלה, כדי למנוע חבריהם לכלוב להסיר את התפרים. הסרת תפרים אחרי שבוע 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים עירום אין ותאי T. לכן, אתה יכול להעריך את קבלת שוחד התימוס ידי ניטור אחוז CD4 + או CD8 + T תאים בדם. פעם בשבוע, 2 שבועות לאחר השתלת התימוס, לדמם את החיות ואת כתם הדם עם אנטי CD4 ו - CD8 אנטי נוגדנים חד שבטיים (מבז). כאשר CD4: CD8 היחס הוא בערך 2:01, התימוס המושתל היא מתפקדת במלואה (איור 1). </li></ol>&quot;&gt; 2. תמונה Intravital רכישה הכינו את כל החומרים תצטרך מראש ולשים אותם בצד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים חיות עם ketamin / xylazine (במינונים אותו תיאר פריט 1.5) ומניחים אותם על גבי כרית חימום על 37 ° C. להזריק 100 μl של Rhodamine isothiocyanate B-dextran (20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​PBS) לווריד כדי לאפשר ראיה עתידית של זרימת הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הכליה שמכיל את התימוס המושתל לפי הפרוטוקול שתואר לעיל ב 1.6 פריט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע את הכליה לשוב למקומו המקורי, סגור את הצדדים לרוחב החתך בעור עם תפרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח פיסת צמר גפן ספוג PBS על החלק העליון של האיבר כדי לשמור אותו לח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכניסים את כרית החימום על גבי הבמה החיה מחזיק (איור 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את חיה על גבי כרית חימום בעל חיים, עד איבר (תרשים 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קורט האיבר בבית הצדדים עם מלחציים מ &#39;ade של רדיד אלומיניום דק (איור 2C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את מחזיק בעלי חיים במקום בדיקה החימום העליון קרוב ככל האפשר לרקמות שלכם (איור 2 ד). זו בדיקה מחמם כל הזמן מודד את הטמפרטורה איבר ושולח את המידע הזה מחמם כדי להתאים את הזרם החשמלי, שמירה על אותה ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBS כותנה ספוג ולהוסיף נמוכה ההיתוך agarose (2% ב PBS) בשעה 30 ° C על גבי הכנה שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את כל ההכנה עם דוד העליון (2E איור). בשנת הצמצם על תנור זה יש לבודד את coverglass agarose מן המטרה (תרשים 2F). צג ההרדמה העכבר להזריק דחיפה חצי מנה כל 40 דקות. לאחר רכישת התמונה, להרדימו עם CO 2. </li></ol> הערה: התמונות של קליפ רדיד האלומיניום ואת החימום העליון מוצגים באיור 3. 3. שני פוטונים הדמיה רכישה השתמשנו זקופה &quot;Prairie Ultima XY&quot; שני הפוטונים מיקרוסקופ. המערכת שלנו מצוידת טי: ספיר לייזר, ארבעה PMTs העליון עד 4 רכישות סימולטני ערוץ 20x טבילה במים אובייקטיבי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את טי: ספיר לייזר ומערכת מיקרוסקופ כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת מראות dichroic וקובע לסנן על פי אורכי הגל הרצוי. במקרה שלנו השתמשנו בעל Olympus-BX2 Chroma המכיל מראה 565 ננומטר dichroic, אחד ננומטר 525/50 המסנן (עבור אות Foxp3-GFP), ואחד ננומטר לסנן 595/50 (עבור אות dextran-Rhodamine-B בתוך כלי הדם ). טווח אורכי גל הלייזר היה בשימוש בין 880-900 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את בעל החי המיקרוסקופ, לחבר ולהדליק את כל התנורים, להוסיף מים על הצמצם החימום העליון, התחתון את היעד בקפידה לתוך המים, ולהתמקד כלי או GFP-Tregs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם X מיקרוסקופ, y, z בקרה חיצונית, סקר במהירות את הרקמה לאתר האזור<html> של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הרווח על PMTs כדי לייעל את הפרדת צבעים ולהקטין את כמות לייזר הנדרש כדי להשיג אות מספיק על הרקע. נסה להשתמש בכמות מינימלית של לייזר כדי למנוע צילום של הנזק לרקמות שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר באזור האינטרסים ממוקם, להתחיל זמן לשגות הדמיה. במקרה שלנו, 5D טיפוסי (x, y, z, t, וצבע) פרוטוקול הרכישה מורכבת של רכישת תמונות רציפים של נפח מיקרומטר עומק 50 רקמות, מחולק 4.0 מיקרומטר Z-צעדים, x ו-y באורך של 140 מיקרומטר כל אחד מהם. כל כרך לוקח בערך 30 שניות להירכש. לכן, 60 רכישות יבצע סביב 30 דקות הרכישה של התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הנתונים אל השרת מוסדיים להשתמש ImageJ, Imaris, או תוכנה Volocity לבצע רב מימדי עיבוד ומעקב אחר תא. </li></ol> 4. נציג תוצאות <html> g1.jpg &quot;/&gt; באיור 1. . עובריים קבלה התימוס ותפקוד לאחר BM להתאושש, thymuses עובריים הושתלו לחיות מחדש BM, שבועיים לאחר השתלת התימוס, עכברים אלה היו דימם פעם בשבוע כדי לפקח על אחוזי תת תא T על ידי מכתים עם אנטי CD4 או אנטי CD8 מבז. שקלנו התימוס התקבלה בהצלחה בחיות עם CD4: CD8 יחס סביב 1.5-2.0:1 (A). כדי לאשר את הפונקציונליות שלו, הקרבנו כמה התימוס-המושתלים בחיות לעומת אחוז subpopulations thymocyte שונים עם עכברים WT (B). אחוזי פעמיים שלילי (DN; CD4 - CD8 - thymocytes) subpopulations (על ידי מכתים עם אנטי CD25 אנטי CD44 מבז), פעמיים חיובי (DP; CD4 + CD8 + thymocytes) ו יחיד חיובי (SP) CD4 + או CD8 + thymocytes היו דומים בין בעלי החיים האלה. ig2.jpg &quot;/&gt; באיור 2. בעל הרכבה בעלי חיים. בהרדמה לאחר עמוק, החיה הוא הניח על גבי כרית חימום, רכוב קודם על גבי הבמה בעל חיים (א). כליות המכיל את בלוטת התימוס המושתל הוא פונה כלפי מעלה (B). מהדק נייר אלומיניום צובט בעדינות את הכליה כולה (ג) כדי לשמור אותו במקום. איור. 1C להכניס מראה בפירוט את מהדק. החלק העליון של בעל חיים היא לשים במקום (ד &#39;). כותנה PBS ספוג מוסר מהחלק העליון של האיבר, הוחלף על ידי חם נמוך ההיתוך agarose, ואת החימום העליון מתווסף (E). לבסוף, הרכבה כולו מועבר המיקרוסקופ, כאן מיוצג על ידי המטרה (F). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3504/3504fig3.jpg" /> באיור 3. פרטי בעל חלקים. אלה תמונות להראות את רדיד אלומיניום מהדק (א) מחזיק את הכליה (B). שים לב גם את האזור שבו ממוקם התימוס המושתל. זה בערך מציין את האזורלחתוך את קפסולת התימוס ולעשות את כיס לשים את התימוס עובריים. Coverglass דוד העליון (C) היה קבוע עם דבק סיליקון בחלקו התחתון (ד &#39;). סרט 1. הדמיה Intravital של Foxp3-GFP + thymocytes בתוך התימוס שבו רמות פיזיולוגיות של חמצון וטמפרטורה (37 ° C) הוחזקו במשך כל התהליך. שים את זרימת הדם ואת תנועת Tregs. מהירויות אלו ניתן למדוד בהשוואה לנתונים שפורסמו. <a href="/files/ftp_upload/3504/3504movie1.avi">לחץ כאן כדי להציג את הסרט.</a> סרט 2. Intravital הדמיה של Tregs בתוך התימוס שם את התמונות נרכשו על 30 ° C. הערה היעדר התנועה ואת הצורה העגולה של התאים למרות לשמירה על זרימת הדם. <a href="/files/ftp_upload/3504/3504movie2.avi">לחץ כאן כדי להציג את הסרט.</a>

<ol>
	<li>Bettelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+developmental+pathways+for+the+generation+of+pathogenic+effector+TH17+and+regulatory+T+cells.">Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells.</a> Nature. 441, 235-238 (2006).</li><li>Ramsdell, F., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C., Takahama, Y., Coligan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+T+cell+development:+fetal+thymus+organ+culture+and+OP9-DL1+cell+coculture.">In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture.</a> Current protocols in immunology. , (2006).</li><li>Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+inhibit+stable+contacts+between+CD4++T+cells+and+dendritic+cells+in+vivo.">Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo.</a> J. Exp. Med. 203, 505-511 (2006).</li><li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li><li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+single+cell+dynamics+of+CD4++T+cell+activation+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes.">Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes.</a> J. Exp. Med. 200, 847-856 (2004).</li><li>Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+T+cell-dendritic+cell+interactions+precede+the+development+of+both+tolerance+and+immunity+in+vivo.">Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo.</a> Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).</li><li>Hugues, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+T+cell+dynamics+in+lymph+nodes+during+the+induction+of+tolerance+and+immunity.">Distinct T cell dynamics in lymph nodes during the induction of tolerance and immunity.</a> 5, 1235-1242 (2004).</li><li>Tang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+regulatory+T+cell+control+of+autoimmune+responses+in+nonobese+diabetic+mice.">Visualizing regulatory T cell control of autoimmune responses in nonobese diabetic mice.</a> Nat. Immunol. 7, 83-92 (2006).</li><li>Le Borgne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla.">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature immunology. 10, 823-830 (2009).</li><li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy.">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvascular research. 5, 384-394 (1973).</li><li>Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+Imaging+of+Leukocyte+Homing+and+Migration+in+vivo.">Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo.</a> J. Vis. Exp. (46), e2062-e2062 (2010).</li><li>Barretto, R. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy.">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17, 223-228 (2011).</li></ol>

אין לנו שום דבר לגלות.

במאמר זה הראינו את ההליכים עבור הדמיה של שני הפוטונים thymocytes בתוך החי. אנחנו גם תיאר כמה פרמטרים שצריך לשלוט היטב, כגון המשך זרימת הדם ושמירה על טמפרטורה איבר במהלך ההליכים הדמיה. עם זאת, למרות מאמצי זהיר כדי לשמור על איבר יציב, ההצעה artifacts כגון &quot;האיבר נסחף&quot; יכול להתרחש. תיקון תמונה Posterior יכול להתבצע על ידי פיתוח אלגוריתמים שתוכננו במיוחד למטרה זו. ניתוח התמונה בהמשך יכול להיות גם מקור פיתוח פרוטוקולים חדשים המבקשת למזער טעויות. התימוס הוא האיבר שבו כל ותאי T מיוצרים, ולכן הוא האיבר שבו אימונולוגים מעוניינים להבין את הדור של γδ, CD4 או CD8 ותאי T ימקדו את תשומת הלב שלהם. רוב המחקרים הנוגעים בתאי T מבוססים על הבדלים במספרים ו / או יציבות של אלה גאמות אחרי שונים במבחנה / ב המניפולציות vivo. עם זאת, רק לאחר להדמיה vivo ב יכולנו לראות את האינטראקציה בין תאים של המערכת החיסונית מעורב בשמירה על הומאוסטזיס 3-7. לכן, בהתבוננות vivo של thymocytes הוא כנראה אחד המידע החסר החשוב ביותר כדי להבין טוב יותר בביולוגיה של התא טי. Intravital TPM מספק תמונה מפורטת של התנועות והאינטראקציות תא T ואנחנו להדגים כאן כיצד ניתן להשתמש בו ללימודים thymocyte מפורט. עם זאת, כל טכניקה יש מגבלות. בעוד intravital הרכישה היא מערכת הדמיה מדויקת ביותר המשקף התנהגות תאים בתוך הגוף, זה גם נכון, כי רכישת תמונה explanted האיברים הוא מייגע פחות נעשה שימוש כדי לאסוף מידע חשוב על המערכת החיסונית 8,9. יתר על כן, אחד לא יכול להכחיש שיטות הדמיה intravital דורשים ניתוח לחשוף רקמות וכלי דם אצל בעלי חיים מרדים,אשר כשלעצמה יכולה לגרום שינוי באיבר כולו הפיזיולוגיה 10. עם זאת, ישנם הלא פולשני שיטות לבטל את החפצים הנגרמת על ידי ההליך הכירורגי 11 ושיטות חדשות מפותחים כי עדיף להכין מראש את בעלי החיים כדי לשמש 12. לפיכך, פעולות כירורגיות חדשים אגרה יהיה למזער או לעקוף מגבלות בפועל של רכישת הדמיה intravital ולהיות יותר ויותר נגיש הקהילה המדעית. אנחנו הוכיחו כי השיטה שתיארנו אינו ריאלי והוא מדווח כל המניפולציות מערכתית vivo, והתרופות כאלה, השתמשנו. לפיכך, אנו ממליצים על שימוש בשיטה זו, יחד עם טכניקות vivo לשעבר כבר זמין על מנת להשלים ולחזק מחקרים נוספים בדבר התפתחות thymocytes.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><thead><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr></thead><tbody><tr><td> Rhodamine ishothiocyanate B-dextran </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R9379 </td><td> להכין מלאי ב 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> שני הפוטונים מיקרוסקופ </td><td> בערבה טכנולוגיות בע&quot;מ </td><td> בערבה Ultima XY </td><td></td></tr><tr><td> טי: ספיר לייזר </td><td> קוהרנטית, Inc </td><td> Chameleon משפחה Ultra </td><td></td></tr><tr><td> 20x/1.00 NA אובייקטיבי טבילה </td><td> אולימפוס בע&quot;מ </td><td> XLUMPLFLN 20XW </td><td></td></tr><tr><td> מחזיק (פילטרים / dichroic) </td><td> Chroma טכנולוגיה קורפ </td><td> 91018 BX2 (U-MF2) </td><td></td></tr><tr><td> 525 nm/50 מסנן </td><td> Chroma טכנולוגיה קורפ </td><td> ET525/50m </td><td></td></tr><tr><td> 595 nm/50 מסנן </td><td> Chroma טכנולוגיה קורפ </td><td> ET595/50m </td><td&gt; </td></tr><tr><td> 565 ננומטר dichroic </td><td> Chroma טכנולוגיה קורפ </td><td> 565dcxr </td><td></td></tr><tr><td> Imaris תוכנה </td><td> Bitplane AG בע&quot;מ </td><td> Imaris </td><td></td></tr><tr><td> Volocity </td><td> PerkinElmer בע&quot;מ </td><td> Volocity </td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> NIH, ארה&quot;ב </td><td> ImageJ </td><td></td></tr></tbody></table>

intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy

שני הפוטונים מיקרוסקופית (TPM) מספק רכישת התמונה באזורים עמוק בתוך רקמות ואיברים. בשילוב עם פיתוח כלים חדשים stereotactic ניתוחים, TPM הופך טכניקה רבת עוצמה כדי לזהות &quot;נישות&quot; בתוך איברים במסמך הסלולר &quot;התנהגויות&quot; של בעלי חיים. בעוד הדמיה intravital מספק מידע דומה בצורה הטובה ביותר את התנהגות הסלולר אמיתי בתוך איבר, זה גם מייגע יותר תובענית מבחינה טכנית מבחינת ציוד / ההליכים הנדרשים מאשר אלטרנטיבה לרכישת לשעבר הדמיה vivo. לפיכך, אנו מתארים הליך כירורגי הרומן איבר &quot;stereotactic&quot; בעל המאפשרת לנו לעקוב אחר תנועות Foxp3 + תאים בתוך התימוס. Foxp3 הוא רגולטור עבור הדור של תאים T רגולטוריים (Tregs). יתר על כן, תאים אלה יכולים להיות מסווגים על פי מוצאם: כלומר. התימוס, הבדיל Tregs נקראים &quot;טבעיים המתחוללים Tregs&quot; (nTregs), כמו opposed אל שולי המרה Tregs (pTregs). למרות כמות משמעותית של מחקר דווחה בספרות לגבי הפנוטיפ ופיזיולוגיה של תאים אלה T, מעט מאוד ידוע על יחסי הגומלין שלהם vivo עם תאים אחרים. מחסור זה עשוי להיות בשל העדר של טכניקות שיאפשרו תצפיות כאלה. פרוטוקול המתואר במאמר זה מספק תרופה למצב זה. פרוטוקול שלנו מורכב באמצעות עכברים בעירום כי חוסר התימוס אנדוגני מכיוון שיש להם מוטציה דייקן ברצף ה-DNA כי הפשרות הבידול של חלק מתאי האפיתל, כולל בתאי אפיתל הרתי. עכברים עירום היו גמא מוקרן ו מחדש עם קישואים העצם (BM) מעכברים Foxp3 KI-GFP / GFP. לאחר התאוששות בע&quot;מ (6 שבועות), כל חיה קיבלה עובריים התימוס השתלת כליה בתוך הקפסולה. לאחר קבלת התימוס (6 שבועות), החיות היו מורדמים, כליות המכיל אתהתימוס המושתל נחשף, קבוע בעל איבר שלנו, וכל הזמן תחת תנאים פיסיולוגיים עבור הדמיה in vivo על ידי TPM. אנחנו משתמשים בגישה זו כדי לחקור את ההשפעה של תרופות הדור של תאים T רגולטוריים.

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy at JoVE.com

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

פיתחנו במעבדה רומן כלים ופרוטוקולים לרכישת הדמיה intravital של התימוס. הטכניקה שלנו אמור לעזור בזיהוי של &quot;נישות&quot; בתוך התימוס שבו התפתחות תא T מתרחשת.

הדמיה Intravital של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

intravital-imaging-of-the-mouse-thymus-using-2-photon-microscopy

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.9K Views.  Instituto Gulbenkian de Ciência. פיתחנו במעבדה רומן כלים ופרוטוקולים לרכישת הדמיה intravital של התימוס. הטכניקה שלנו אמור לעזור בזיהוי של "נישות" בתוך התימוס שבו התפתחות תא T מתרחשת.

Video: Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

מיקרוסקופית Intravital של הצומת לימפה מפשעתי

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an effective gas exchange must be maintained, while at the same time avoiding infection by the multiple pathogens that are inhaled 
during normal breathing. To achieve this, a superb set of defense strategies combining humoral and cellular immune mechanisms exists. One of the most 
effective measures for acute defense of the lung is the recruitment of neutrophils, which either phagocytose the inhaled pathogens or kill them by 
releasing cytotoxic chemicals. A recent addition to the arsenal of neutrophils is their explosive release of extracellular DNA-NETs by which bacteria 
or fungi can be caught or inactivated even after the NET releasing cells have died. We present here a method that allows one to directly observe neutrophils, 
migrating within a recently infected lung, phagocytosing fungal pathogens as well as visualize the extensive NETs that they have produced throughout the 
infected tissue. The method describes the preparation of thick viable lung slices 7 hours after intratracheal infection of mice with conidia of the mold 
Aspergillus fumigatus and their examination by multicolor time-lapse 2-photon microscopy. This approach allows one to directly investigate antifungal 
defense in native lung tissue and thus opens a new avenue for the detailed investigation of pulmonary immunity.

We show, how to use 2-photon microscopy for the observation of the dynamics of neutrophil granulocytes in infected lungs while they phagocytose pathogens or produce neutrophil extracellular traps (NETs).

תצפית ישירה של phagocytosis ו-NET היווצרות ידי נויטרופילים בריאות נגועים באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

מיקרוסקופית Intravital של הטחול: ניתוח כמותי של ניידות טפיל ואת זרימת הדם

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Intravital הדמיה של בלוטות לימפה popliteal עכבר

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

מיקרוסקופית Intravital הפסים תאורה נפתר מאוד של מרכזי ז&#39;רמינל

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

מיקרוסקופית Intravital הדמיה של הכבד הבא<em&gt; שושנת יריחו</em&gt; זיהום: הערכה של פרמטרים המודינמיים בדיה

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

לטווח ארוך Intravital multiphoton מיקרוסקופית הדמיה של תאים חיסוני בבריאים וחולה כבד באמצעות עכברים CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

ניתוח של<em&gt; Enterocolitica Yersinia</em&gt; מפעיל טרנסלוקציה לתאי מארח שימוש בטא לקטמאז מפעיל Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

הדמיה נויטרופילים ומונוציטים בmesenteric ורידים על ידי מיקרוסקופית Intravital על עכברים מורדמים בזמן אמת

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that enhances the phagocytic functionality of neutrophils. Although extensive studies have unveiled the existence and importance of neutrophil priming during infection and injury, means of visualizing this process in vivo have been unavailable. The protocol provided enables monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals by combining three methodologies: 1) DsRed reporter signal &#8212; used as a measure of priming 2) in vivo neutrophil labeling &#8212; achieved by injection of fluorescence-conjugated anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoclonal antibody (mAb) and 3) intravital confocal imaging. Several critical steps are involved in this protocol: oxazolone-induced mouse ear skin inflammation, appropriate sedation of animals, repeated injections of anti-Ly6G mAb, and prevention of focus drift during imaging. Although a few limitations have been observed, such as the limit of continuous imaging time (~ 8 hr) in one mouse and the leakage of fluorescein isothiocyanate-dextran from blood vessels in the inflammatory state, this protocol provides a fundamental framework for intravital imaging of primed neutrophil behavior and function, which can easily be expanded to examination of other immune cells in mouse inflammation models.

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&amp;#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

הדמיה Intravital של Priming נויטרופילים שימוש IL-1β מונחה יזם עכברים Reporter DsRed

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...