עבודה זו ממומנת על ידי המכון הקנדי לחקר בריאות, קרן קנדה עבור חדשנות, באוניברסיטה של ​​קולומביה הבריטית המרכז לחקר דם אוניברסיטת צפון לפנה&quot;ס.

1. מגיב הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאגנטים לשמש לאורך הניסוי אמור להיות מוכן לפני תחילת פרוטוקול כירורגית. שים לב כי כל הפתרונות נעשו באמצעות טכניקה סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמיסת מלח פיזיולוגית (PSS) היא המוכנה ביותר שני רכיבים: תמיסת מלח בסיסי ביקרבונט פתרון נתרן. הכן שני פתרונות בריכוז 20X ולאחסן ב 4 ° C. סודיום ביקרבונט ב 20X הוא 360.0mM NaHCO 3 (84.01g/mol) ואת תמיסת מלח בריכוז הבסיסי הוא 20X 2638.0mM NaCl (58.44g/mol), 94.0mM KCl (74.56g/mol), 40.0mM CaCl 2 • 2H 2 O (147.02g/mol), ו 23.4mM MgSO 4 • 7H 2 O (246.48g/mol). הפתרונות צריכים להיות מוכנים ב DH 2 O וכימיקלים יש להוסיף אחד בכל פעם ובחש עד פתרון ברור לפני הוספת כימיים הבא </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2L של PSS על ידי דילול כמויות שוות של סודיום ביקרבונט ו תמיסת מלח בסיסי דילול ריכוז 1X (שני לדלל 2L של PSS 100 מ&quot;ל של נתרן ביקרבונט כל תמיסת מלח בסיסי DH 2 O </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח 2L מקום בקבוק המכיל PSS ו PSS ב 37 ° C אמבט מים. לאזן את הפתרון עם 5% CO 2 / גז חנקן איזון 1 שעות לפני תחילתו של הליך כירורגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כימיקלים Vasoactive (Phenylephrine דוגמה, אצטילכולין, nitroprusside נתרן) מוכנים הטובה ביותר בריכוז 1M ב dH2O ומאוחסנים 100μl aliquots ב -20 ° C. </li></ol> 2. הכנת בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את משקל העכבר לנהל את המינון הראשוני של נתרן pentobarbital ב 90mg/kg בזריקה intraperitoneal. לאורך כל ההליך העכבר נמצא במעקב מתמיד על מטוס הרדמה דרך קמצוץ הבוהן בחינה מדוקדקת של קצב הנשימה. זריקות נוספות של נתרן pentobarbital צריכה להינתן לפי הצורך ב 20mg/kg לשמור על מטוס הרדמה. המטוס של הרדמה כירורגית מתוחזק לפי תקנות פדרליות מוסדיים כפי שתואר בפרוטוקול טיפול בבעלי חיים אושרה על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש (ACUC) מאוניברסיטת צפון לפנה&quot;ס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת שיער מאזור הבטן האגף / ירך על ידי גילוח. הסרת השיער הנותר משוחרר על ידי אלכוהול ספוגית ומלטף את האזור עם הקלטת. זה די כמו הליך זה הוא ניסיוני סופנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר על לוח כירורגית ברור בעמדה פרקדן ולצרף את העכבר ללוח ידי מקליטה כל שודד דרכים על הלוח. טמפרטורת הגוף נשמרת באמצעות מנורת חום חיצוני לפקח באמצעות מדחום רקטלי, כדי להבטיח כי היפותרמיה אינו מתרחש כתוצאה הרדמה. </li></ol> 3. הליך כירורגי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך ההליך הכירורגי כולו להבטיח רקמה חשוף נשמר תמיד superfused עם פתרון equilibrated PSS התחמם. חשוב גם לא ליצור קשר עם vasculature של עניין עם מכשירי ניתוח או לפצוע את ידי הצבת כלי להכריח אותם הרבה על ידי מניפולציה רקמת שומן ורקמת חיבור סביבם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר מתחת למשטח הביתור. ביצוע חתך קו האמצע על פני השטח הגחון של חלל הבטן לסגת העור כלפי עמוד השדרה של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העור הוא חזר בו, כך LN גלוי בקלות, להצמיד את העור על בסיס של 184 Sylgard שקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת שכבה דקה של רקמת חיבור שכיסה את האזור סביב LN </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את שכיסה רקמה שומנית ו להקיף את הלימפה עד מיטה כלי הדם חשוף. הקטע העורקי המרכזי מניח הסמוכים LN והוא overlayed כלל על ידי ורדיד. הניתוח כולו נמשך 30 דקות בקירוב. </li></ol> 4. הדמיה וניתוח כלי השיט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קטע של כלי הריבית חשוף מתחת למשטח הביתור, מאובטח על הכנת המיקרוסקופ intravital. שים לב בעלי חיים נשאר על הלוח תוך ניתוח ברור על המיקרוסקופ intravital לאורך כל תקופת הניסוי. טמפרטורת הגוף נשמרת באמצעות מנורת החום שנמדד באמצעות מדחום רקטלי כמתואר בסעיף במהלך הניתוח. המטוס הרדמה מנוטר גם במהלך הניסוי, כמתואר בסעיף 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת superfusion קווי יניקה. Superfusion של PSS מתרחשת על ידי כוח המשיכה להאכיל מן המאגר, לתוך מאגר המים מחוממים ז&#39;קט (מקטורן מים מופץ ומחומם waterbath במחזור) להיות perfused על ידי חנקן 5% CO 2 מאוזנת, לאורך קו טפטוף בשיעור של 10 מ&quot;ל / min. קו יניקה יש להשתמש כדי להמשיך למשוך PSS superfused הרחק ההכנה. שים לב לפני הניסוי קווי יניקה ז&#39;קט מים מנקים ביסודיות מאוחסן לאחר כל ניסוי. זה מבטיח סטריליות לקראת הניסוי הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הטמפרטורה של PSS superfusing. כוונו את הטמפרטורה שלבמחזור אמבט מים ו / או שיעור superfusion PSS כדי להשיג טמפרטורה של ~ 37 ° C על פני ההכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר vasculature לאזן עם PSS במשך לפחות 60 דקות לכמת את קוטר כלי שיט באמצעות קליפר וידאו. בדרך כלל, קוטר כלי צריך להיקבע בנקודות מרובות (למשל, בגיל 40, 50, ו - 60 דקות) כדי להבטיח את כלי התייצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את הבריאות של כלי השיט באמצעות אגוניסט השריר החלק ספציפיים (דוגמה Phenylephrine, PE) ו אגוניסט ספציפי האנדותל (אצטילכולין דוגמה, ACH). ריכוז של אגוניסט צריך להיות מותאם בהתאם אגוניסט, אבל עבור PE ו אח כלי יש להעריך את ריכוז כל אחד על ידי תוספת מצטברת (10-5M ל 10-9M) כדי superfusate. כל יישום אגוניסט צריכים להיות מופרדים על ידי בשלב לשטוף (בדרך כלל 30 דקות) באמצעות כלי PSS עד חוזר בקוטר מנוחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הערכה של בריאות כלי שיט, סמים vasoactive הבאים, תיוג פלורסנט, ותא התחקות ניסויים ניתן לבצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תום הניסוי בבעלי חיים ניתנת מנת יתר של נתרן pentobarbital. החיה מנוטר על מנת להבטיח כי אז אין תגובה לצבוט הבוהן חוסר תנועה בדרכי הנשימה או פעימות לב. בשלב כזה זה מלווה נקע בצוואר הרחם. </li></ol> 5. נציג תוצאות: לאחר תקופת הכנה איזון אמור להניב תמונה ברורה המאפשרת זיהוי של עורקיק והן ורדיד המספקת את הלימפה מפשעתי. לא צריך להיות בתאי השומן המקיפים את כלי מינימלי כדי לאפשר קירות עורקיק ו ורדיד להיות נצפו בבירור את מחוגה וידאו להתווסף לחישוב קוטר כלי הדם. נקודת נפרד הכנה מוצלחת היא עורקיק יש היצע עשיר של דם נע לומן, וכי יש מידה משמעותית של הטון וסקולרית (כלומר עורקיק יש את היכולת vasoconstrict ו vasodilate להחליק שרירים אגוניסטים ספציפיים אנדותל בהתאמה) . <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. תמונה מיקרוסקופית של Intravital מפשעתי הלימפה להאכיל עורקיק (חץ אדום) להאכיל את הלימפה equilibrated עם תמיסת מלח פיזיולוגית לרוץ בצד ורדיד הראשי (חץ ירוק). <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. בתגובה vasoactive רגיל עד phenylephrine superfused (PE) על ידי תוספת מצטברת של ריכוזי מלח פיזיולוגיים 10 -9 מ -5 עד 10 מ &#39; הנוכחות של vasoconstriction החזקה היא המעידים על תפקוד נורמלי שריר חלק נוכח עורקיק. <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. בתגובה vasoactive רגיל עד superfused אצטילכולין (ACH) על ידי תוספת מצטברת של ריכוזי מלח פיזיולוגיים 10 -9 מ -5 עד 10 מ &#39; הנוכחות של התרחבות חזק הוא רמיזות של ההווה נורמלי תפקוד האנדותל ב עורקיק.

<ol>
	<li>Bearden, S. E., Payne, G. W., Chisty, A., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arteriolar+network+architecture+and+vasomotor+function+with+ageing+in+mouse+gluteus+maximus+muscle.">Arteriolar network architecture and vasomotor function with ageing in mouse gluteus maximus muscle.</a> J Physiol. 561, 535-545 (2004).</li><li>Looft-Wilson, R. C., Payne, G. W., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+expression+and+conducted+vasodilation+along+arteriolar+endothelium+in+mouse+skeletal+muscle.">Connexin expression and conducted vasodilation along arteriolar endothelium in mouse skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 97, 1152-1158 (2004).</li><li>Payne, G. W., Madri, J. A., Sessa, W. C., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histamine+inhibits+conducted+vasodilation+through+endothelium-derived+NO+production+in+arterioles+of+mouse+skeletal+muscle.">Histamine inhibits conducted vasodilation through endothelium-derived NO production in arterioles of mouse skeletal muscle.</a> Faseb J. 18, 280-286 (2004).</li><li>Smeda, J. S., Payne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+autoregulatory+and+myogenic+function+in+the+cerebrovasculature+of+Dahl+salt-sensitive+rats.">Alterations in autoregulatory and myogenic function in the cerebrovasculature of Dahl salt-sensitive rats.</a> Stroke. 34, 1484-1490 (2003).</li><li>de With, M. C., de Vries, A. M., Kroese, A. B., van der Heijden, E. P., Bleys, R. L., Segal, S. S., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+anatomy+of+the+hamster+retractor+muscle+with+regard+to+its+microvascular+transfer.">Vascular anatomy of the hamster retractor muscle with regard to its microvascular transfer.</a> Eur Surg Res. 42, 97-105 (2009).</li><li>Domeier, T. L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electromechanical+and+pharmacomechanical+signalling+pathways+for+conducted+vasodilatation+along+endothelium+of+hamster+feed+arteries.">Electromechanical and pharmacomechanical signalling pathways for conducted vasodilatation along endothelium of hamster feed arteries.</a> J Physiol. 579, 175-186 (2007).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מיקרוסקופיה Intravital של הצומת לימפה מפשעתי המובא כאן מספק את היכולת microvasculature תמונה של הצומת לימפה ב-vivo. לכן, זה מקל על אמצעי תצפית ישירה בזמן אמת. הדמיה של microvasculature LN הוא אתר ייחודי המאפשר אחד כדי ללמוד את הממשק בין התגובה החיסונית ועל כלי הדם. באמצעות הכנה זו, ניתן להתמקד כוון במיוחד התגובה החיסונית, שינויים בכלי הדם, או על אינטראקציה בין השניים. כמו עם כל הגישות ניסיוני, מיקרוסקופיה intravital תקן יש גם יתרונות ומגבלות. תקן IVM, כגון הכנת המתואר כאן, יכול בקלות להיות שונה, ואת כבר הוכיח בעבר על ידי המחברים, כדי לאפשר מיקרוסקופיה epifluorescent באמצעות הקדמה של צבעי ניאון נותב או אוכלוסיות תאים הנקרא. למרות IVM רגיל לא נותן את האפשרות של הדמיה תלת מימדי ו התחקות כגון תינתן על ידי מיקרוסקופ שני הפוטונים או אנגיוגרפיה, מעקב תא מושגת עדיין בשני ממדים המאפשר התא אל התא אל התא vasculature אינטראקציה להיות צפו לכמת ובשיתוף עם הממשל ב-vivo ו מכתים הבאים עם נוגדנים ניאון ניתן להשתמש כדי לתת נתונים על ביטוי החלבון / סמן בזמן אמת. יש לציין, טכניקות חלופיות הדמיה דורשים סביבה סטטית עבור תמונות, לחיצה על אזור הניתוח או תוספת של coverslip על הכנת שטוח יש צורך לעיתים קרובות. זה מגביל, אם לא מבטל, את היכולת פעיל perfuse מתווכים וסקולרית או אחר על הכנת להעריך שלמות כלי הדם ופיזיולוגיה וכו &#39;, או שימוש בטכניקות אחרות, כגון התרחבות ניסויים שנערכו במסגרת הכנת IVM. יתר על כן, תקן IVM אינה דורשת הכנה שטוח לחלוטין, אינו מושפע תנועה, כמו זה שנוצר על ידי הנשימה של החיה. תקן זה מאפשר IVM לשמש באזורים כירורגית יותר עם reproducibility יותר. זה בא לידי ביטוי על ידי הכנה צומת מפשעתי הלימפה המתוארת כאן. בהתחשב בגודל ובצורה של הצומת לימפה, הכנת לא ניתן שטוח מבלי לפצוע את הרקמות ואת המיקום של הצומת מעורר תנועה משמעותית עקב הנשימה של בעלי חיים. סוגיות אלה יהיה קשה להתגבר בשיטות אחרות, אבל הם עסקו בקלות באמצעות הכנה IVM תקן תיאר. לסיכום, הכנת שפורטו לעיל ניתן לשלב עם כל מספר של אחרים ביוכימיים, כלי הדם, ו / או טכניקות החיסונית כגון העברה של תת קבוצות של מופעל או התאים שכותרתו, אינדוקציה של היפוקסיה, ושוב הביטוי של דלדול של מתווכים וסקולרית. עם זאת, יישומים נוספים תלויים בריאות הכנה הראשונית. לכן, חיוני תמיד לבדוק את בריאותם של vasculature עתה צילמו ומוערכת. נקודות המפתח להשגת הכנה הבריאות הבטחת הכנה היא perfused הזמן בטמפרטורת הגוף עם PSS equilibrated ומזעור מגע ומתח דגש על אזור הניתוח במהלך הניתוח.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th></tr><tr><td> סודיום ביקרבונט </td><td> סיגמא אולדריץ </td></tr><tr><td> נתרן כלוריד </td><td> סיגמא אולדריץ </td></tr><tr><td> אשלגן כלוריד </td><td> סיגמא אולדריץ </td></tr><tr><td> סידן כלוריד Dihydrate </td><td> סיגמא אולדריץ </td></tr><tr><td> נתרן Nitroprusside </td><td> סיגמא אולדריץ </td></tr><tr><td> Phenylephrine </td><td> סיגמא אולדריץ </td></tr><tr><td> אצטילכולין </td><td> סיגמא אולדריץ </td></tr><tr><td> מגנזיום כלוריד heptahydrate </td><td> סיגמא אולדריץ </td></tr><tr><td> Pentobarbitol נתרן </td><td></td></tr></tbody></table>

intravital microscopy of the inguinal lymph node

בלוטות הלימפה (של LN), הנמצא בכל הגוף, הם מרכיב בלתי נפרד של מערכת החיסון. הם משמשים כאתר לזירוז של תגובה חיסונית אדפטיבית, ולכן, את התפתחותם של תאים מפעיל. ככזה, LNs הם המפתח הלחימה פתוגנים הפולשים ושמירה על הבריאות. הבחירה של LN ללמוד מוכתב על ידי נגישות המודל הרצוי; הלימפה מפשעתי ממוקם היטב ובקלות תומך במחקרים של מודלים רלוונטיים ביולוגית של העור וזיהומים הרירית באיבר המין. LN מפשעתי, כמו LNs כל, יש רשת ענפה כלי הדם המספקים לו את הדם. באופן כללי, זו רשת כלי הדם כוללת את עורקיק להאכיל העיקרי של LN כי לאחר מכן סניפים הזנות venules אנדותל גבוהה (HEVs). HEVs מתמחים עבור קידום הסחר של תאים חיסוניים לתוך LN במהלך הומאוסטזיס והן זיהום. איך HEVs להסדיר סחר לתוך LN תחת שניהם בנסיבות אלה הוא אזור של חיפושים אינטנסיביים. להאכיל LN עורקיק, יש השפעה ישירה על הזרם HEVs והוא האספקה ​​העיקרי של חומרים מזינים בדם עשיר התא לתוך LN. יתר על כן, שינויים עורקיק ההזנה מעורבים בקידום אינדוקציה של תגובה חיסונית אדפטיבית. Microvasculature LN יש חשיבות ברור בשמירה על אספקת הדם האופטימלי LN ועל ויסות זרם לתוך תא החיסון LN, אשר הם מרכיבים חיוניים לתפקוד תקין LN התגובה החיסונית לאחר מכן. היכולת ללמוד את microvasculature LN in vivo היא המפתח הבהרת איך את המערכת החיסונית ואת microvasculature אינטראקציה ומשפיעים זה על זה בתוך LN. כאן, אנו מציגים שיטה בתחום ההדמיה vivo של הצומת לימפה מפשעתי. אנו מתמקדים הדמיה של microvasculature של LN, תשומת לב מיוחדת שיטות להבטיח את המחקר של כלי בריא, היכולת לשמור על דימות של כלי קיימא במשך מספר שעות, וכימות של גודל כלי הדם. שיטות זלוף של microvasculature עם תרופות vasoactive כמו גם את הפוטנציאל לאתר ולכמת תנועה הסלולר מוצגים גם. מיקרוסקופיה Intravital של LN מפשעתי מאפשר הערכה ישירה של כלי הדם פונקציונליות בזמן אמת ממשק של ממשק ישיר בין תאים חיסוניים, LN, ואת microcirculation. טכניקה זו פוטנציאל להיות בשילוב עם טכניקות החיסונית רבים וסימון התא ניאון כמו גם מניפולציות כמו ללמוד vasculature של LNs אחרים.

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node at JoVE.com

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

הטכניקה לביצוע מיקרוסקופיה intravital של הצומת לימפה מפשעתי (LN) הוא התווה. טכניקה כזו מאפשרת בזמן אמת,<em&gt; In vivo</em&gt; מחקר microvasculature הלימפה צומת ומבנה הן במהלך הומאוסטזיס וזיהום. טכניקה זו ניתן להתאים מחקרים סחר סלולריים לאתרים אחרים הצומת לימפה.

מיקרוסקופית Intravital של הצומת לימפה מפשעתי

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

intravital-microscopy-of-the-inguinal-lymph-node

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.0K Views.  University of Northern British Columbia. הטכניקה לביצוע מיקרוסקופיה intravital של הצומת לימפה מפשעתי (LN) הוא התווה. טכניקה כזו מאפשרת בזמן אמת, In vivo מחקר microvasculature הלימפה צומת ומבנה הן במהלך הומאוסטזיס וזיהום. טכניקה זו ניתן להתאים מחקרים סחר סלולריים לאתרים אחרים הצומת לימפה.

Video: Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

Ex vivo הדמיה של תאים T ב Slices צומת Murine לימפה עם widefield ו מיקרוסקופים confocal

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

צומת Murine שטחית לימפה ניתוח

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

הדמיה Intravital של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

מיקרוסקופית Intravital של הטחול: ניתוח כמותי של ניידות טפיל ואת זרימת הדם

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Intravital הדמיה של בלוטות לימפה popliteal עכבר

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

מיקרוסקופית Intravital הפסים תאורה נפתר מאוד של מרכזי ז&#39;רמינל

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

בידוד של תאי Murine לימפה צומת סטרומה

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

מיקרוסקופית Intravital הדמיה של הכבד הבא<em&gt; שושנת יריחו</em&gt; זיהום: הערכה של פרמטרים המודינמיים בדיה

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and E. coli, and are useful for the study of pathogenesis and/or spread of the bacteria in natural hosts. With the key function of lymph nodes in the host immune response, lymph node tissues serve as a potential source of RNA for downstream transcriptomic analyses, in order to assess the temporal changes in gene expression in cells over the course of an infection. This article presents an overview of the process of lymph node collection, tissue sampling, and downstream RNA processing in livestock, using cattle (Bos taurus) as a model, with additional examples provided from the American bison (Bison bison). The protocol includes information about the location, identification, and removal of lymph nodes from multiple key sites in the body. Additionally, a biopsy sampling methodology is presented that allows for a consistency of sampling across multiple animals. Several considerations for sample preservation are discussed, including the generation of RNA suitable for downstream methodologies like RNA-sequencing and RT-PCR. Due to the long delays inherent in large animal vs. mouse time course studies, representative results from bison and bovine lymph node tissues are presented to describe the time course of the degradation in this tissue type, in the context of a review of previous methodological work on RNA degradation in other tissues. Overall, this protocol will be useful to both veterinary researchers beginning transcriptome projects on large animal samples and to molecular biologists interested in learning techniques for in vivo tissue sampling and in vitro processing.

This protocol provides an overview of procedures for the isolation of RNA for the transcriptomic profiling of lymph node tissues from large animals, including steps in the identification and excision of lymph nodes from livestock and wildlife, sampling approaches to provide consistency across multiple animals, and considerations plus representative results for the post-collection preservation and processing for RNA analysis.

איסוף ועיבוד של בלוטות הלימפה של חיות גדולות לניתוח RNA: הכנת ללימודי Transcriptomic הלימפה של מיני בעלי חיים גדולים

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...