This work was funded by the National Institute of Mental Health (1R15MH084209 - 01A1), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R21NS058375-01A2) and the National Science Foundation (DBI0723080 07070646).

<ol>
	<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li><li>Schutze, K., Lahr, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+expressed+genes+by+laser-mediated+manipulation+of+single+cells.">Identification of expressed genes by laser-mediated manipulation of single cells.</a> Nature biotechnology. 16, 737-742 (1998).</li><li>Schutze, K., Posl, H., Lahr, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+micromanipulation+systems+as+universal+tools+in+cellular+and+molecular+biology+and+in+medicine.">Laser micromanipulation systems as universal tools in cellular and molecular biology and in medicine.</a> Cellular and Molecular Biology. 44, 735-746 (1998).</li><li>Vandewoestyne, M., Van Nieuwerburgh, F., Van Hoofstat, D., Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+three+DNA+extraction+protocols+for+forensic+STR+typing+after+laser+capture+microdissection.">Evaluation of three DNA extraction protocols for forensic STR typing after laser capture microdissection.</a> Forensic Science International Genetics. 6, 258-262 (2012).</li><li>Eells, J. B., Wilcots, J., Sisk, S., Guo-Ross, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NR4A+gene+expression+is+dynamically+regulated+in+the+ventral+tegmental+area+dopamine+neurons+and+is+related+to+expression+of+dopamine+neurotransmission+genes.">NR4A gene expression is dynamically regulated in the ventral tegmental area dopamine neurons and is related to expression of dopamine neurotransmission genes.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 46, 545-553 (2012).</li><li>Seelan, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+analysis+of+laser+capture+microdissected+fetal+epithelia.">Epigenetic analysis of laser capture microdissected fetal epithelia.</a> Analytical Biochemistry. 442, 68-74 (2013).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-126+contributes+to+Parkinson's+disease+by+dysregulating+the+insulin-like+growth+factor/phosphoinositide+3-kinase+signaling.">miR-126 contributes to Parkinson's disease by dysregulating the insulin-like growth factor/phosphoinositide 3-kinase signaling.</a> Neurobiology of Aging. 35, 1712-1721 (2014).</li><li>Bohm, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+antidepressant+treatment+on+gene+expression+profile+in+mouse+brain:+cell+type-specific+transcription+profiling+using+laser+microdissection+and+microarray+analysis.">Effects of antidepressant treatment on gene expression profile in mouse brain: cell type-specific transcription profiling using laser microdissection and microarray analysis.</a> Journal of Neurochemistry. 97, 44-49 (2006).</li><li>Kadkhodaei, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+Nurr1+maintains+fiber+integrity+and+nuclear-encoded+mitochondrial+gene+expression+in+dopamine+neurons.">Transcription factor Nurr1 maintains fiber integrity and nuclear-encoded mitochondrial gene expression in dopamine neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2360-2365 (2013).</li><li>Miller, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Proteomics+in+Laser+Capture+Microdissected+Sleep+Nuclei+From+Rat+Brain.">Quantitative Proteomics in Laser Capture Microdissected Sleep Nuclei From Rat Brain.</a> Journal of Neurogenetics. , (2014).</li><li>Roberts, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+laser+capture+microdissection+and+protein+microarray+technologies+in+the+molecular+analysis+of+airway+injury+following+pollution+particle+exposure.">Application of laser capture microdissection and protein microarray technologies in the molecular analysis of airway injury following pollution particle exposure.</a> Journal of Toxicology and Environmental Health. A. 67, 851-861 (2004).</li><li>Yuferov, V., Nielsen, D., Butelman, E., Kreek, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+studies+of+psychostimulant-induced+changes+in+gene+expression.">Microarray studies of psychostimulant-induced changes in gene expression.</a> Addiction Biology. 10, 101-118 (2005).</li><li>Brown, A. L., Smith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+RNA+preservation+for+immunolabeling+and+laser+microdissection.">Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection.</a> RNA. 15, 2364-2374 (2009).</li><li>Curran, S., McKay, J. A., McLeod, H. L., Murray, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microscopy.">Laser capture microscopy.</a> Molecular Pathology. 53, 64-68 (2000).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

LCM הוא טכניקה רבת עוצמה לנתיחה של אוכלוסיות של תאים או אזורים של רקמה מסעיפי רקמות בדידות בשקופית מיקרוסקופ והבידוד הבא של RNA, מייקרו-רנ&quot;א, DNA וחלבונים. השימוש בLCM בשילוב עם ניתוח תוך שימוש בטכנולוגיות תפוקה גבוהה כגון microarray, רצף RNA דור הבא, ניתוח אפיגנטיים של DNA ופרוטאומיקה הופך יותר ויותר נפוץ כמו הרגישות של טכניקות אלה משפר את כמות חומר המוצא צורך מופחתת 8-12. עם LCM, רזולוציה אנטומיים טוב יותר מושגת למדגם, וההבנה מצעדים במורד הזרם של דגימות אלה היא מאוד משופרת. אזהרה אחת עם LCM היא שהיא מספקת מדגם מרוכז של התאים של עניין, אך לא בהכרח אוכלוסייה טהורה של תאים. גבולות הדיוק אומר שיהיה כמה זיהום מרקמות סמוכות. עם זאת, טכניקה זו עושה להתרכז התאים של ענייןכדי למזער את השפעות הקשורות לרקמות ותאים ולמקסם את ההשפעות הניסיוניות בתאים של עניין. ישיר מול אימונוהיסטוכימיה העקיפה מאז LCM מנוצל כיום בעיקר לבידוד והמדידה של RNA, RNA שמירת שלמותה הוא קריטריון חשוב מאוד. שמירה על שלמות RNA היא הרציונל העיקרי מאחורי השימוש באימונוהיסטוכימיה עקיפה כדי להדריך את נתיחת רקמות אשר מסירה את הצורך להכתים את הרקמה ישירות שיכול לבזות את RNA (איור 10). כאשר השאלה הניסיונית, לעומת זאת, דורשת בידוד של אוכלוסייה ספציפית של תאים, כגון תאי עצב דופמין, נדרש אימונוהיסטוכימיה ניאון ישירה. באמצעות פרוטוקול תיוג אימונוהיסטוכימיה מהיר יכול למזער את ההשפלה של RNA במהלך ההליך. הפעמים דגירה קצרות נובעות מהשימוש בריכוזים גבוהים של אנטי ראשוניים ומשנייםגופים, ריכוזים שסביב 10-20 לקפל גבוהים יותר ממה הוא הכרחי עבור אימונוהיסטוכימיה קונבנציונלית עם דגירה 2 שעות. אם לעומת זאת, פעמים דגירה ארוכות יותר נדרשות, בראון וסמית משמשים מאגרי מלח גבוהים לעכב השפלה RNA ולקבל RNA באיכות טובה עם זמנים ארוכים דגירה (עד 20 שעות) 13. גם גישה זו יכולה לשמש אם יש זמן ניכר הנדרש בין התיוג של הרקמה וגישה להגיע למערכת LCM. בחירה של שקופיות - קרום PEN, Silane-הכנה ושקופיות זכוכית ללא ציפוי השימוש בשקופיות זכוכית ללא ציפוי לLCM דווחו 14. במעבדה שלנו, מגלשות Silane-prep כבר מצאו להיות בחירה אופטימלית, כציפוי זה מספיק מצרף את הרקמה לשקופית אימונוהיסטוכימיה ללא אובדן של רקמה אך עדיין מאפשר לצירופה של הרקמה לכובעי LCM והסרת מהשקופית . יש לי שקופיות זכוכית ללא ציפויהראה כמה אובדן רקמה עם הליך אימונוהיסטוכימיה. אם נעשה שימוש באימונוהיסטוכימיה עקיפה, לעומת זאת, שימור רקמה הופך פחות בעיה. עם התייבשות נכונה, תאים או רקמות לכידת הנחה של שקופיות Silane-הכנה לא הייתה בעיה. כל אחת מהגישות השונות לנוירונים בידוד או אזורים במוח המתואר במאמר זה יש יתרונות וחסרונות. לבידוד של נוירונים דופמין הבודדים, השימוש בשקופיות Silane-prep יש את היתרון של אופטיקה טובה יותר ופחות יקר מאשר שקופיות קרום PEN. החסרון הוא שתאים לפעמים לכידה יכולים להיות קשים אם יש התייבשות מספיקה (ראה להלן) וכמה רקמות ניתן להשאיר בשקופית. היתרון של שקופיות קרומי PEN הוא שהשימוש בשילוב של לייזר הלייזר וUV IR מבטיח כי נוירונים דופאמין ייאספו. אי-איסוף תאים משקופיות קרום PEN כמעט אף פעם לא מתרחש, כפי שהוא פחות תלוי בהתייבשות מאשר שקופיות הזכוכית.<html> יתרון נוסף הוא שליזר UV יכול לשמש כדי להתקרב לצורה של תאי העצב של עניין באופן הדוק יותר, בהשוואה למעגל עבור לכידת תאי עצב משל שקופיות זכוכית עם לייזר IR. לבידוד של אזורים של רקמה, שקופיות קרום PEN עדיפות בהרבה ולהצדיק את העלות הנוספת. גישה זו גורמת להסרת כל הרקמה לגזור על הקרום שלם, היא הרבה יותר מהר מאשר לכידת שטח גדול של רקמות באמצעות לייזר IR לבד ויכולים להיות שנאספו קטעי רקמה עבים יותר. רק באמצעות לייזר IR מחייב את קרום כובע LCM הוא נמס לגמרי על אזור הרקמה כולה. בנוסף, אוסף שלם של הרקמה אופייני ודורש בדרך כלל ניסיונות מרובים. למרות שזה לוקח יותר זמן מאשר בידוד רקמה משקופית קרום PEN, אם הרקמה זמינה כבר בשקופית זכוכית או לייזר UV אינו זמין, זה הוא אפשרות מעשית כמו רוב הרקמות ניתן לאסוף (איור 8J). &quot;&gt; צעדים קריטיים ove_content Incubations אתנול 100% הם אחד הצעדים החשובים ביותר. על מנת לאסוף תאים משקופיות Silane-הכנה נדרשת התייבשות של הרקמה שלמה. לכן, כל מים לא הוסרו, אשר מזוהה בעיקר עם הדגירה אתנול 100%, ישפיעו על היכולת להרים תאים מהשקופיות. כדי לטפל בבעיה זו, לעתים קרובות לשנות את פתרונות אתנול 100% כספיגה של מים מהאוויר או ההעברה משלבי כביסה קודמות יכול להשפיע על ההתייבשות. בנוסף, מסננות מולקולריות רגילות לספוג כל זיהום מים. מערכת LCM אידיאלית צריכה להיות ממוקמת בחדר קטן עם מסיר לחות כדי לשמור על תנאי לחות נמוכים. סעיפי cryostat טובים הם קריטיים לLCM הנכון. סעיפים צריכים להיות שטוח עם קפלים ברקמות ממוזערות. מקפל ברקמה יגדיל את המרחק בין כובע LCM ולמנוע ממנו ליצור קשר עם tהוא הרקמה. לאחר מכן הוא הופך להיות קשה כדי להמס את כובע הקרום מספיק על הרקמה. לשקופיות זכוכית, בדרך כלל עובי סעיף צריך להיות בין 6 ל 12 מיקרומטר. ניתן ללכוד קטעים עבים עם שקופיות קרום PEN. LCM מציע יכולת טכנית לעשות ניתוחים מאוד מדויקים של רקמות ותאים משקופיות מיקרוסקופ. זה מגדיל באופן דרמטי את הרזולוציה של ניתוח נוסף בהשוואה לנתיחת ברוטו של פיסות רקמה. אמנם, LCM יכול להיות זמן ועבודה אינטנסיבית, היא אינה דורשת הכשרה או מומחיות נרחבות ו, כאשר בשילוב עם טכנולוגיות תפוקה גבוהה אחרות, יכול לשפר באופן משמעותי את ההבנה של תהליך ביולוגי כאשר תאים בדידים או אזורים אנטומיים משמשים.

<html> כל הרקמה מורכבת מאוכלוסייה הטרוזיגוטיים של תאים. זה רלוונטי במיוחד לרקמת מוח, בהיקף של נוירונים שונים מובחנים מורפולוגית ו / או neurochemically מוקף סוגים שונים של תאי גליה (oligodendrocytes, מיקרוגליה והאסטרוציטים). בנוסף, אזורים שונים במוח, כגון אזורים של גרעיני קליפה או גזע המוח, יש פונקציות ספציפיות. לכן, היכולת לבודד אוכלוסיות ספציפיות של תאים או באזורים שונים מבחינה אנטומית קטנים מאוד, בשילוב עם טכניקות אנליטיות (כלומר, Q-PCR, microarrays, RNA-רצף, ופרוטאומיקה), יכול לשפר במידה ניכרת ההבנה של תהליכים ביולוגיים שונים. LCM הוא טכנולוגיה המספקת את היכולת לבודד אזורים אנטומיים מאוד דיסקרטיים או תאים ספציפיים מהרקמה בשקופית מיקרוסקופ מתן הרבה יותר הומוגנית מקור לניתוח נוסף של מולקולות שונות, כגון RNA, מייקרו-רנ&quot;א, DNA וחלבונים. t &quot;&gt; מאז LCM הוצג לראשונה, מספר גישות שונות שימשו לmicrodissect תאים מרקמות 1-3. הגישות המוקדמות כללו קובץ מצורף ישיר של רקמה בשקופית באמצעות לייזר אינפרא אדום (IR) וסרט תרמופלסטיים ואי שיטת קשר באמצעות אולטרא-סגול (UV) חיתוך לייזר לנתק תא או רקמה וגבייה לתוך צינור. בהמשך לכך, LCM שמש בהצלחה במגוון רחב של רקמות וסוגי תאים והוצג להיות תואמת עם בידוד של מולקולות שונות לניתוח במורד הזרם כולל RNA, מייקרו-רנ&quot;א, DNA, חלבונים ו, הכולל את הפעילות האנזימטית 1,4-7. הנה LCM מודגם באמצעות מערכת LCM שנעשה שימוש בליזר UV חיתוך וליזר IR לכידה לחיתוך סביב תאים או רקמות וההצמדה ל כובע LCM, בהתאמה. מערכת זו משתמשת בשני LCM הלייזר ללכוד IR כדי להמס סרט פלסטיק על כובע מעל לתא או הרקמה של עניין שמתחבר לתאים סרט הפלסטיק ומסיר אותו מtהוא רקמה עם הסרת הכובע (איור 1). בנוסף, בשילוב עם לייזר IR, לייזר UV נגיש לחתוך מן רקמה או תאים של ריבית מהרקמה רכובה על שקופיות עם קרום מבודד אז על ידי הצמדת הרקמה לכובע LCM באמצעות לייזר IR (איור 2). סקירה קצרה של טכניקות אלה נמצאת באיורים 1 ו -2. כמה וריאציות על טכניקה זו מתוארות לכל אחד בודד תאים ספציפיים באמצעות אימונוהיסטוכימיה ניאון ישירה וטכניקה מודרכת אימונוהיסטוכימיה עקיפה המשמשת לבידוד של אזור של רקמה המבוסס על הביטוי של חלבון מסוים. באופן ספציפי, הבידוד של נוירונים דופמין מnigra substantia והבידוד של אזור tegmental הגחון והבידוד הבא של RNA מרקמת המוח טרי, קפואה מוצג. כRNA הוא יציב ביותר של מולקולות נמדדות (בהשוואה ל- DNA או חלבון), רח &#39;eps כדי לעזור לשמור על שלמות RNA כלולים והנתונים המוצגים על הכמות והאיכות של RNA שהושגה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="597">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:159px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:121px;">Catalog Numer&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Veritas Laser Capture Microdissection System</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td style="width:121px;">Newer model is now sold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">CapSure Macro LCM Caps</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>LCM0211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">CapSure HS LCM Caps</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>LCM0213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">PEN Membrane slides</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>s4651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">Silane prep-slides</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>S4651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">95% Ethanol-RNase Free</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>E7148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">100% Ethanol-RNase Free</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">Rnase Free Triton</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">Molecular Sieve</td>
			<td style="width:191px;">EDM Millipore, Billerica, MA</td>
			<td>MX1583D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Anti-Tyrosine hydroxyase antibody</td>
			<td style="width:191px;">EDM Millipore, Billerica, MA</td>
			<td>Ab152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:191px;">Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Stratagene MX 3005P</td>
			<td style="width:191px;">Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td>
			<td>401513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Nanodrop 3300 fluorospectrometer</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Quant-iT RiboGreen</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">RNaseZap</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection - a demonstration of the isolation of individual dopamine neurons and the entire ventral tegmental area

microdissection ללכוד לייזר (LCM) משמש כדי לבודד אוכלוסייה מרוכזת של תאים בודדים או אזורים אנטומיים מדויקים של רקמה מסעיפי רקמות על שקופיות מיקרוסקופ. בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה, LCM יכול לשמש כדי לבודד סוגי תאים בודדים המבוססים על סמן חלבון ספציפי. כאן, טכניקת LCM מתוארת לאיסוף אוכלוסייה ספציפית של נוירונים דופמין שכותרתו ישירות עם אימונוהיסטוכימיה hydroxylase טירוזין ובידוד של נוירון דופמין המכיל אזור של אזור tegmental הגחון באמצעות אימונוהיסטוכימיה hydroxylase טירוזין העקיפה על סעיף סמוך לאלה המשמשים לLCM. לייזר ללכוד אינפרא אדום (IR) משמש לשניהם לנתח נוירונים בודדים, כמו גם את אזור tegmental הגחון את שקופיות זכוכית ועל כובע LCM לניתוח. התייבשות מוחלטת של הרקמה עם 100% אתנול וקסילן היא קריטית. השילוב של הלייזר ללכוד IR ואולטרה הסגול cutti (UV)לייזר ng משמש לבודד תאי עצב בודד או דופמין אזור tegmental הגחון בעת ​​שימוש בשקופיות קרום PEN. יש שקופית קרום PEN יתרונות משמעותיים על פני שקופיות זכוכית כפי שהוא מציע עקביות טובה יותר בלכידת ואיסוף תאים, הוא מהיר יותר איסוף חתיכות גדולות של רקמה, היא פחות סומך על התייבשות ותוצאות בהסרת הרקמה מהשקופית מלאה. למרות הסרת האזורים הגדולים של רקמה משקופיות זכוכית אינה ריאלי, זה הרבה יותר זמן רב ולעתים קרובות משאיר כמה רקמות שיורית מאחור. הנתונים שמוצגים כאן להוכיח כי ניתן להשיג RNA בכמות ובאיכות מספקות באמצעות נהלים אלה למדידות PCR כמותי. למרות RNA ו- DNA הם המולקולות הנפוצות ביותר המבודדים מרקמות ותאים שנאספו עם LCM, בידוד ומדידה של microRNA, חלבון ושינויים אפיגנטיים בDNA יכול גם ליהנות מהרזולוציה אנטומיים וסלולרית המשופרות שהושג באמצעות LCM.

<html> מיקרוסקופ איורים 6 ו 7 להדגים את יכולות בידוד של תאי עצב בודדים דופמין. הרזולוציה אנטומיים הנוכחית היא סביב 5-10 מיקרומטר כגודל הנקודה הקטן ביותר שניתן לייצר באופן עקבי על LCM כובעים לבודד תאים. המגבלה היחידה לבידודה של סוגי תאים מסוימים היא היכולת לדמיין את התאים. למרות LCM הוא מסוגל לבודד נוירונים בודדים דופמין, זיהום של חלקים של תאים ללא תווית צמודים ככל הנראה מתרחש. לכן, המדגם הסופי הוא אוסף מרוכז של נוירונים דופמין, לא אוכלוסייה טהורה של נוירונים דופמין. טכנולוגיה זו היא גם מסוגלת לבודד אזורים קטנים של רקמה כגון גרעינים או אזורים נפרדים במוח, כפי שמוצג בבידוד של אזור tegmental הגחון. פרסומים קודמים הוכיחו שימוש ברקמת המוח, כמו גם לבודד רקמה פתולוגית מהרקמה נורמלית 5,11. <html> class = &quot;jove_content&quot;&gt; מכיוון שהשימוש הנפוץ ביותר של תאים ורקמות המבודדים באמצעות LCM הוא ניתוח RNA, הנהלים שהוצגו היו מוטבים כדי לשמור על שלמות RNA. על מנת לקבוע את האיכות של RNA שנשארה הבא LCM, RNA היה מבודד, באמצעות עמודות ספין סיליקה מבוססות, מרקמות בשקופיות הבאות LCM, או לאחר הליך טירוזין המהיר hydroxylase ניאון אימונוהיסטוכימיה או הקיבעון באצטון. איכות RNA נמדדה ובהשוואה לערכים לRNA RNA מהמוח כולו זמין באופן מסחרי (איור 9). איכות RNA הופחתה בדגימות RNA מרקמות המשמשות לLCM עם יושרה נמוכה לאחר אימונוהיסטוכימיה (רין לא זמין) ואחריו קיבעון אצטון (רין 2.6) בהשוואה לRNA המוח כולו (רין 8.2) כפי שניתן לראות בירידה היחסית ב גובה שיא rRNA S28 לעומת שיא S18. עם זאת, RNA נשמר להקות 18S ו -28 וביטוי גנים יכול להימדד באמצעות Q-PCR. = &quot;Jove_content&quot;&gt; כדי למדוד את הכמות של RNA המתקבל מתאי העצב שנרכשו באמצעות LCM, נוירונים דופאמין (50, 100 ו -200 נוירונים דופאמין) היו מבודד מאזור tegmental הגחון מעל שקופיות Silane-הכנה. RNA היה מבודד באמצעות עמודות ספין סיליקה מבוססות והכמות של RNA נמדדה. בהתבסס על עקומת הסטנדרט שנוצרה, כולל של 17.3, 24.8 pg ו50.9 pg / μl היו מבודד מ-50, 100 ו -200 נוירונים דופאמין, בהתאמה (איור 10 א). כדי למדוד כמות RNA עם Q-PCR, טווח ריכוזים של RNA המוח כולו וRNA מנוירונים דופאמין תומללו הפוכים וגן β-אקטין נמדד באמצעות Q-PCR כפי שתואר בעבר 5. בהתבסס על מדידות אלה, ריכוז של 3.55, 6.82 ו20.58 pg / μl חושבו מ -50, 100 ו -200 נוירונים דופאמין, בהתאמה (איור 10 ב). כדי להמחיש עד כמה בידוד של נוירונים דופמין משווה לבידודה של כל vאזור entral tegmental עם LCM, גנים ספציפיים נוירון דופמין (Nurr1, hydroxylase טירוזין, וטרנספורטר דופאמין) נמדדו עם Q-PCR בשני אלה סוגים שונים של דגימות והשוואה לביטוי של β-אקטין (איור 11). מאחר וערכי t C הנמוך נוצרים עם ריכוז גבוה יותר של הגן של עניין, ירידה בt ΔC מציינת ביטוי מוגבר של גני נוירון דופמין ביחס לβ-אקטין. זו ממחישה כיצד הבידוד של תאי עצב בודדים דופמין מרכז את הביטוי של גנים ספציפיים נוירון דופמין. בדגימות הגחון אזור tegmental, גנים ספציפיים נוירון דופמין הם בדילול החוצה כמו תאים אחרים (נוירונים שאינם דופאמין ותאי גלייה) יהיה גם אספו המבטאים β-אקטין אבל לא מבטאים גני נוירון דופמין. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig1highres.jpg" /> <strong&gt; איור 1. לכידת לייזר באמצעות לייזר אינפרא אדום הלכידה (IR). יש כובע LCM הפלסטיק הקטן קרום בתחתית הממוקמת על גבי רקמה רכובה על גבי זכוכית (שלב 1). כאשר הרקמה או התא של עניין מזוהה, לייזר ללכוד IR הוא ירה דרך כובע LCM כדי להמס גומה קטנה בקרום על גבי רקמה / תא הבסיסי (שלב 2). כאשר כובע LCM מוסר, הרקמה היא להסיר את שקופיות מיקרוסקופ ונשארה מחובר לכובע LCM. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig2highres.jpg" /> איור 2. לכידת לייזר באמצעות לייזר אינפרא אדום (IR) לכידה ואולטרה הסגול (UV) חיתוך לייזר. על מנת לרכוש שטחים גדולים של רקמה או להקל על ההתאוששות של תאים באמצעות לייזר UV, רקמות הוא רכוב על שקופית עם קרום מחובר לשקופית לאורך הפינה מחוץ (שקופיות קרום PEN). כובע LCM מושם על tהוא רקמה והליזר ללכוד IR משמש כדי להמס את קרום הכובע ולצרף את הרקמה לכובע LCM (שלב 1 ו -2). חיתוך לייזר UV משמש אז כדי לחתוך דרך הממברנה השקופיות ורקמות (שלב 3 ו -4), כך שכאשר הכובע מוסר הרקמה היא להסיר את השקופית ונשארת על כובע LCM (שלב 5). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig3highres.jpg" /> איור 3. לכידת הלייזר Microdissection מערכת מפת דרכים. יש מערכת Microdissection זה לייזר לכידת חלל במשך 3 שקופיות בכל פעם. כאשר שקופיות נטענות לתוך מיקרוסקופ, תמונות בהגדלה נמוכה מפת דרכים עבור כל שקופית נוצרות. בחירת אזור בתמונת מפת הדרכים מעבירה את חלון תמונת חיה לאזור זה. למטרות הדגמה, mesencephalon העכבר נותח לסעיף 10 מיקרומטר על 3 שקופיות. השקופית הראשונה שכותרתו עבור immunoreactivi hydroxylase טירוזיןty באמצעות diaminobenzidine ככרומגן (). סעיפים היו רכובים על שני שקופיות Silane-prep (B) או שקופיות קרום PEN (C). שתי שקופיות אלה תויגו באמצעות אימונוהיסטוכימיה hydroxylase טירוזין הניאון המהירה. חיצים ב( C) מצביעים על הזיקה של קרום PEN לשקופית הזכוכית. אין רקמה מחוץ גבול זה יכול להיות שנאסף עם LCM. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig4highres.jpg" /> איור 4. שימוש בלייזר ללכוד IR. הלייזר ללכוד IR משמש כדי להמס את קרום כובע LCM לצרף את הרקמה לכובע LCM ולהסיר אותו משאר הרקמות. הלייזר ללכוד IR חייב להיות בכוח מספיק כדי להמס את קרום כובע LCM מספיק ליצור קשר עם שקופיות רקמות וזכוכית הבסיסיות. התמונה למעלה ממחישה כאשר הלייזר לא היה מספיק כדי להמס את הקרוםלשקופית (השאיר שתי נקודות). כאשר הקרום נמס נוגע שקופיות הזכוכית, קווי המתאר שחורים עבים ניתן לצפייה (מקום נכון). עוצמת הלייזר יכולה להיות מותאמת על ידי שינוי המתח (3-100 mW), Pulse (100-1,000,000 μsec) ו# להיטים של הלייזר. בנוסף, חזר ירי של לייזר IR באותו המקום גם יכול להמס את הקרום נוסף. המטרה של לייזר IR צריכה להיות מותאמת בכל עת כובע LCM מועבר או כאשר המטרה היא שונה. בר סולם = 100 מיקרומטר. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig5highres.jpg" /> איור 5. שימוש בUV חיתוך לייזר. חיתוך לייזר UV משמש לחיתוך דרך הממברנה PEN והרקמות. לפני השימוש בעוצמה המינימלית הדרושה כדי לחתוך את הקרום ורקמות צריכה להיות לקבוע מאז לייזר UV יכול לגרום נזק לרקמות. מעל, שלוש הנקודות (חצים) של עוצמות לייזר UV שונות מוצגות ב<html> גודל נקודה השמאלית מספיק לסעיפי 10 מיקרומטר, נקודת האמצע לחלקים עבים והמקום הנכון הוכחת עוצמת לייזר UV כי הוא גבוה מדי. סרגל = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig6highres.jpg" /> איור 6. בידוד ישיר של נוירונים immunoreactive hydroxylase טירוזין באמצעות לייזר IR. נוירונים דופמין מוצגים לאחר תיוג ניאון מהיר עבור hydroxylase טירוזין (). כאשר לייזר IR הוא ירה המסת קרום כובע LCM על הנוירונים האלה (D), הסרת הכובע מרימה תאים אלה הנחה של השקופיות (B, E). אז יכולים להיות דמיינו נוירונים אלה כפי שצורפו לכובע LCM (C, F). בר סולם = 250 מיקרומטר.= יעד &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig6large.jpg&quot; = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig7highres.jpg" /> איור 7. בידוד ישיר של נוירונים immunoreactive hydroxylase טירוזין משקופיות קרום PEN באמצעות לייזרי IR ו- UV. Hydroxylase טירוזין נוירונים שכותרתו מוצגים לעיל (א &#39;). יכולים להיות מחוברים נוירונים אלה לכובע LCM באמצעות לייזר IR ולחתוך משקופית קרום PEN באמצעות לייזר UV (B). סרגל = 250 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 8" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig8highres.jpg" /> איור 8. עקיף<html> בידוד של אזור tegmental הגחון באמצעות immunoreactivity hydroxylase טירוזין. המיקום של נוירונים דופמין באזור tegmental הגחון היה דמיין בסעיף שימוש בטכניקות אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית (A ו- E). סעיף זה אימונוהיסטוכימיה שכותרתו שימש כתבנית לאתר את אזור tegmental הגחון בסעיפים בלא כתם סמוך (B ו- F). השימוש בליזר UV, אזור tegmental הגחון היה מחובר לכובע LCM עם לייזר IR ולחתוך מהשקופית עם לייזר UV (C ו- D) ומוצג מצורף לכובע HS LCM (D). אזור tegmental הגחון מבודד משקופיות Silane-prep רק באמצעות לייזר IR מוצג גם מחובר לכובע מאקרו (FK). שים לב שיש צורך יותר מניסיון אחד כדי לאסוף ביותר של הרקמה מאזור זה (השווה G ו- J). בר סולם = 500 מיקרומטר.טען / 52,336 52336fig8large.jpg &quot;target =&quot; / _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 9" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig9highres.jpg" /> איכות איור 9. RNA. electropherograms נציג ותמונות ג&#39;ל הקשורים של RNA זמין מסחרי המוח כולו () ו- RNA מבודד מסעיפים לאחר קיבוע אצטון וLCM (B) או אימונוהיסטוכימיה המהירה ניאון hydroxylase טירוזין וLCM (C). למרות איכות RNA הופחתה בסעיפי מעובד אימונוהיסטוכימיה, בהשוואה לRNA המוח כולו, electropherograms להפגין RNA בעיקר שלם המבוסס על הנוכחות של פסגות rRNA S18 וS28. ריכוז RNA המוח כולו היה 6.487 pg / μl עם רין של 8.2. ריכוז RNA רקמה הקבוע אצטון היה 5.036 pg / μl עם רין של 2.6. הושג RNA לאחר שעות אימונוהיסטוכימיה<html> מודעת ריכוז של 4.474 pg / μl ורין לא היה זמין. <img alt="איור 10" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig10highres.jpg" /> כמות RNA איור 10.. כדי לקבוע את הכמות של RNA בתאי עצב שהושגו עם LCM, עקומת תקן של ריכוזי RNA הופקה באמצעות fluorospectrometer וQ-PCR. למדידות fluorospectrometer (), הגרף הגדול מציג את הטווח גבוה יותר של כמויות RNA והגרף הקטן מציג את הרגישות של assay זה עד 10 pg / μl. ריכוזים של RNA המתקבלים מ-50, 100 ו -200 נוירונים דופאמין היו 17.3, 24.8 ו50.9 pg / μl, בהתאמה. שימוש Q-PCR למדוד כמויות RNA (B), הריכוזים של RNA המתקבלים מ-50, 100 ו -200 נוירונים דופאמין היה 3.55, 6.82 ו20.58 pg / μl, בהתאמה. es / ftp_upload / 52,336 / 52336fig11highres.jpg &quot;/&gt; ריכוז איור 11. של גנים ספציפיים נוירון דופמין עם הבידוד של תאי עצב בודדים דופמין. ההבדל בt C (t ΔC) בין גני נוירון דופמין ספציפיים (Nurr1, hydroxylase טירוזין, וטרנספורטר דופאמין) וβ-אקטין בדגימות של תאי עצב דופמין באזור tegmental הגחון מבודד עם LCM בהשוואה לביטוי בניתוחים של אזור tegmental הגחון כל מוצגים. מאחר וערכי t C הנמוך נוצרים עם ריכוז גבוה יותר של הגן של עניין, ירידה בt ΔC מציינת ביטוי מוגבר של גני נוירון דופמין ביחס לβ-אקטין כמו תאים אחרים (נוירונים שאינם דופאמין ותאי גלייה) תהיה ייאסף בדגימות אזור tegmental הגחון המבטאות β-אקטין אבל לא מבטאים גני נוירון דופמין.

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area at JoVE.com

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

הבידוד של נוירונים דופמין הבודדים או אזור tegmental הגחון עם אימונוהיסטוכימיה ישירה או עקיפה מודגם באמצעות microdissection ללכוד לייזר. פרמטרים לבידודה של רקמה משקופיות זכוכית באמצעות לייזר אינפרא אדום ומשקופיות קרום באמצעות השילוב של לייזר אינפרא אדום ואולטרא-סגול הם דנו.

Microdissection לכידת לייזר - הפגנה של הבידוד של פרט דופמין נוירונים ופינת הגחון tegmental השלם

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

laser-capture-microdissection-demonstration-isolation-individual

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.8K Views.  Mississippi State University College of Veterinary Medicine.  הבידוד של נוירונים דופמין הבודדים או אזור tegmental הגחון עם אימונוהיסטוכימיה ישירה או עקיפה מודגם באמצעות microdissection ללכוד לייזר. פרמטרים לבידודה של רקמה משקופיות זכוכית באמצעות לייזר אינפרא אדום ומשקופיות קרום באמצעות השילוב של לייזר אינפרא ...

Video: Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

לייזר Microdissection לכידה של תסיסנית נוירונים היקפיים

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

Non-לייזר מיקרוסקופית לכידת גישה עבור Microdissection של אזורים במוח דיסקרטית עכבר עבור בידוד RNA סך סידור Downstream הדור הבא והביטוי פרופיל גנטי

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five decades of inquiry into the molecular deficiencies associated with dopamine regulation. The majority of these inquiries of dopamine regulation in the brain focus upon the molecular basis for its regulation in the terminal field regions of the nigrostriatal and mesoaccumbens pathways; striatum and nucleus accumbens. Furthermore, such studies have concentrated on analysis of dopamine tissue content with normalization to only wet tissue weight. Investigation of the proteins that regulate dopamine, such as tyrosine hydroxylase (TH) protein, TH phosphorylation, dopamine transporter (DAT), and vesicular monoamine transporter 2 (VMAT2) protein often do not include analysis of dopamine tissue content in the same sample. The ability to analyze both dopamine tissue content and its regulating proteins (including post-translational modifications) not only gives inherent power to interpreting the relationship of dopamine with the protein level and function of TH, DAT, or VMAT2, but also extends sample economy. This translates into less cost, and yet produces insights into the molecular regulation of dopamine in virtually any paradigm of the investigators' choice.
We focus the analyses in the midbrain. Although the SN and VTA are typically neglected in most studies of dopamine regulation, these nuclei are easily dissected with practice. A comprehensive readout of dopamine tissue content and TH, DAT, or VMAT2 can be conducted. There is burgeoning literature on the impact of dopamine function in the SN and VTA on behavior, and the impingements of exogenous substances or disease processes therein 1-5. Furthermore, compounds such as growth factors have a profound effect on dopamine and dopamine-regulating proteins, to a comparatively greater extent in the SN or VTA 6-8. Therefore, this methodology is presented for reference to laboratories that want to extend their inquiries on how specific treatments modulate behaviour and dopamine regulation. Here, a multi-step method is presented for the analyses of dopamine tissue content, the protein levels of TH, DAT, or VMAT2, and TH phosphorylation from the substantia nigra and VTA from rodent midbrain. The analysis of TH phosphorylation can yield significant insights into not only how TH activity is regulated, but also the signaling cascades affected in the somatodendritic nuclei in a given paradigm.
We will illustrate the dissection technique to segregate these two nuclei and the sample processing of dissected tissue that produces a profile revealing molecular mechanisms of dopamine regulation in vivo, specific for each nuclei (Figure 1).

Dopamine is distinctly regulated in the midbrain nuclei, which contain the cell bodies and dendrites of the dopamine neurons. Here we describe a dissection and sample-handling approach to maximize results, and thus conclusions and insights, on dopamine regulation in the midbrain nuclei of the substantia nigra (SN) and ventral tegmental area (VTA) in rodents.

פרופיל מקיף של הסדרת substantia nigra הדופמין ואזור Tegmental הגחון

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Microdissection לכידת ליזר אוכלוסיות מועשרות של הנוירונים או נוירונים יחידים לניתוח ביטוי גנים לאחר פגיעה מוחית טראומטית

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF) to provide an abundant supply of cells. NPCs were differentiated in the presence of a new combination of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) and retinoic acid on dishes coated with poly-L-lysine and mouse laminin to obtain neuron-rich cultures. NPCs were also differentiated in the absence of neurotrophins, DBC and retinoic acid and in the presence of ciliary neurotrophic factor (CNTF) to yield astrocyte-rich cultures. Differentiated NPCs were characterized by immunofluorescence staining for a panel of neuronal markers including NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin and GAP43. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and STAT3, astrocyte markers, were detected in 10-15% of differentiated NPCs. To facilitate cell-type specific molecular characterization, laser capture microdissection was performed to isolate neurons cultured on polyethylene naphthalate (PEN) membrane slides. The methods described in this study provide valuable tools to advance our understanding of the molecular mechanism of neurodegeneration.

Human neuroprogenitor cells (NPCs) were expanded under proliferating conditions. NPCs were differentiated into neuron-rich cultures in the presence of a combination of neurotrophins. Neuronal markers were detected by immunofluorescence staining. To isolate a pure population of neurons, NPCs were differentiated on PEN membrane slides and laser capture microdissection was performed.

Microdissection לכידת לייזר של נוירונים מהתאים מובחנים Neuroprogenitor אדם בתרבות

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or between the same cell type in health and disease or following pharmacologic treatments.&#160;In the spinal cord, such preparation from motor neurons, the target of interest in many neurologic and neurodegenerative diseases, is complicated by the fact that motor neurons represent &#60;10% of the total cell population.&#160;Laser capture microdissection (LMD) has been developed to address this problem.&#160;Here, we describe a protocol to quickly recover, freeze, and section mouse spinal cord to avoid RNA damage by endogenous and exogenous RNases, followed by staining with Azure B in 70% ethanol to identify the motor neurons while keeping endogenous RNase inhibited.&#160;LMD is then used to capture the stained neurons directly into guanidine thiocyanate lysis buffer, maintaining RNA integrity.&#160;Standard techniques are used to recover the total RNA and measure its integrity.&#160;This material can then be used for downstream analysis of the transcripts by RNA-seq and qRT-PCR.

High-quality total RNA has been prepared from cell bodies of mouse spinal cord motor neurons by laser capture microdissection after staining spinal cord sections with Azure B in 70% ethanol.&#160;Sufficient RNA (~40-60 ng) is recovered from 3,000-4,000 motor neurons to allow downstream RNA analysis by RNA-seq and qRT-PCR.

ייצור RNA לניתוח תעתיקי מגופי תאי נוירון מוטוריים של חוט השדרה של העכבר על ידי לכידת לייזר Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain in adulthood and during development. Although most in vivo approaches use a craniotomy to study brain regions located on the dorsal side, brainstem regions such as the pons, located on the ventral side remain relatively understudied. The main goal of this protocol is to facilitate access to ventral brainstem structures so that they can be studied in vivo using electrophysiological and imaging methods. This approach allows study of structural changes in long-range axons, patterns of electrical activity in single and ensembles of cells, and changes in blood brain barrier permeability in neonate animals. Although this protocol has been used mostly to study the auditory brainstem in neonate rats, it can easily be adapted for studies in other rodent species such as neonate mice, adult rodents and other brainstem regions.

A surgical method is described to expose the ventral skull in neonate rats. Using this approach it is possible to open a craniotomy to perform acute electrophysiology and two-photon microscopy experiments in the brainstem of anesthetized pups.

שיטה להרוויח Craniotomy על גולגולת הגחון של מכרסמים ילוד

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

נוירונים חוש הריח באף הושגו באמצעות ביופסיה משולבת עם Microdissection הלייזר-Capture: גישה פוטנציאלית לחקר טיפול בהפרעות נפשיות תגובה

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, interactions with our environment can induce brain plasticity. Increasingly, research is trying to identify which environments stimulate brain plasticity beneficial for treating brain and behavioral disorders. Two environmental manipulations are described which increase or decrease the number of tyrosine hydroxylase immunopositive (TH+, the rate-limiting enzyme in dopamine (DA) synthesis) neurons in the adult mouse midbrain. The first comprises pairing male and female mice together continuously for 1 week, which increases midbrain TH+ neurons by approximately 12% in males, but decreases midbrain TH+ neurons by approximately 12% in females. The second comprises housing mice continuously for 2 weeks in &#8216;enriched environments&#8217; (EE) containing running wheels, toys, ropes, nesting material, etc., which increases midbrain TH+ neurons by approximately 14% in males. Additionally, a protocol is described for concurrently infusing drugs directly into the midbrain during these environmental manipulations to help identify mechanisms underlying environmentally-induced brain plasticity. For example, EE-induction of more midbrain TH+ neurons is abolished by concurrent blockade of synaptic input onto midbrain neurons. Together, these data indicate that information about the environment is relayed via synaptic input to midbrain neurons to switch on or off expression of &#8216;DA&#8217; genes. Thus, appropriate environmental stimulation, or drug targeting of the underlying mechanisms, might be helpful for treating brain and behavioral disorders associated with imbalances in midbrain DA (e.g. Parkinson&#8217;s disease, attention deficit and hyperactivity disorder, schizophrenia, and drug addiction).

This protocol describes two different environmental manipulations and a concurrent brain infusion protocol to study environmentally-induced brain changes underlying adaptive behavior and brain repair in adult mice.

אפנון סביבתי של מספר המוח התיכון דופמין נוירונים בעכברים בוגרים

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.