פרוטוקול זה משתמש במיקרו-דיסקציה בלייזר ולריצוף RNA כדי לנתח את ביטוי ה-mRNA המהידול של הטרוגניות תוך-גולגולתית, כגון אזורי הצטברות של תאים מזנצ'ימליים או אזורים של פלישת גידולים. שיטה זו עברה אופטימיזציה כדי לשמר היסטולוגיה של רקמות באיכות טובה ושלמות RNA כדי להקל על רכישת דגימות מיקרו-דיסקטיות לייזר באיכות גבוהה. שיטה זו רגישה ובלתי ניתנת לשחזור.
זה יכול להיות מנוצל כדי לחקור מורפולוגיה הגידול הטרוגניות במודלים שונים של הגידול. מיקרו-דיסקט של רקמת גידול במוח קפואה היא טכניקה חסכונית ואמינה לבידוד אזורים אנטומיים נפרדים של אוכלוסיות תאים מרקמות הגידול כדי לחקור את הפרופילים המולקולריים שלהם. LMD יכול להיות מנוצל כדי להשיג ידע מכני מעמיק על האירועים המולקולריים המתבצעים במהלך התקדמות הגידול, והוא יכול לחשוף מטרות טיפוליות חדשניות.
ביולומינציה ב-vivo של נטל הגידול בעכבר מגיעה לאות בין 10 ל-6 ו-10 ל-7. לשטוף פתרון טירוד מחומצן דרך מערכת הדם של העכבר נושא הגידול המתת דם עד הכבד והריאות נוקו לחלוטין מדם. המשך מושלם את החיה עם תמיסת סוכרוז 30% מומס בתמיסת טירוד במשך 15 דקות נוספות.
כדי להעריך את ההצלחה של תפוצה, לאשר כי הצוואר, הזנב והרגליים נוקשים בסוף זרימת הדם. ואז לקצור את המוח על פי פרוטוקולים סטנדרטיים ולאחסן את המוח לילה בתסכול סוכרוז טרי 30%. כדי להתכונן להקפאה, ממלאים צנצנת עם isopentane-2-מתילבוטן קר ומ מניחים את הצנצנת לתוך מיכל מלא חנקן נוזלי.
בעוד הממס מצמרר, להניף את המוח יבש על פיסת נייר מסנן ולמקם את המוח לתוך Cryomold שכותרתו. בזהירות כחמישה מיליליטר של טמפרטורה אופטימלית חיתוך בינוני למרכז Cryomold וממקמים את המוח לתוך התבנית בכיוון הרצוי. באמצעות מדפים נקיים, מניחים במהירות את הקריומאולד לתוך isopentane-2-מתילבוטן מצונן במשך 30 עד 40 שניות.
לאחר שמדיום החיתוך התגבש, מעבירים את הקריומאלד לקרח יבש ועוטפים את הקריומולד ומצמידים רקמת מוח קפואה בנייר אלומיניום לאחסון מינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי לרכוש חלקי רקמת גידול במוח קפואים, תחילה להגדיר את הטמפרטורה של קריוסטט בין מינוס 20 למינוס 24 מעלות צלזיוס, ולה למקם את בלוק המדגם לתוך תא cryostat במשך 30 עד 60 דקות. בעוד המדגם הוא שיווי משקל, לנקות את התא ואת מחזיק הסכין עם 100% אתנול לרסס את מברשות החלק עם פתרון ניקוי RNase.
כאשר המדגם מוכן, להסיר את התבנית ולהשתמש בינוני חיתוך טרי כדי לחבר את בלוק הרקמה הקפואה לדיסק הדגימה של cryostat. מניחים את הבלוק במחזיק הדיסק ומיישרים את הבלוק עם להב הסכין. לרכוש 10 חלקים מיקרומטר של המוח באמצעות אחת מברשות ללא Rnase כדי לשטח בזהירות uncurl חתיכות הרקמה על משטח החיתוך.
כדי להרכיב את מקטעי רקמת המוח על השקופיות, לחץ בצורה חלקה על הצד הטעון באופן חיובי של שקופית זכוכית PEN ללא תווית RNase על החלקה על החלקה ולמקום את השקופית לתוך תיבת אחסון בתוך התא. לאחר איסוף כל השקופיות, מניחים את תיבת האחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי להמיס את מדיום החיתוך לפני ניתוח מיקרו לייזר, להטביע את השקופיות 30 שניות רציף יורד טבילות אתנול ואחריו כתם פתרון סגול קריסטל במשך 20 שניות וחמש שניות ב 0.5%eosin Y פתרון.
בסוף הדגירה eosin Y, להשתמש בנייר מסנן כדי לחסום את השקופיות לייבש ולייבש את השקופיות ברצף עולה אתנול טבילות. לאחר טבילת אתנול של 60 שניות, שוטפים את השקופיות במיכל של קצילן במשך שלוש דקות. לאחר מכן, ייבשו את המגלשות על משטח נטול RNase בטמפרטורת החדר למשך 10 שניות לפני שתתפסו את הדגימות במדיום הרכבה מוכן עם מים נטולי RNase.
לאחר 10 עד 20 שניות, העבר את השקופיות לפלטפורמת המיקרו-דיסקטוריה של המיקרוסקופ. למיקרו-דיסקטה ללכידת לייזר, הפעל את הכוח לפני הפעלת הלייזר. לאחר מכן, הפעל את בקר המיקרוסקופ במחשב והתחל את תוכנת המיקרו-דיסקטוריה ללכידת לייזר.
בחלונית 'בקרת מיקרוסקופ', בחרו בהגדלה של פי 10. תחת בקרת לייזר, הגדר את פרמטרי הלייזר עבור ניתוח רקמות ובחר תדר לייזר של 120 הרץ זרם לייזר של 100% עבור מיקרודיסציט לייזר מדויק, להגדיר את המהירות ל 10 ולהגדיר את הצמצם ל 10 מיקרומטר. ואז להגדיר את הכח ל53.
טען את מלקט הרקמות שילכוד את הרקמה שלאחר המקטע ולחץ על לחצן ביטול הטעינה השני. החלף את האספן הריק בצינורות שטוחים נטולי DNase ו- Rnase 0.5 מיליליטר PCR המכילים 30 מיקרוליטרים של מאגר תיזה לכל צינור. החזר את האספן למחשב ולחץ על המשך כדי להמשיך.
טען את הדגימה המעובדת על המיקרוסקופ ולחץ על בטל טעינה בתוכנת המיקרו-דיסקטיקציה בלייזר. במעלה הדגימה אל מחזיק השקופית והצב את מחזיק השקופית על הבמה. לחץ על המשך כדי להמשיך ובחר צייר גזור בחלון גזור צורות.
השתמש בפקדי המיקרוסקופ כדי למצוא את אזור העניין ולצייר חלוקה לרמות סביב אזור העניין. לאחר מכן בחר צינור מלקט יעד ולחץ על התחל לחתוך כדי להמשיך את המיקרו-דיסקקט של הרקמה. כאשר כל תחומי העניין נותחו, העבר את צינורות האספנים מהמחזיק לקרח יבש עד שהם יהיו במורד הזרם.
כדי לרכוש רקמות עם מורפולוגיה מעולה ושלמות RNA, גישות תדלוק שונות הוערכו. כדי לנתח את אזורי העניין, יש צורך להכתים את הרקמות עם צבעים מזיקים עבור RNA. זיוף הבא של עכברים נושאי גידול עם פתרון טירוד ו 30% סוכרוז ואחריו דגירה לילה ב 30% סוכרוז תוצאות בשימור המורפולוגיה ושלמות RNA של רקמת העכבר.
למרות קיבוע רקמת paraformaldehyde תוצאות מורפולוגיה רקמות באיכות גבוהה, שלמות RNA מושפע לרעה. גישות אחרות כגון שימוש דגירה פתרון טירוד, או פתרון טירוד בתוספת 30% דגירה פתרון סוכרוז אינם משפיעים על איכות RNA, אבל רזולוציה מופחתת במורפולוגיה רקמה הוא ציין. אם הרקמות אינן מותקנות עם מדיום הרכבה, החלקים מתייבשים והמורפולוגיה מתדרדרת תוך הרכבה של דגימות הרקמה עם 15% הרכבה בינונית מומסת במים שומרת על מורפולוגיה רקמה באיכות גבוהה.
הדמיית מיקרוסקופ לכידת לייזר מיקרודיסקציה מאפשרת בחירה של רקמת הגידול עבור ניתוח. אזור זה של בחירת עניין לאחר מכן מאפשר ניתוח של תחומי עניין בתוך כל מדגם רקמה לניתוח שלמות RNA. שמירה על מורפולוגיה של רקמת גידול באיכות גבוהה ושלמות RNA היא קריטית.
פתרון Tyrode ו 30% זלוף סוכרוז עם שימור לילה ב 30% סוכרוז משפר באופן משמעותי את מורפולוגיה רקמות עבור LMD. קיבעון ליומה מהיר, כתמים והתהוות עם פתרון GAN הוא צעד קריטי לשמירה על איכות ה-RNA ולמניעת היווים של סדקים בתוך הרקמה. אנו ממליצים חתך לפחות 2.5 פעמים 10 כדי 6 מיקרומטר מרובע הגידול הכולל לכל אזור רקמה כדי להשיג כמויות מתאימות של RNA הן בקרת איכות RNA וניתוח transcriptomic.
LMD מאפשר ניתוח של מסלולי איתות מולקולריים המווסתים את הטרוגניות גליומה ופלישה אשר יכול לחשוף מטרות פוטנציאליות חדשניות לפיתוח תרגום עתידי במודלים גליומה פרה-קליניים.
