This work was funded by the National Institute of Mental Health (1R15MH084209 - 01A1), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R21NS058375-01A2) and the National Science Foundation (DBI0723080 07070646).

<ol>
	<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li><li>Schutze, K., Lahr, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+expressed+genes+by+laser-mediated+manipulation+of+single+cells.">Identification of expressed genes by laser-mediated manipulation of single cells.</a> Nature biotechnology. 16, 737-742 (1998).</li><li>Schutze, K., Posl, H., Lahr, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+micromanipulation+systems+as+universal+tools+in+cellular+and+molecular+biology+and+in+medicine.">Laser micromanipulation systems as universal tools in cellular and molecular biology and in medicine.</a> Cellular and Molecular Biology. 44, 735-746 (1998).</li><li>Vandewoestyne, M., Van Nieuwerburgh, F., Van Hoofstat, D., Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+three+DNA+extraction+protocols+for+forensic+STR+typing+after+laser+capture+microdissection.">Evaluation of three DNA extraction protocols for forensic STR typing after laser capture microdissection.</a> Forensic Science International Genetics. 6, 258-262 (2012).</li><li>Eells, J. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+analysis+of+laser+capture+microdissected+fetal+epithelia.">Epigenetic analysis of laser capture microdissected fetal epithelia.</a> Analytical Biochemistry. 442, 68-74 (2013).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-126+contributes+to+Parkinson's+disease+by+dysregulating+the+insulin-like+growth+factor/phosphoinositide+3-kinase+signaling.">miR-126 contributes to Parkinson's disease by dysregulating the insulin-like growth factor/phosphoinositide 3-kinase signaling.</a> Neurobiology of Aging. 35, 1712-1721 (2014).</li><li>Bohm, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+antidepressant+treatment+on+gene+expression+profile+in+mouse+brain:+cell+type-specific+transcription+profiling+using+laser+microdissection+and+microarray+analysis.">Effects of antidepressant treatment on gene expression profile in mouse brain: cell type-specific transcription profiling using laser microdissection and microarray analysis.</a> Journal of Neurochemistry. 97, 44-49 (2006).</li><li>Kadkhodaei, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+Nurr1+maintains+fiber+integrity+and+nuclear-encoded+mitochondrial+gene+expression+in+dopamine+neurons.">Transcription factor Nurr1 maintains fiber integrity and nuclear-encoded mitochondrial gene expression in dopamine neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2360-2365 (2013).</li><li>Miller, R. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+studies+of+psychostimulant-induced+changes+in+gene+expression.">Microarray studies of psychostimulant-induced changes in gene expression.</a> Addiction Biology. 10, 101-118 (2005).</li><li>Brown, A. L., Smith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+RNA+preservation+for+immunolabeling+and+laser+microdissection.">Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection.</a> RNA. 15, 2364-2374 (2009).</li><li>Curran, S., McKay, J. A., McLeod, H. L., Murray, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microscopy.">Laser capture microscopy.</a> Molecular Pathology. 53, 64-68 (2000).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

LCM est une technique puissante pour la dissection des populations distinctes de cellules ou de tissu à partir de régions de coupes de tissus sur une lame de microscope et l&#39;isolation ultérieure de l&#39;ARN, micro-ARN, l&#39;ADN et les protéines. L&#39;utilisation de LCM en combinaison avec l&#39;analyse en utilisant des technologies à haut débit tels que la puce à ADN, suivant le séquençage de l&#39;ARN de production, l&#39;analyse épigénétique de l&#39;ADN et la protéomique est de plus en plus fréquent que la sensibilité de ces techniques se améliore et la quantité de matériau de départ nécessaire est réduite 8-12. Avec LCM, une meilleure résolution anatomique est réalisé pour un échantillon, et à la compréhension des mesures en aval de ces échantillons est grandement améliorée. Une mise en garde avec LCM est qu&#39;elle fournit un échantillon concentré de cellules d&#39;intérêt, mais pas nécessairement une population pure de cellules. Les limites de la précision signifie qu&#39;il y aura une certaine contamination du tissu adjacent. Cependant, cette technique ne se concentre les cellules d&#39;intérêtpour minimiser les effets associés à des cellules et des tissus environnants et de maximiser les effets expérimentaux sur les cellules d&#39;intérêt. Direct par rapport indirect immunohistochimie Depuis LCM est actuellement utilisée principalement pour la séparation et la mesure de l&#39;ARN, l&#39;ARN intact maintien est un critère très important. Le maintien de l&#39;intégrité de l&#39;ARN est la raison principale derrière l&#39;utilisation de l&#39;immunohistochimie indirecte pour guider la dissection des tissus qui élimine la nécessité de colorer directement le tissu qui peut dégrader l&#39;ARN (figure 10). Lorsque la question expérimental, cependant, nécessite l&#39;isolement d&#39;une population spécifique de cellules, telles que les neurones dopaminergiques, immunohistochimie fluorescente directe ne est nécessaire. L&#39;utilisation d&#39;un protocole rapide d&#39;étiquetage immunohistochimie peut minimiser la dégradation de l&#39;ARN au cours de la procédure. Les temps d&#39;incubation courts sont dues à l&#39;utilisation de concentrations élevées d&#39;anticorps anti primaire et secondaireorganismes, les concentrations qui sont autour de 10 à 20 fois supérieures à ce qui est nécessaire pour l&#39;immunohistochimie classique avec une incubation de 2 h. Si toutefois, des temps d&#39;incubation plus longues sont nécessaires, Brown et Smith utilisés tampons élevées de sel pour inhiber la dégradation de l&#39;ARN et obtenir une bonne ARN de qualité avec des temps d&#39;incubation longs (jusqu&#39;à 20 h) 13. Cette approche peut également être utilisé se il ya beaucoup de temps nécessaire entre l&#39;étiquetage du tissu et de l&#39;accès à un système de LCM. Choix de diapositives - membrane PEN, Silane-prep et lames de verre non couchés L&#39;utilisation de lames de verre non couchés pour LCM ont été signalés 14. Dans notre laboratoire, lames de Silane-prep se sont révélés être un choix optimal, que ce revêtement se fixe suffisamment le tissu pour le coulisseau pour l&#39;immunohistochimie sans perte de tissu mais permet encore pour la fixation du tissu à des capuchons LCM et le retrait de la lame . Lames de verre non couchés onta montré une certaine perte de tissu avec la procédure d&#39;immunohistochimie. Si immunohistochimie indirecte est utilisée, cependant, la rétention de tissu devient moins un problème. Avec déshydratation appropriée, les cellules de capture ou de tissu hors de diapositives Silane-Prep n&#39;a pas été un problème. Chacune des différentes approches de neurones isolement ou régions du cerveau décrites dans ce document présente des avantages et des inconvénients. Pour l&#39;isolement des neurones dopaminergiques individuels, l&#39;utilisation de lames de Silane-prep présente l&#39;avantage d&#39;une meilleure optique et est moins coûteux que les lames de la membrane PEN. L&#39;inconvénient est que les cellules parfois capture peut être difficile se il ya déshydratation insuffisante (voir ci-dessous) et de certains tissus peut être laissé sur la diapositive. L&#39;avantage des diapositives membranes PEN est que l&#39;utilisation de la combinaison du laser UV et IR laser assure que les neurones dopaminergiques sont recueillies. Le défaut de recueillir des cellules de la membrane coulisse un PEN presque ne se produit jamais, car elle est moins dépendante de la déshydratation que les lames de verre. Une<html> avantage supplémentaire est que le laser UV peut être utilisée pour rapprocher plus étroitement la forme des neurones d&#39;intérêt, par rapport à un cercle de capture hors de neurones des lames de verre avec le laser IR. Pour l&#39;isolement des régions de tissu, les diapositives de la membrane PEN sont de loin supérieures et justifient le coût supplémentaire. Cette approche aboutit à l&#39;élimination complète de tous les tissus découper sur la membrane, est beaucoup plus rapide que la capture d&#39;une grande zone de tissu en utilisant le laser IR seul et coupes de tissus plus épais peuvent être recueillis. En utilisant seulement le laser IR nécessite que la membrane de bouchon de LCM soit complètement fondu au-dessus de la zone de tissu ensemble. En outre, la collecte incomplet du tissu est typique et nécessite généralement plusieurs tentatives. Bien que cela prend plus que le tissu isolant de la lame de la membrane PEN, si le tissu disponible est déjà sur une lame de verre ou d&#39;un laser UV ne est pas disponible, ce est une option viable, car la plupart des tissus peuvent être collectées (Figure 8J). &quot;&gt; Les étapes critiques ove_content Les incubations d&#39;éthanol 100% sont une des étapes les plus importantes. Afin de recueillir les cellules à partir de diapositives Silane-Prep déshydratation complète du tissu est requis. Par conséquent, toute l&#39;eau ne est pas retiré, qui est associé principalement avec l&#39;incubation de l&#39;éthanol à 100%, aura un impact sur la capacité de prélever des cellules à partir des diapositives. Afin de répondre à cette question, changer fréquemment les solutions d&#39;éthanol 100%, car l&#39;absorption de l&#39;eau de l&#39;air ou le transfert de lavage étapes précédentes peuvent affecter la déshydratation. En outre, les tamis moléculaires sont utilisés pour absorber toute contamination de l&#39;eau. Le système de LCM devrait idéalement être situé dans une petite chambre avec un déshumidificateur pour maintenir des conditions de faible humidité. Sections de bonnes cryostat sont essentielles pour LCM bon. Les articles doivent être à plat avec des plis dans le tissu minimisé. Plis dans le tissu va augmenter la distance entre le capuchon de LCM et l&#39;empêcher d&#39;entrer en contact til tissulaire. Il devient alors difficile à fondre suffisamment le capuchon à membrane sur le tissu. Pour les lames de verre, généralement l&#39;épaisseur de coupe doit être compris entre 6 et 12 um. Sections plus épaisses peuvent être capturés avec les diapositives de la membrane PEN. LCM offre une capacité technique de faire dissections très précises de tissus et de cellules à partir des lames de microscope. Ceci augmente considérablement la résolution d&#39;une analyse complémentaire par rapport à la dissection brut des morceaux de tissu. Bien que, LCM peut prendre du temps et de main-d&#39;œuvre, il ne nécessite pas une formation approfondie ou d&#39;expertise et, lorsqu&#39;il est couplé avec d&#39;autres technologies à haut débit, peut grandement améliorer la compréhension d&#39;un processus biologique lorsque les cellules discrètes ou régions anatomiques sont utilisés.

<html> Tous les tissus se compose d&#39;une population de cellules hétérozygotes. Ceci est particulièrement pertinent pour les tissus du cerveau, constitué de différents neurones morphologiquement et / ou neurochimique distincts entourés de divers types de cellules gliales (oligodendrocytes, la microglie et les astrocytes). En outre, des régions distinctes dans le cerveau, comme les zones du cortex ou du tronc cérébral noyaux, ont des fonctions spécifiques. Par conséquent, la capacité d&#39;isoler des populations spécifiques de cellules ou de très petites zones anatomiquement distincts, lorsqu&#39;il est combiné avec des techniques d&#39;analyse (par exemple, Q-PCR, microarrays, ARN-séquençage, et protéomique), peuvent sensiblement améliorer la compréhension des différents processus biologiques. LCM est une technologie qui offre la possibilité d&#39;isoler des zones anatomiques très discrets ou de cellules spécifiques d&#39;un tissu sur une lame de microscope en fournissant une source beaucoup plus homogène pour une analyse ultérieure de diverses molécules, telles que l&#39;ARN, micro-ARN, l&#39;ADN et les protéines. t &quot;&gt; Depuis LCM a été introduit, plusieurs approches différentes ont été utilisées pour les cellules d&#39;un tissu microdissect 3.1. Les premières approches compris la fixation directe d&#39;un tissu sur une lame en utilisant un (IR) et un laser infrarouge et un film thermoplastique non Procédé de contact à l&#39;aide d&#39;un rayonnement ultraviolet (UV) de coupe laser pour détacher une cellule ou un tissu et collecte dans un tube. Par la suite, LCM a été utilisé avec succès sur une grande variété de tissus et de types de cellules et représenté pour être compatible avec l&#39;isolement de diverses molécules pour l&#39;analyse en aval y compris l&#39;ARN, les microARN, l&#39;ADN et les protéines, y compris l&#39;activité enzymatique 1,4-7. Voici LCM est démontrée en utilisant l&#39;un système de LCM qui utilise une découpe laser UV et un laser capture d&#39;IR pour couper autour des cellules ou des tissus et en l&#39;attachant à un LCM capuchon, respectivement. Ce système de LCM utilise à la fois la capture laser IR à l&#39;état fondu un film plastique sur un plafond au-dessus de la cellule ou du tissu d&#39;intérêt qui se fixe aux cellules de la feuille de matière plastique et le supprime de til tissu à l&#39;enlèvement du capuchon (figure 1). En outre, en combinaison avec le laser IR, un laser UV est disponible pour découpe des tissus ou cellules d&#39;intérêt à partir de tissus montées sur des lames avec une membrane puis isolé par fixation du tissu à la capsule de LCM utilisant le laser IR (figure 2). Un bref aperçu de ces techniques se trouve dans les figures 1 et 2. Plusieurs variantes de cette technique sont décrits afin d&#39;isoler des cellules spécifiques en utilisant l&#39;immunohistochimie fluorescente directe et une technique d&#39;immunohistochimie indirecte guidée qui est utilisé pour l&#39;isolement d&#39;une région de tissu sur la base de l&#39;expression d&#39;une protéine spécifique. Plus précisément, l&#39;isolement des neurones dopaminergiques de la substance noire et l&#39;isolement de l&#39;aire tegmentale ventrale et l&#39;isolement subséquent de l&#39;ARN à partir de frais, congelé les tissus du cerveau sont représentés. Comme l&#39;ARN est la plus labile des molécules mesurées (par rapport à l&#39;ADN ou protéine), de steps pour aider à préserver l&#39;intégrité de l&#39;ARN sont inclus et les données indiquées sur la quantité et la qualité de l&#39;ARN obtenu.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="597">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:159px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:121px;">Catalog Numer&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Veritas Laser Capture Microdissection System</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td style="width:121px;">Newer model is now sold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">CapSure Macro LCM Caps</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>LCM0211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">CapSure HS LCM Caps</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>LCM0213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">PEN Membrane slides</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>s4651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">Silane prep-slides</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>S4651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">95% Ethanol-RNase Free</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>E7148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">100% Ethanol-RNase Free</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">Rnase Free Triton</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">Molecular Sieve</td>
			<td style="width:191px;">EDM Millipore, Billerica, MA</td>
			<td>MX1583D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Anti-Tyrosine hydroxyase antibody</td>
			<td style="width:191px;">EDM Millipore, Billerica, MA</td>
			<td>Ab152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:191px;">Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Stratagene MX 3005P</td>
			<td style="width:191px;">Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td>
			<td>401513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Nanodrop 3300 fluorospectrometer</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Quant-iT RiboGreen</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">RNaseZap</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection - a demonstration of the isolation of individual dopamine neurons and the entire ventral tegmental area

microdissection par capture laser (LCM) est utilisé pour isoler une population concentrée de cellules individuelles ou des régions anatomiques précis de tissu à partir de coupes de tissus sur une lame de microscope. Lorsqu&#39;il est combiné avec l&#39;immunohistochimie, LCM peut être utilisé pour isoler des cellules individuelles types basés sur un marqueur de protéine spécifique. Ici, la technique de LCM est décrit pour la collecte d&#39;une population spécifique de neurones dopaminergiques directement marquées avec de la tyrosine hydroxylase immunohistochimie et pour l&#39;isolement du neurone dopaminergique contenant région de l&#39;aire tegmentale ventrale utilisant indirect tyrosine hydroxylase immunohistochimie sur une section adjacente à celles utilisées pour LCM. Une infrarouge (IR) de capture laser est utilisé pour disséquer les deux neurones individuels ainsi que l&#39;aire tegmentale ventrale de fermeture des lames de verre et sur un capuchon de LCM pour analyse. La déshydratation complète du tissu avec 100% d&#39;éthanol et le xylene est critique. La combinaison de la capture laser à infrarouge et l&#39;ultraviolet (UV) Cutting laser est utilisé pour isoler les neurones dopaminergiques individuels ou l&#39;aire tegmentale ventrale lors de l&#39;utilisation de la membrane diapositives PEN. Coulisse de PEN membrane présente des avantages significatifs par rapport à une lame de verre comme il offre une meilleure consistance dans la capture et la collecte des cellules, est plus rapide collecter de grands morceaux de tissu, est moins dépendant des résultats de la déshydratation et l&#39;élimination complète du tissu à partir de la diapositive. Bien que l&#39;élimination de grandes zones de tissu à partir d&#39;une lame de verre est possible, il est considérablement plus longue et laisse souvent peu de tissu résiduel derrière. Les données présentées ici démontrent que l&#39;ARN de la quantité et qualité suffisante peut être obtenue en utilisant ces procédures pour des mesures quantitatives de PCR. Bien que l&#39;ARN et l&#39;ADN sont les molécules les plus isolées de tissus et cellules recueillies avec LCM, l&#39;isolement et la mesure des microARN, les protéines et les changements épigénétiques de l&#39;ADN peuvent également bénéficier de la résolution anatomique et cellulaire améliorée obtenue en utilisant LCM.

La micrographie sur les figures 6 et 7 montrent des capacités pour l&#39;isolement des neurones dopaminergiques individuels. La résolution anatomique actuel est d&#39;environ 5 à 10 um comme la plus petite taille de la tache qui peut être produit régulièrement sur le LCM bouchons pour isoler une cellule. La seule limitation pour l&#39;isolement de types cellulaires spécifiques est la possibilité de visualiser les cellules. Bien que LCM est capable d&#39;isoler les neurones dopaminergiques individuels, la contamination des parties de cellules non marquées adjacentes se produit le plus probable. Par conséquent, l&#39;échantillon final est un concentré collecte des neurones dopaminergiques, et non pas une population pure de neurones dopaminergiques. Cette technologie est aussi capable d&#39;isoler de petites zones de tissu tels que des noyaux ou des régions discrètes dans le cerveau, comme indiqué à l&#39;isolement de l&#39;aire tegmentale ventrale. Publications antérieures ont démontré cette utilisation dans les tissus du cerveau ainsi que pour isoler le tissu pathologique du tissu normal 5,11. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Parce que l&#39;utilisation la plus courante de cellules et de tissus isolés en utilisant LCM est l&#39;analyse de l&#39;ARN, les procédures présentées ont été optimisés pour préserver l&#39;intégrité de l&#39;ARN. Afin de déterminer la qualité de l&#39;ARN qui est resté suivant LCM, l&#39;ARN a été isolé en utilisant des colonnes à base de silice de rotation, à partir de tissu sur les diapositives suivantes LCM, soit après la tyrosine rapide procédure d&#39;immunohistochimie fluorescente hydroxylase ou fixation dans l&#39;acétone. la qualité de l&#39;ARN a été mesurée et comparée à des valeurs de l&#39;ARN à partir d&#39;ARN disponible dans le commerce du cerveau entier (figure 9). la qualité de l&#39;ARN a été réduit dans les échantillons d&#39;ARN provenant de tissus utilisés pour LCM avec intégrité plus faible après l&#39;immunohistochimie (RIN pas disponible), suivie par de l&#39;acétone fixation (RIN 2,6) par rapport à l&#39;ARN de cerveau entier (RIN 8,2) comme on peut le voir par une réduction relative de hauteur du pic de l&#39;ARNr S28 par rapport au pic S18. Cependant, l&#39;ARN a maintenu les bandes 18S et 28S et l&#39;expression du gène peut être mesurée en utilisant Q-PCR. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Pour mesurer la quantité d&#39;ARN obtenu à partir de neurones acquises via LCM, les neurones dopaminergiques (50, 100 et 200 neurones dopaminergiques) ont été isolés à partir de l&#39;aire tegmentale ventrale de lames de Silane-Prep. L&#39;ARN a été isolé en utilisant des colonnes à base de silice de spin et la quantité d&#39;ARN a été mesurée. Sur la base de la courbe d&#39;étalonnage généré, un total de 17,3, 24,8 et 50,9 pg pg / pl a été isolé à partir de 50, 100 et 200 neurones dopaminergiques, respectivement (figure 10A). Pour mesurer la quantité d&#39;ARN par Q-PCR, une gamme de concentrations d&#39;ARN de cerveau et de l&#39;ARN entier à partir des neurones dopaminergiques a été transcrit de manière inverse et le gène de la β-actine a été mesurée en utilisant Q-PCR comme décrit précédemment 5. Sur la base de ces mesures, une concentration de 3,55, 6,82 et 20,58 pg / pl a été calculée à partir de 50, 100 et 200 neurones dopaminergiques, respectivement (figure 10B). Pour montrer comment l&#39;isolement des neurones dopaminergiques compare à l&#39;isolement de l&#39;ensemble du vaire tegmentale entral avec LCM, des gènes spécifiques des neurones dopaminergiques (Nurr1, la tyrosine hydroxylase, et transporteur de la dopamine) ont été mesurés par Q-PCR dans ces deux types d&#39;échantillons différents et on les compare à l&#39;expression de la β-actine (figure 11). Etant donné que des valeurs inférieures t C sont générés avec une concentration plus élevée du gène d&#39;intérêt, une diminution de l&#39;Ac t indique une expression accrue des gènes de neurones dopamine par rapport au β-actine. Ceci démontre comment l&#39;isolement des neurones dopaminergiques individuels concentre l&#39;expression de gènes spécifiques des neurones dopaminergiques. Dans les échantillons d&#39;aire tegmentale ventrale, des gènes spécifiques dopamine de neurones sont dilués comme d&#39;autres cellules (neurones non dopaminergiques et les cellules gliales) seront également collectées qui expriment β-actine, mais ne expriment pas les gènes de neurones dopaminergiques. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig1highres.jpg" /> <strong&gt; Figure 1. capture laser à l&#39;aide du laser infrarouge (IR) de capture. Le petit bouchon en plastique LCM a une membrane sur le fond qui est placé sur le dessus du tissu monté sur une lame de verre (étape 1). Lorsque le tissu ou la cellule d&#39;intérêt est identifié, un laser IR de capture est déclenché par l&#39;intermédiaire du bouchon de LCM pour faire fondre une petite fossette dans la membrane sur le tissu / cellule sous-jacente (étape 2). Lorsque le capuchon est enlevé de LCM, le tissu est retiré de la lame de microscope et reste attachée à la capsule de LCM. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig2highres.jpg" /> Figure 2. capture laser en utilisant l&#39;infrarouge (IR) laser de capture et l&#39;ultraviolet (UV) laser de découpage. Pour obtenir de plus grandes zones de tissu ou faciliter la récupération des cellules en utilisant le laser UV, le tissu est monté sur un coulisseau avec une membrane relié à la coulisse le long de l&#39;angle extérieur (PEN coulisse de la membrane). Le bouchon de LCM est placé sur til tissu et le laser IR de capture est utilisé pour faire fondre la membrane de couvercle et fixer le tissu sur le capuchon d&#39;LCM (étape 1 et 2). Le laser de coupe UV est ensuite utilisé pour couper à travers la membrane de la lame et le tissu (étape 3 et 4) de sorte que lorsque le capuchon est retiré du tissu est prélevé à partir de la diapositive et reste sur le capuchon de LCM (étape 5). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig3highres.jpg" /> Figure 3. La Microdissection laser Système Road Map. Ce système de microdissection par capture laser a l&#39;espace pour trois lames à la fois. Lorsque les diapositives sont chargées dans le microscope, faible grossissement Carte routière images pour chaque diapositive sont générés. Sélection d&#39;une zone de l&#39;image de feuille de route se déplace la fenêtre d&#39;image en direct à cette région. Pour des fins de démonstration, du mésencéphale de la souris a été sectionnée en 10 um section sur trois diapositives. La première diapositive a été étiqueté pour la tyrosine hydroxylase immunoreactivité en utilisant de la diaminobenzidine comme chromogène un (A). Les sections ont été installés sur des diapositives Silane-Prep (B) ou des diapositives de la membrane PEN (C). Ces deux diapositives ont été marqués en utilisant la tyrosine hydroxylase immunohistochimie fluorescente rapide. Flèches dans (C) indiquent l&#39;attachement de la membrane PEN à la lame de verre. Aucun tissu extérieur de cette frontière peut être recueilli avec LCM. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig4highres.jpg" /> Figure 4. En utilisant le laser de capture IR. Le laser de capture d&#39;IR est utilisé pour faire fondre le bouchon de membrane de LCM pour fixer le tissu sur le capuchon d&#39;LCM et le retirer du reste du tissu. Le laser de capture IR doit être à une force suffisante pour faire fondre le bouchon de membrane suffisamment LCM pour contacter la lame de verre et le tissu sous-jacent. L&#39;image ci-dessus montre lorsque le laser était insuffisante pour faire fondre la membraneau coulisseau (deux taches de gauche). Lorsque la membrane fondue touche la lame de verre, un contour noir épais peut être observée (spot à droite). L&#39;intensité du laser peut être ajustée en changeant la puissance (de 3 à 100 mW), Impulsion (us 100-1,000,000) et # Résultats du laser. En outre, répété tir du laser infrarouge au même endroit peut aussi fondre davantage la membrane. Le but du laser IR doit être ajustée chaque fois que le capuchon est déplacé LCM ou lorsque l&#39;objectif est changé. Barre d&#39;échelle = 100 um. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig5highres.jpg" /> Figure 5. Utilisation de la découpe au laser UV. Le laser UV de coupe est utilisé pour couper à travers la membrane et le tissu PEN. Avant d&#39;utiliser l&#39;intensité minimale nécessaire pour couper à travers la membrane et le tissu doit être de déterminer depuis le laser UV peut endommager les tissus. Ci-dessus, les trois points (flèches) de différentes intensités laser UV sont présentés avec le<html> taille suffisante pour 10 sections um, le milieu de terrain pour les sections plus épaisses et au bon endroit démontrant une intensité laser UV qui est trop élevé place gauche. Barre d&#39;échelle = 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig5large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig6highres.jpg" /> Les neurones dopaminergiques Figure 6. L&#39;isolement direct de la tyrosine hydroxylase neurones immunoréactifs à l&#39;aide du laser IR. Sont indiqués après un marquage fluorescent rapide pour la tyrosine hydroxylase (A). Lorsque le laser infrarouge est tiré fusion de la membrane de bouchon de LCM sur ces neurones (D), l&#39;enlèvement du capuchon capte ces cellules hors de la glissière (B, E). Ces neurones peuvent alors être visualisés comme attaché au capuchon de LCM (C, F). Barre d&#39;échelle = 250 um.= &quot;Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig6large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig7highres.jpg" /> Figure 7. L&#39;isolement direct de la tyrosine hydroxylase neurones immunoréactifs à partir de lames de la membrane PEN utilisant les lasers IR et UV. Tyrosine hydroxylase neurones marqués sont présentés ci-dessus (A). Ces neurones peuvent être fixés au plafond de LCM en utilisant le laser IR et découpées dans la coulisse de PEN membrane en utilisant le laser UV (B). Barre d&#39;échelle = 250 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig7large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig8highres.jpg" /> Figure 8. indirect<html> isolement de l&#39;aire tegmentale ventrale en utilisant la tyrosine hydroxylase immunoréactivité. L&#39;emplacement des neurones dopaminergiques dans l&#39;aire tegmentale ventrale a été visualisée dans une section en utilisant des techniques immunohistochimiques standard (A et E). Cette section intitulée immunohistochimie a été utilisée comme un modèle pour localiser l&#39;aire tegmentale ventrale dans les sections adjacentes non colorées (B et F). En utilisant le laser UV, l&#39;aire tegmentale ventrale a été attaché au capuchon de LCM avec le laser IR et coupé de la lame avec le laser UV (C et D) et est représentée fixée à un plafond HS LCM (D). La région tegmentale ventrale isolé à partir de diapositives Silane-prep en utilisant seulement le laser infrarouge est également montré attaché à un plafond Macro (FK). A noter que plus d&#39;une tentative a été nécessaire pour recueillir la majeure partie du tissu à partir de cette région (Comparer G et J). Barre d&#39;échelle = 500 um.pload / 52336 / 52336fig8large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 9" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig9highres.jpg" /> Figure qualité 9. ARN. Électrophérogrammes représentatifs et les images de gel associés disponibles dans le commerce ARN totaux du cerveau (A) et l&#39;ARN isolé à partir de sections après fixation à l&#39;acétone et LCM (B) ou fluorescent immunohistochimie rapide de la tyrosine hydroxylase et LCM (C). Bien que la qualité de l&#39;ARN a été réduite dans les sections traitées pour l&#39;immunohistochimie, par rapport à l&#39;ARN de cerveau entier, les électrophérogrammes montrent l&#39;ARN intact essentiellement basée sur la présence des pics ARNr S18 et S28. Concentration d&#39;ARN du cerveau entier était 6,487 pg / ul avec un RIN de 8,2. Acétone concentration d&#39;ARN de tissu fixé était 5,036 pg / ul avec un RIN de 2,6. ARN obtenu après immunohistochimie h<html> insérer une concentration de 4,474 pg / pl et RIN était pas disponible. <img alt="Figure 10" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig10highres.jpg" /> Figure 10. quantité d&#39;ARN. Pour déterminer la quantité d&#39;ARN dans les neurones obtenus avec LCM, une courbe standard de la concentration d&#39;ARN a été produit en utilisant un fluorospectromètre et Q-PCR. Pour les mesures de fluorospectromètre (A), la grande graphique montre la gamme supérieure des montants d&#39;ARN et le petit graphique montre la sensibilité de ce dosage jusqu&#39;à 10 pg / pl. Les concentrations d&#39;ARN obtenus à partir de 50, 100 et 200 neurones dopaminergiques a été de 17,3, 24,8 et 50,9 pg / pl, respectivement. Utilisation de Q-PCR pour mesurer des quantités d&#39;ARN (B), les concentrations d&#39;ARN obtenus à partir de 50, 100 et 200 neurones dopaminergiques a été de 3,55, 6,82 et 20,58 pg / pl, respectivement. es / ftp_upload / 52336 / 52336fig11highres.jpg &quot;/&gt; Figure 11. Concentration de gènes spécifiques de la dopamine des neurones à l&#39;isolement des neurones dopaminergiques individuels. La différence de C t (Ac t) entre les gènes de la dopamine des neurones spécifiques (Nurr1, la tyrosine hydroxylase, et transporteur de la dopamine) et de β-actine dans des échantillons de neurones dopaminergiques dans l&#39;aire tegmentale ventrale isolé avec LCM par rapport à l&#39;expression dans les dissections de toute la région tegmentale ventrale sont indiqués. Comme T valeurs inférieures C sont générés avec une concentration plus élevée du gène d&#39;intérêt, une diminution de l&#39;Ac t indique une expression accrue de gènes de la dopamine des neurones par rapport à β-actine en tant que d&#39;autres cellules (neurones non dopaminergiques et les cellules gliales) volonté recueillir dans les échantillons d&#39;aire tegmentale ventrale qui expriment l&#39;actine-β mais ne expriment pas les gènes de neurones dopaminergiques.

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Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

L&#39;isolement des neurones dopaminergiques individuels ou l&#39;aire tegmentale ventrale par immunohistochimie directe ou indirecte est démontrée en utilisant microdissection laser. Les paramètres pour l&#39;isolement d&#39;un tissu à partir d&#39;une lame de verre en utilisant un laser infrarouge et de diapositives membrane en utilisant la combinaison d&#39;un laser infrarouge et ultraviolet sont discutés.

Microdissection laser - une démonstration de l&#39;isolement de la dopamine neurones individuels et de l&#39;Espace ventrale tegmentale entière

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.8K vues.  Mississippi State University College of Veterinary Medicine.  L'isolement des neurones dopaminergiques individuels ou l'aire tegmentale ventrale par immunohistochimie directe ou indirecte est démontrée en utilisant microdissection laser. Les paramètres pour l'isolement d'un tissu à partir d'une lame de verre en utilisant un laser infrarouge et de diapositives membrane en utilisant la combinaison d'un laser infrarouge et ultraviolet sont discutés. 

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Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Microdissection laser des Drosophile Neurones périphériques

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Recherche

Neurosciences

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

Approche non-Laser Microscopie Capture pour la microdissection des régions discrètes du cerveau de souris pour l&#39;ARN isolement total et en aval séquençage de nouvelle génération et de profil d&#39;expression génique

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five decades of inquiry into the molecular deficiencies associated with dopamine regulation. The majority of these inquiries of dopamine regulation in the brain focus upon the molecular basis for its regulation in the terminal field regions of the nigrostriatal and mesoaccumbens pathways; striatum and nucleus accumbens. Furthermore, such studies have concentrated on analysis of dopamine tissue content with normalization to only wet tissue weight. Investigation of the proteins that regulate dopamine, such as tyrosine hydroxylase (TH) protein, TH phosphorylation, dopamine transporter (DAT), and vesicular monoamine transporter 2 (VMAT2) protein often do not include analysis of dopamine tissue content in the same sample. The ability to analyze both dopamine tissue content and its regulating proteins (including post-translational modifications) not only gives inherent power to interpreting the relationship of dopamine with the protein level and function of TH, DAT, or VMAT2, but also extends sample economy. This translates into less cost, and yet produces insights into the molecular regulation of dopamine in virtually any paradigm of the investigators' choice.
We focus the analyses in the midbrain. Although the SN and VTA are typically neglected in most studies of dopamine regulation, these nuclei are easily dissected with practice. A comprehensive readout of dopamine tissue content and TH, DAT, or VMAT2 can be conducted. There is burgeoning literature on the impact of dopamine function in the SN and VTA on behavior, and the impingements of exogenous substances or disease processes therein 1-5. Furthermore, compounds such as growth factors have a profound effect on dopamine and dopamine-regulating proteins, to a comparatively greater extent in the SN or VTA 6-8. Therefore, this methodology is presented for reference to laboratories that want to extend their inquiries on how specific treatments modulate behaviour and dopamine regulation. Here, a multi-step method is presented for the analyses of dopamine tissue content, the protein levels of TH, DAT, or VMAT2, and TH phosphorylation from the substantia nigra and VTA from rodent midbrain. The analysis of TH phosphorylation can yield significant insights into not only how TH activity is regulated, but also the signaling cascades affected in the somatodendritic nuclei in a given paradigm.
We will illustrate the dissection technique to segregate these two nuclei and the sample processing of dissected tissue that produces a profile revealing molecular mechanisms of dopamine regulation in vivo, specific for each nuclei (Figure 1).

Dopamine is distinctly regulated in the midbrain nuclei, which contain the cell bodies and dendrites of the dopamine neurons. Here we describe a dissection and sample-handling approach to maximize results, and thus conclusions and insights, on dopamine regulation in the midbrain nuclei of the substantia nigra (SN) and ventral tegmental area (VTA) in rodents.

Profilage global de régulation de la dopamine dans la substance noire et aire tegmentale ventrale

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Microdissection par capture laser de populations enrichies de neurones neurones isolés ou pour l&#39;analyse d&#39;expression génique après un traumatisme crânien

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF) to provide an abundant supply of cells. NPCs were differentiated in the presence of a new combination of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) and retinoic acid on dishes coated with poly-L-lysine and mouse laminin to obtain neuron-rich cultures. NPCs were also differentiated in the absence of neurotrophins, DBC and retinoic acid and in the presence of ciliary neurotrophic factor (CNTF) to yield astrocyte-rich cultures. Differentiated NPCs were characterized by immunofluorescence staining for a panel of neuronal markers including NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin and GAP43. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and STAT3, astrocyte markers, were detected in 10-15% of differentiated NPCs. To facilitate cell-type specific molecular characterization, laser capture microdissection was performed to isolate neurons cultured on polyethylene naphthalate (PEN) membrane slides. The methods described in this study provide valuable tools to advance our understanding of the molecular mechanism of neurodegeneration.

Human neuroprogenitor cells (NPCs) were expanded under proliferating conditions. NPCs were differentiated into neuron-rich cultures in the presence of a combination of neurotrophins. Neuronal markers were detected by immunofluorescence staining. To isolate a pure population of neurons, NPCs were differentiated on PEN membrane slides and laser capture microdissection was performed.

Microdissection laser de neurones à partir de cellules différenciées Neuroprogenitor humaines en culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or between the same cell type in health and disease or following pharmacologic treatments.&#160;In the spinal cord, such preparation from motor neurons, the target of interest in many neurologic and neurodegenerative diseases, is complicated by the fact that motor neurons represent &#60;10% of the total cell population.&#160;Laser capture microdissection (LMD) has been developed to address this problem.&#160;Here, we describe a protocol to quickly recover, freeze, and section mouse spinal cord to avoid RNA damage by endogenous and exogenous RNases, followed by staining with Azure B in 70% ethanol to identify the motor neurons while keeping endogenous RNase inhibited.&#160;LMD is then used to capture the stained neurons directly into guanidine thiocyanate lysis buffer, maintaining RNA integrity.&#160;Standard techniques are used to recover the total RNA and measure its integrity.&#160;This material can then be used for downstream analysis of the transcripts by RNA-seq and qRT-PCR.

High-quality total RNA has been prepared from cell bodies of mouse spinal cord motor neurons by laser capture microdissection after staining spinal cord sections with Azure B in 70% ethanol.&#160;Sufficient RNA (~40-60 ng) is recovered from 3,000-4,000 motor neurons to allow downstream RNA analysis by RNA-seq and qRT-PCR.

Production d’ARN pour l’analyse transcriptomique à partir de corps cellulaires de motoneurones de la moelle épinière de souris par microdissection de capture laser

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain in adulthood and during development. Although most in vivo approaches use a craniotomy to study brain regions located on the dorsal side, brainstem regions such as the pons, located on the ventral side remain relatively understudied. The main goal of this protocol is to facilitate access to ventral brainstem structures so that they can be studied in vivo using electrophysiological and imaging methods. This approach allows study of structural changes in long-range axons, patterns of electrical activity in single and ensembles of cells, and changes in blood brain barrier permeability in neonate animals. Although this protocol has been used mostly to study the auditory brainstem in neonate rats, it can easily be adapted for studies in other rodent species such as neonate mice, adult rodents and other brainstem regions.

A surgical method is described to expose the ventral skull in neonate rats. Using this approach it is possible to open a craniotomy to perform acute electrophysiology and two-photon microscopy experiments in the brainstem of anesthetized pups.

Une méthode pour faire un Craniotomie sur le crâne ventrale de nouveaux-nés Rongeurs

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

Neurones olfactifs obtenus à l&#39;aide biopsie nasale combinée avec laser-Microdissection: Une approche potentielle pour étudier la réponse au traitement dans les troubles mentaux

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, interactions with our environment can induce brain plasticity. Increasingly, research is trying to identify which environments stimulate brain plasticity beneficial for treating brain and behavioral disorders. Two environmental manipulations are described which increase or decrease the number of tyrosine hydroxylase immunopositive (TH+, the rate-limiting enzyme in dopamine (DA) synthesis) neurons in the adult mouse midbrain. The first comprises pairing male and female mice together continuously for 1 week, which increases midbrain TH+ neurons by approximately 12% in males, but decreases midbrain TH+ neurons by approximately 12% in females. The second comprises housing mice continuously for 2 weeks in &#8216;enriched environments&#8217; (EE) containing running wheels, toys, ropes, nesting material, etc., which increases midbrain TH+ neurons by approximately 14% in males. Additionally, a protocol is described for concurrently infusing drugs directly into the midbrain during these environmental manipulations to help identify mechanisms underlying environmentally-induced brain plasticity. For example, EE-induction of more midbrain TH+ neurons is abolished by concurrent blockade of synaptic input onto midbrain neurons. Together, these data indicate that information about the environment is relayed via synaptic input to midbrain neurons to switch on or off expression of &#8216;DA&#8217; genes. Thus, appropriate environmental stimulation, or drug targeting of the underlying mechanisms, might be helpful for treating brain and behavioral disorders associated with imbalances in midbrain DA (e.g. Parkinson&#8217;s disease, attention deficit and hyperactivity disorder, schizophrenia, and drug addiction).

This protocol describes two different environmental manipulations and a concurrent brain infusion protocol to study environmentally-induced brain changes underlying adaptive behavior and brain repair in adult mice.

Modulations environnementaux du mésencéphale Nombre de dopamine neurones chez la souris adulte

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.