מחקר זה נתמך על ידי Nationale de la משוכלל ונדיר סוכנות הידיעות (פרויקט ANR-2010-BLAN-1535) ועל ידי מענק מהאזור איל דה פרנס (DIM-Malinf 110058).

1. ייצור חלבון וטיהור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Mexa, MexB מPseudomonas aeruginosa <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך פלסמידים מחסה גנים Mexa וMexB בE. זן חיידק ייצור (למשל C43 DE3). צלחת על LB אגר בתוספת בינונית עם האנטיביוטיקה המתאימה. פיק מושבה אחת לחסן preculture O / N. למחרת בבוקר, לחסן preculture ב1 ליטר של LB ולגדול על 37 מעלות צלזיוס תחת תסיסה (240 סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתאים הגיעו לשלב מעריכי (OD 600 = 0.6-0.8) להשרות עם 1 מ&quot;מ IPTG. לבצע אינדוקציה ל2-3 שעות ב30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה (9,000 XG עבור 20 דקות) ו resuspend ב 30 מיליליטר טריס-HCl 20 מ&quot;מ, pH 8, NaCl 150 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבש את התאים באמצעות עיתונות צרפתית (10,000 psi, 4 פס). בטל תאים רצופים וגופי הכללה ידי צנטריפוגה ב9,000 XG עבור 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 שעות קרומים גלולה ב 100,000 XG וresuspend כל גלולה ב30 מיליליטר pH Bis-טריס 10 מ&quot;מ 7.4, גליצרול 20% (w / v), imidazole 10 מ&quot;מ, NaCl 500 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את ריכוז חלבון קרום הכולל באמצעות assay colorimetric BCA וsolubilize הקרומים O / N עם 2% maltoside dodecyl (DDM) בנפח סופי נקבע כך שחומר ניקוי: החלבון הוא 1:1.5 (w / w). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ultracentrifuge ב100,000 XG במשך שעה 1 להשליך חומרי solubilized ומצטברים שאינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את supernatant לשעה 2 ב 4 ° C עם שרף ניקל (טיהור Mexa) או שרף קובלט (טיהור MexB) equilibrated עם Bis-טריס pH 10 מ&quot;מ 7.4, 5% גליצרול (w / v), imidazole 10 מ&quot;מ, NaCl 500 מ&quot;מ, DDM 0.2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את השרף בעמודה ריקה. לאסוף את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השרף עם 50 מיליליטר של Bis-טריס pH 10 מ&quot;מ 7.4, 20% גליצרול (w / v), imidazole 10 מ&quot;מ, NaCl 500 מ&quot;מ, DDM 0.2%, ולאחר מכן עם 25 מיליליטר של Bis-טריס pH 10 מ&quot;מ 6, גליצרול 5% (w / v), imidazole 10 מ&quot;מ, NaCl 500 מ&quot;מ, DDM 0.2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute protein עם 20 מיליליטר Bis-טריס pH 10 מ&quot;מ 7.4, 5% גליצרול (w / v), imidazole 300 מ&quot;מ, NaCl 500 מ&quot;מ, DDM 0.2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכז את החלבון עם מכשיר אולטרה עד 3 מיליליטר ועומס על עמודת desalting equilibrated עם חיץ ללא imidazole. רגע לפני הכינון מחדש (ראה להלן), Ultracentrifuge חלבוני solubilized (100,000 XG עבור 20 דקות) כדי להיפטר משומנים וחלבונים unsolubilized. ואז לרכז את החלבון שוב ל0.3 מיליליטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Bacteriorhodopsin מsalinarium Halobacter <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאי salinarium Halobacter תחת תאורה על 37 מעלות צלזיוס במשך 10 ימים במדיום גידול נוזלי המכיל 4 NaCl M, MgSO 4 150 מ&quot;מ, ציטראט 10 מ&quot;מ, KCl 30 מ&quot;מ, L / 5 גרם תמצית שמרים, וpeptone 5 גר &#39;/ ל&#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבש את התאים על ידי dialyzing נגד המים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את הקרום הסגול על 30-40% (w / v) שיפוע סוכרוז (100,000 XG במשך 17 hr). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Solubilize ההשעיה הקרום עם octylgluc 2%oside ל24 שעות על 37 מעלות צלזיוס (נפח לsolubilization כדי resuspend הקרום בחומר ניקוי 2:01 (w / w): יחס חלבון). להעריך את הריכוז של BR solubilized באמצעות ε (570 ננומטר) = 54,000 M -1 cm -1. רגע לפני הכינון מחדש (ראה להלן), Ultracentrifuge BR solubilized (100,000 XG עבור 20 דקות) כדי להיפטר משומנים וחלבונים unsolubilized. הערה: קרומי הילידים מועשרים באופן טבעי בBR כך אין צורך בטיהור נוספת. </li></ol></li></ol> 2. הכנת Proteoliposomes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היווצרות Liposome: שים 400 μl של dOPC מומס בכלורופורם (25 מ&quot;ג / מיליליטר) בכוס זכוכית ולהוסיף 1.5 מ&quot;ג של כולסטרול מאוחסן כאבקה. לייבש אותם ממש לפני המניפולציה תחת אדים של חנקן או ואקום במשך שעה לפחות 1 בכוס זכוכית. DOPC: יחס טוחנת כולסטרול הוא 3.3:1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שהם מיובשים, מימה השומנים עם 1 מיליליטר של HEPES 25 pH מ&quot;מ 7,K 2 SO 4 100 מ&quot;מ, MgCl 2 2 מ&quot;מ, pyranine 2 מ&quot;מ. ההשעיה אמורה להופיע עכורה בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את הפתרון עבור 10 דקות ב37 ° C. Sonicate 10 דקות ב W 40 עם 30 דופק שניות, 30 מחזורי הפסקה שניות ב RT. ההשעיה צריכה להופיע ברורה בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג אוכלוסיית monodisperse של ליפוזומים, לבצע שני מחזורים של חול ולכל מחזור, להעביר את ההשעיה יפוזום דרך המסנן לפחות 11x. למחזור הראשון, השתמש בגודל נקבובית קרום של 200 ננומטר ולמחזור השני, השתמש בגודל נקבובית קרום של 100 ננומטר. ניתן לבצע מדידות פיזור אור דינאמי בשלב זה כדי לבדוק את ההומוגניות של ההשעיה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שילוב חלבון ניתן מחדש חלבונים בממברנה ביפוזומים הודות להשפעת solubilizing של חומרי ניקוי: עיקרון. ליפוזומים solubilized-דטרגנט מודגרת עם חלבון אבקת-solubilized הממברנה והיווצרות של proteoliposomes מופעל על ידי חיסול מהיר של חומר הניקוי עם חרוזי פוליסטירן 9. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 28 מ&quot;ג של טריטון X-100 (0.56% סופיים) ו דגירה O / N ב 4 ° C (טמפרטורת solubilization יכולה להיות מותאמת לנחקר החלבון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את חלבון אבקת-solubilized (BR, MexB וMexa) ליפוזומים solubilized דגירה 15 דקות ב 4 ° C. מוסיף את החלבונים להשעית יפוזום solubilized ביחסים הבאים (w / w): שומנים / MexB = 20, MexB / Mexa = 2.5, ושומנים / BR = 30. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף חרוזי פוליסטירן ב30:1 חרוזים: יחס חומרי ניקוי (w / w, בהתחשב במשקל הכולל של חומר ניקוי, כולל חומרי ניקוי נוספים עם החלבונים המטוהרים) ודגירת שעה 5, בחושך (בגלל BR) ב RT תחת עדין ערבוב. לפני הליך זה, להפעיל את biobeads עם מתנול ודגירת אתנול והרחבה לשטוף עם מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את חלבון proteoliposomes ומצעים בחינם באמצעות PD-10טור desalting equilibrated עם HEPES pH 25 מ&quot;מ 7, K 2 SO 4 100 מ&quot;מ וMgCl 2 2 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את proteoliposomes ב18 ° C בחושך לתקופה של עד 2-3 שבועות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכה של יעילות הכינון מחדש בשיפוע סוכרוז. כדי לבדוק ששני MexB וBR כבר מחדש בליפוזומים, לטהר את ההשעיה proteoliposome על שיפוע סוכרוז רציף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להתיישב proteoliposomes בשיפוע חמש שכבה של סוכרוז (60%, 20%, 10%, 5%, ו2.5% w / v). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ultracentrifuge ל17 שעות ב 100,000 XG (עם מינימאלי תאוצה ושיעורי האטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף בזהירות את שברי השונים שיפוע (בעיקר את הממשקים בין כל שכבה של סוכרוז) ולנתח אותם ב- SDS (10%) באמצעות מכתים Coomassie או מערבי סופג. חלבונים מצטברים נמצאים בחלק התחתון של הצינור, בעוד חלבוני nonincorporated, חומרי ניקוי-solubilized נמצאים בחלק העליון שלהצינור. Proteoliposomes ויפוזומים נמצאים בממשקים סוכרוז שהמתאימים לצפיפות הפנימית שלהם. ליפוזומים ריקים הם התאוששו במעלה בשיפוע מאשר proteoliposomes. </li></ol></li></ol> 3. מדידת הקרינה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מדידות הקרינה ב25.0 מעלות צלזיוס באמצעות spectrofluorometer מאפשר למדידות כפול אורך גל (מנורת Xe, 150 W). תקופות חלופי תאורה (כדי להפעיל BR עם אורכי גל עירור / פליטה של ​​550 ננומטר / 550 ננומטר) ומדידות הקרינה באורכי גל עירור / פליטה של ​​455 ננומטר ננומטר / 509 במשך 2 שניות כדי למדוד את הקרינה pyranine. הגדר את רוחבי פס העירור ופליטה ל5 ננומטר. לבצע את המדידות בנוכחות 50 valinomycin ננומטר כדי למנוע היווצרות של ΔΨ פוטנציאל הממברנה הפוך. הערה: אכן, בגלל BR משאבות פרוטונים, יש מטענים חיוביים יותר פנימי של יפוזום יותר מאשר בחוץ. חיוב זהשיפוע יכול להיות מושלך באמצעות valinomycin, שהיא K + ionophore סלקטיבית. הוסיף פעם אחת לvalinomycin ההשעיה ליפוזומים, כמולקולה הידרופובי, יחדיר לתוך קרום יפוזום, פסיבי להעביר K +, ולכן להתפוגג ΔΨ פוטנציאל הממברנה. </li></ol>

<ol>
	<li>Granseth, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+structural+biology+-+How+far+can+the+bugs+take+us?+(Review).">Membrane protein structural biology - How far can the bugs take us? (Review).</a> Molecular Membrane Biology. 24 (5-6), 329 (2007).</li><li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+resistance+in+bacteria.">Multidrug resistance in bacteria.</a> Annu Rev Biochem. 78, 119 (2009).</li><li>Pos, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+transport+mechanism+of+the+AcrB+efflux+pump.">Drug transport mechanism of the AcrB efflux pump.</a> Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 782 (2009).</li><li>Murakami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+a+multidrug+transporter+reveal+a+functionally+rotating+mechanism.">Crystal structures of a multidrug transporter reveal a functionally rotating mechanism.</a> Nature. 443 (7108), 173 (2006).</li><li>Seeger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Asymmetry+of+AcrB+Trimer+Suggests+a+Peristaltic+Pump+Mechanism.">Structural Asymmetry of AcrB Trimer Suggests a Peristaltic Pump Mechanism.</a> Science. 313 (5791), 1295 (2006).</li><li>Sennhauser, G., Bukowska, M. A., Briand, C., Grutter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+multidrug+exporter+MexB+from+Pseudomonas+aeruginosa.">Crystal structure of the multidrug exporter MexB from Pseudomonas aeruginosa.</a> J Mol Biol. 389 (1), 134 (2009).</li><li>Su, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+CusBA+heavy-metal+efflux+complex+of+Escherichia+coli.">Crystal structure of the CusBA heavy-metal efflux complex of Escherichia coli.</a> Nature. 470 (7335), (2011).</li><li>Nikaido, H., Takatsuka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+RND+multidrug+efflux+pumps.">Mechanisms of RND multidrug efflux pumps.</a> Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 769 (2009).</li><li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods in enzymology. 372, 65 (2003).</li><li>Aires, J. R., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoglycosides+are+captured+from+both+periplasm+and+cytoplasm+by+the+AcrD+multidrug+efflux+transporter+of+Escherichia+coli.">Aminoglycosides are captured from both periplasm and cytoplasm by the AcrD multidrug efflux transporter of Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 187 (6), 1923 (2005).</li><li>Picard, M., Verchere, A., Broutin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+active+transport+of+efflux+pumps+after+their+reconstitution+into+proteoliposomes:+caveats+and+keys.">Monitoring the active transport of efflux pumps after their reconstitution into proteoliposomes: caveats and keys.</a> Anal Biochem. 420 (2), 194 (2012).</li><li>Verchere, A., Dezi, M., Broutin, I., Picard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Protein+Purification+and+Analysis,+edited+by+iConcept+Press.">Basic Methods in Protein Purification and Analysis, edited by iConcept Press.</a> , (2012).</li><li>Verchere, A., Broutin, I., Picard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-induced+proton+gradients+for+the+in+vitro+investigation+of+bacterial+efflux+pumps.">Photo-induced proton gradients for the in vitro investigation of bacterial efflux pumps.</a> Sci Rep. 2, 306 (2012).</li></ol>

אין מה לחשוף.

אנו מתארים הליך הכינון מחדש מיועד למנסה לאמוד תחבורת חלבון קרום. הוקם פעם, הליך הכינון מחדש החלבון מוביל למדידות, כי הם מאוד לשחזור. עם זאת, התנאים המדויקים עבור בנייה מחדש של החלבונים משתנים מחלבון אחד למשנו. טיפול הרבה חייב להילקח באופטימיזציה של הפרמטרים הבאים: א) איכות הטיהור (טוהר והעדר החומר מצטבר); ii) יעילות של צעד solubilizing חומר הניקוי (במידת האפשר, חומרי ניקוי CMC נמוכים צריכים להיות מועדף משום שהם קלים יותר לקבל להיפטר מ); iii) desorption של חומרי הניקוי (זה למשל ניתן לשלב את השימוש בחרוזי פוליסטירן בצעד דיאליזה אבל זה עלול להשפיע על שיעור desorption, פרמטר קריטי לפעילות הבאה של החלבון, ראה נ&quot;צ [ 9]); ד) הכינון מחדש שומנים (האופי הכימי של השומנים בדם, השומנים בדם ליחס חלבון, הנוכחות של amphiph נוסףIles הם פרמטרים קריטיים שחייבים להיות מגוון ומותאם). בטמפרטורה בנוסף וזמן דגירה משפיע על כל הנושאים הללו. בקרת איכות היא אפוא קדמונית בכל שלב של הליך הכינון מחדש. מנקודת מבט זו, פיזור אור הוא טכניקה מאוד נוחה כי זה מהיר, הורסות, וזה רק דורש 20 μl של מדגם בריכוז בטווח מייקרו. ברגע שproteoliposomes נוצרים, שיפוע סוכרוז גם הוא לעזר רב משום שהיא פותחת את הדרך לאימות שיטתית של הכינון מחדש: איכותי (הוא החלבון אכן משובץ לתוך קרום יפוזום), כמו גם כמותית (כמה חלבון ביפוזום אחד). זה האחרון יהיה לטפל על ידי בדיוק מדידת החלבון וריכוזי שומנים בדם. assay שלנו אינו מסתמך על טיטרציה של המצע עצמו וזה נמנע משיקולים שלא בנוח בנוגע לדיפוזיה פסיבית artifactual האפשרי של<html> המולקולה בשל מחיצות הידרופובי בקרום. Assay מנצל מאפיינים של pyranine כמו בדיקה אמינה וכמותי לשינויי pH הניטור. התוצאות שלנו הן בהסכם עם תוצאות שהושגו בהליך אחר שבו היווצרות שיפוע הפרוטון בוצעה באמצעות valinomycin 10, אבל זה מאפשר שיפוע חזק יותר ולשעתק 11. בנוסף, שיפוע הפרוטון יכול להיות מכוון בדיוק, פשוט על ידי שינוי הריכוז של החיץ (לפרטים נוספים ראה Verchere et al. 12). בהליך מדידת שליטה מתבצעת ראשונה בהיעדרו של מצע (זה נותן גישה לפעילות הפסיבית של החלבון). פעילות טרנספורטר חלבון קרום בפועל לאחר מכן נמדדת לאחר המצע כבר הוסיף באותו קובט. זה באמת נכס, כי הניסוי יכול להיחשב כתוצאה אמיתית, שאינה דו משמעית, הנגרם מצע. אף אוזן גרון &quot;&gt; הפרוטוקול יכול להיות מותאם לתפוקה גבוהה בינונית (למשל מדידות 96 בארות) אוטומציה כי מאיר את המדגם מעורר את התגובה. האוטומציה ועמות יהיו מורכבות בהכנת קבוצה גדולה של proteoliposome, ומחלק aliquots ב96 בארות צלחת. מצעים (וגם מעכבים אפשריים) אז היו ניתן להוסיף ולאחר הדגירה בחושך במשך 45 דקות הצלחת תהיה נתון למחזורי מדידת הקרינה התאורה / pyranine על קורא microplate. לקבלת מידע נוסף על הפרוטוקול, קוראים מוזמנים לקרוא Verchere et al. 12,13

חלבוני קרום נפרד מייצגים עד 30% מהגנים המקודדים בגנום אוקריוטים. הם חולקים בתפקידים מרכזיים כגון שמירה על שער (קולטנים), הובלת חומרים מזינים, יונים או תרכובות רעילים (מובילים) או שמירה של החדירות פני bilayers קרום (ערוצים) בין כל תאי החיים 1. בזרימת משאבות יש להם תפקיד מרכזי בהתנגדות נגד טיפול אנטיביוטי 2. בחיידקים גראם השליליים, Pseudomonas aeruginosa, אשר מוגנו על ידי קרום חיצוני, מובילי זרימה מאורגנים כמערכות משולשת שבו MexB, המשאבה בזרימת הממוקמת בקרום הפנימי, עובדת בשיתוף עם Mexa, חלבון periplasmic, וOprM, ערוץ קרום חיצוני. חלבון הקרום הפנימי cytoplasmic פועל כמשאבת אנרגיה תלויה עם סגוליות מצע רחבות. חלבון הקרום החיצוני פועל כPorin ואילו שליש נמצא בשטח periplasmic והוא חשב על מנת לייצב את המכלול השלם <sעד&gt; 3. בחלק הבא, אנו מתמקדים בעיצוב של assay פונקציונלי להרכבת Mexa MexB. מידע מבני נצבר במשך 5 השנים האחרונות הודות לנחישות רנטגן של AcrB החלבון הומולוגי מEscherichia coli 4-7. למרות שזה ברור שחשוב לבני זוג מידע כזה עם נתונים דינמיים והקינטית, עיצוב assay פונקציונלי לטרנספורטר הזה הוא אתגר אמיתי 8. ואכן, חלבוני הקרום חייבים להישמר בסביבה קרומית ותא סגור חייב להישמר לתחבורת וקטורים של מצע להיות מושגת. הכינון מחדש של חלבונים בממברנה לproteoliposomes כבר הציג בהרחבה וביקורת (ראה ריגו ו9 לוי). פרוטוקולים כגון לאפשר הניטור של פעילות חלבונים בממברנה, למשל על ידי ביצוע מצעים פני קרום יפוזום. במקרה זה נובעות ממגבלותvailability של מצעי titratable (ניאון, רדיואקטיבי, וכו &#39;.) ומן העובדה כי לעתים קרובות מאוד מצעים אלה הם הידרופובי ויש נטייה לחצות קרומים ללא קשר לנוכחות של טרנספורטר. כחלופה, אפשר לעקוב וריאציות ספקטרוסקופיות של צבע דיווח רגיש לשינויים כימיים המתרחשים כתוצאה מהובלה. כאמור לעיל, פרוטונים להמריץ תחבורה באמצעות MexB. לפיכך, אפשרות רלוונטית היא לפקח וריאציות ספקטרוסקופיות של צבע דיווח pH רגיש לעקוב וריאציות pH כתוצאה מהובלת מצע מונחה פרוטון. הבחירה של צבע פלואורסצנטי תמנע תופעות artifactual בשל האופי ההידרופובי של המצע. קושי נוסף הוא הדור של שיפוע פרוטון. ניתן למצוא כמה פרוטוקולים בספרות. ביניהם, השימוש בטכניקת valinomycin הוא נפוץ אך שהראינו שזה מייגע לבצע 10-11. יתר על כן הואלא לשחזור וזה לא הפיך. אנחנו נקטו השימוש בbacteriorhodopsin (BR), משאבת פרוטון אור הופעל מsalinarium Halobacter, archaeon halophilic הימי גראם שלילי לחייב אירובי. חלבון זה coreconstituted ליפוזומים עם MexB ו, על תאורה, BR משאבות פרוטונים בתוך ליפוזומים ולכן יוצר ΔpH (חומצי בפנים) נדרש על ידי החלבון להעביר את המצע 12-13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1051">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:344px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:344px;">850375C</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:344px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">C8667</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:344px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">B2261</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:344px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">93427</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Valinomycin</td>
			<td style="width:344px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">V-1644</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Pyranine (8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid)</td>
			<td style="width:344px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">H-348</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">DDM (n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside)</td>
			<td style="width:344px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:344px;">D310LA</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Extruder kit (extruder, Hamilton gas-tight syringes)</td>
			<td style="width:344px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:344px;">610000</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Biobeads SM-2 Adsorbents</td>
			<td style="width:344px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:344px;">152-3920</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Econo-Pac Chromatography empty column</td>
			<td style="width:344px;">Biorad</td>
			<td style="width:344px;">732-1010</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Desalting columns</td>
			<td style="width:344px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:344px;">54805</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">Dynamic light scattering instrument</td>
			<td style="width:344px;">Wyatt Technology</td>
			<td style="width:344px;">DynaPro NanoStar</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">Fluorometer JASCO FP-6200</td>
			<td style="width:344px;">JASCO</td>
			<td style="width:344px;">6816-J002A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro investigation of the mexab efflux pump from pseudomonas aeruginosa

קיים צורך מדעי המתעוררים לכלים אמינים לניטור תחבורת חלבון קרום. אנו מציגים מתודולוגיה שהובילה לכינון מחדש של משאבות בזרימת מaeruginosa Pseudomonas חיידקים גראם שליליים בסביבת biomimetic המאפשר חקירה מדויקת של פעילותם של תחבורה. שלושה תנאים מוקדמים מתקיימים: מידור בסביבה lipidic, שימוש במדד רלוונטי להובלה, ודור של שיפוע פרוטון. טרנספורטר חלבון הקרום מחדש ליפוזומים יחד עם bacteriorhodopsin, משאבת פרוטון אור הופעל שיוצרת שיפוע פרוטון שהוא חזק, כמו גם הפיך ומתכונן. הפעילות של החלבון היא להסיק מוריאציות ה-pH המתרחשות בתוך יפוזום, באמצעות pyranin, בדיקה ניאון pH תלוי. אנו מתארים הליך צעד אחר צעד שבו טיהור חלבוני קרום, היווצרות יפוזום, הכינון מחדש חלבון, ותחבורהnalysis מטופלות. למרות שהם תוכננו במיוחד עבור טרנספורטר RND, השיטות המתוארות עלולות להיות מותאמות לשימוש עם כל טרנספורטר חלבון קרום אחר אנרגיה על ידי שיפוע פרוטון.

Assay מורכב מניטור הקרינה pyranine כפונקציה של זמן, בעוד שיפוע פרוטון שנוצר. לצורך כך, דגימות נתון לחלופין לתאורה (ומכאן שאיבת פרוטון על ידי BR מופעל) ולאחר מכן פלואורסצנטי מדידה באמצעות העירור ופליטת אורכי גל של pyranine (λ לשעבר = 455 ננומטר וλ em = 509 ננומטר). איור 1 מציג שליטה שהושגה עם נציג assay, בהעדר Mexa / MexB, שאימת כי שיפוע הפרוטון שנוצר על ידי BR הוא הפיך. לאחר מחזור אחד של החמצה, proteoliposomes נשמרים בחושך במשך 45 דקות על מנת שBR להפסיק שאיבת פרוטונים (פרוטונים מפוזר באיטיות ובאופן פסיבי על פני bilayers השומנים הבאים מפל הריכוזים שלהם). לאחר זמן התאוששות זו, הפעלה של BR היא אפשרית, פשוט על ידי המאיר אותה ההשעיה שוב. איור 2מתאים למדידת הובלה בפועל. בקרה שלילית עם ליפוזומים בחינם חלבון מראה כי, כצפוי, את ה-pH היא קבועה על תאורה (2A דמויות ו2B, עיגולים כתומים). עם זאת, proteoliposomes מכיל BR בקרומים שלהם אין משאבת פרוטון, ובכך ה-pH בתוך ירידות יפוזום ושיפוע יציב בנוי (2A דמויות ו2B, ריבועים סגולים). משולשים אפורים ויהלומים אדומים (איור 2 א) לייצג את ה-pH בתוך proteoliposomes מכיל BR וMexB, בנוכחות או בהעדר Hoechst 33342, בהתאמה. אנו צופים פעילות מצע עצמאי שבו שיפוע הפרוטון מתפזר באופן חלקי בלבד על ידי נגד תחבורת MexB. אנו מייחסים את תצפית זו לפעילות בסיס של MexB. על מנת לבחון את ההשפעה של Mexa על פעילות MexB, Mexa התווסף לכינון מחדש, תחילה בהיעדר כל מצע ( <strong&gt; איור 2 ב, יהלומים כחולים). שוב, שיפוע הפרוטון שנוצר על ידי BR מתפזר באופן חלקי בלבד. מדידת ההובלה בפועל הוא הבין באותו המדגם. לפני כן, שיפוע הפרוטון יש reinitialized והמצע יש להוסיף בהשעיה על מנת להגיע לאתר הקישור שלו בחלבון. למטרה זו ההשעיה מודגרות בחושך בנוכחות המצע 45 דקות. עם תאורה שלאחר מכן, ניתן לראות כי שיפוע הפרוטון שנוצר על ידי BR כעת התפוגג לחלוטין על ידי MexAB (תרשים 2B, משולש ירוק), כתוצאה מתחבורת מצע על ידי המשאבה. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1.jpg" /> . איור 1 הפיכות של שיפוע הפרוטון נבנה על ידי תאורת BR: Pyranine fluorescence של proteoliposomes BR נמדד כפונקציה של זמן. מ0-15 דק &#39;, BR משאבות פרוטונים כתוצאה מהפעלת אור. מ15-60 דקות, proteoliposomes מודגרת בחושך; בתקופה זו, באופן פסיבי פרוטונים לנוע מחוץ ליפוזומים עד pH intravesicular וpH extravesicular שווים. מ60-75 דק &#39;, BR הוא עדיין פונקציונלי ומשאבות פרוטונים על תאורה. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2.jpg" /> . איור 2 התחבורה assay: הקרינה pyranine, שהומרה לוריאציות pH המתאימות, כפונקציה של זמן pH) בתוך ליפוזומים שליטה (עיגולים כתומים); pH בתוך proteoliposomes מכיל BR בקרום (ריבועים סגולים); pH בפנים. של proteoliposomes מכיל BR, וMexB בקרום ללא Hoechst 33,342 (ד האדוםiamonds); pH בתוך proteoliposomes מכיל BR וMexB בקרום עם Hoechst 33,342 (משולשים אפורים) B-pH) בתוך ליפוזומים שליטה (עיגולים כתומים);. pH בתוך proteoliposomes מכיל BR בקרום (ריבועים סגולים); pH בתוך של proteoliposomes מכיל BR, MexB וMexa בקרום ללא Hoechst 33,342 (יהלומים כחולים); pH בתוך proteoliposomes מכיל BR, MexB וMexa בקרום עם Hoechst 33,342 (משולשים ירוק).

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa at JoVE.com

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

אנו מציגים פרוטוקול לחקירה במבחנה של משאבות בזרימת מPseudomonas aeruginosa. פרוטוקול זה מאפשר לדור של שיפוע פרוטון חזק, הפיך, ומתכונן בתוך קרום יפוזום ולכן צריך להיות מותאם לכל חלבון קרום אנרגיה על ידי כוח protomotive.

במבחנה של החקירה וMexAB זרימת המשאבה מPseudomonas aeruginosa

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution ...

in-vitro-investigation-mexab-efflux-pump-from-pseudomonas

Research

JoVE Journal

Biology

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

11.8K Views.  CNRS & Université Paris Descartes.  אנו מציגים פרוטוקול לחקירה במבחנה של משאבות בזרימת מPseudomonas aeruginosa. פרוטוקול זה מאפשר לדור של שיפוע פרוטון חזק, הפיך, ומתכונן בתוך קרום יפוזום ולכן צריך להיות מותאם לכל חלבון קרום אנרגיה על ידי כוח protomotive. 

Video: In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

דור מהיר של עמילואיד מחלבונים שפת אם<em&gt; במבחנה</em

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the homogenization of the tissue of interest that could potentially cause changes in the metabolic pathways being studied1. Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful analytical tool that can provide spatial information of analytes within intact slices of biological tissue samples1-5. This technique has been used extensively to study various types of compounds including proteins, peptides, lipids, and small molecules such as endogenous metabolites. With matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MSI, spatial distributions of multiple metabolites can be simultaneously detected. Herein, a method developed specifically for conducting untargeted metabolomics MSI experiments on legume roots and root nodules is presented which could reveal insights into the biological processes taking place. The method presented here shows a typical MSI workflow, from sample preparation to image acquisition, and focuses on the matrix application step, demonstrating several matrix application techniques that are useful for detecting small molecules. Once the MS images are generated, the analysis and identification of metabolites of interest is discussed and demonstrated. The standard workflow presented here can be easily modified for different tissue types, molecular species, and instrumentation.

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful tool that can be used to discover and identify various chemical species in intact tissues, preserving the compounds in their native environments, which can provide new insights into biological processes. Herein a MSI method developed for the analysis of small molecules is described.&#160;

ההדמיה MALDI-Mass Spectrometric לחקירת במטבוליטים<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; רוט גושים

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells. In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on unsynchronized cells making it difficult to order the temporal events required for cell cycle progression, genome replication, and division. Caulobacter crescentus provides an excellent model system for the bacterial cell cycle whereby cells can be rapidly synchronized in a G0 state by density centrifugation. Cell cycle synchronization experiments have been used to establish the molecular events governing chromosome replication and segregation, to map a genetic regulatory network controlling cell cycle progression, and to identify the establishment of polar signaling complexes required for asymmetric cell division. Here we provide a detailed protocol for the rapid synchronization of Caulobacter NA1000 cells. Synchronization can be performed in a large-scale format for gene expression profiling and western blot assays, as well as a small-scale format for microscopy or FACS assays. The rapid synchronizability and high cell yields of Caulobacter make this organism a powerful model system for studies of the bacterial cell cycle.

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.

סנכרון של<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; לחקירה של מחזור תא החיידק

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The contractile characteristics can be evaluated independently of external influences such as vascular tonus or neurohumoral status. It depicts a scientific approach between single cell measurements with isolated cardiac myocytes and in vivo studies like echocardiography. Thus, papillary muscle preparations serve as an excellent model to study cardiac physiology/pathophysiology and can be used for investigations like the modulation by pharmacological agents or the exploration of transgenic animal models. Here, we describe a method of isolating the murine left anterior papillary muscle to investigate cardiac contractility in an organ bath setup. In contrast to a muscle strip preparation isolated from the ventricular wall, the papillary muscle can be prepared in toto without damaging the muscle tissue severely. The organ bath setup consists of several temperature-controlled, gassed and electrode-equipped organ bath chambers. The isolated papillary muscle is fixed in the organ bath chamber and electrically stimulated. The evoked twitch force is recorded using a pressure transducer and parameters such as twitch force amplitude and twitch kinetics are analyzed. Different experimental protocols can be performed to investigate the calcium- and frequency-dependent contractility as well as dose-response curves of contractile agents such as catecholamines or other pharmaceuticals. Additionally, pathologic conditions like acute ischemia can be simulated.

Murine left ventricular papillary muscle can be used to investigate cardiac contractility in vitro. This article describes in detail the isolation and experimental protocols to study cardiac contractile characteristics.

מדידות התכווצות שרירים בpapillary מבודדים לחקירת הלב Inotropy בעכברים

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic homeostasis have been extensively studied by HSC researchers. Mitochondrial activity levels are reflected in their membrane potentials (&#916;&#936;m), which can be measured by cell-permeant cationic dyes such as TMRM (tetramethylrhodamine, methyl ester). The ability of efflux pumps to extrude these dyes from cells can limit their usefulness, however. The resulting measurement bias is particularly critical when assessing HSCs, as xenobiotic transporters exhibit higher levels of expression and activity in HSCs than in differentiated cells. Here, we describe a protocol utilizing Verapamil, an efflux pump inhibitor, to accurately measure &#916;&#936;m across multiple bone marrow populations. The resulting inhibition of pump activity is shown to increase TMRM intensity in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), while leaving it relatively unchanged in mature fractions. This highlights the close attention to dye-efflux activity that is required when &#916;&#936;m-dependent dyes are used, and as written and visualized, this protocol can be used to accurately compare either different populations within the bone marrow, or the same population across different experimental models.

Xenobiotic efflux pumps are highly active in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and cause extrusion of TMRM, a mitochondrial membrane potential fluorescent dye. Here, we present a protocol to accurately measure mitochondrial membrane potential in HSPCs by TMRM in the presence of Verapamil, an efflux pump inhibitor.

שיפור הדיוק של הערכה להערכת הזרימה של הפוטנציאל לממברנה מיטוכונדריאלי בתאי המטפאות ובתאים באמצעות עיכוב של משאבות אפלוקס

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

בידוד גרעינים מכליה של עכבר בוגר לריצוף RNA של גרעין יחיד

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the zebrafish cardiovascular tissues have been limiting in studying their electrophysiological properties. Previous methods have been described for dissection of zebrafish hearts and isolation of ventricular cardiac myocytes. However, the isolation of zebrafish atrial and vascular myocytes for electrophysiological characterization was not detailed. This work describes new and modified enzymatic protocols that routinely provide isolated juvenile and adult zebrafish ventricular and atrial cardiomyocytes, as well as vascular smooth muscle (VSM) cells from the bulbous arteriosus, suitable for patch-clamp experiments. There has been no literary evidence of electrophysiological studies on zebrafish cardiovascular tissues isolated at embryonic and larval stages of development. Partial dissociation techniques that allow patch-clamp experiments on individual cells from larval and embryonic hearts are demonstrated.

The present protocol describes the acute isolation of viable cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval, and embryonic zebrafish (Danio rerio), suitable for electrophysiological studies.

בידוד תאי שריר חלק לבביים וכלי דם מדגי זברה בוגרים, צעירים, זחליים ועובריים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic bacteria of special relevance for a wide number of hosts. P. syringae enters the plant from the leaf surface and multiplies rapidly within the apoplast, forming microcolonies that occupy the intercellular space. The constitutive expression of fluorescent proteins by the bacteria allows for visualization of the microcolonies and monitoring of the development of the infection at the microscopic level. Recent advances in single-cell analysis have revealed the large complexity reached by clonal isogenic bacterial populations. This complexity, referred to as phenotypic heterogeneity, is the consequence of cell-to-cell differences in gene expression (not linked to genetic differences) among the bacterial community. To analyze the expression of individual loci at the single-cell level, transcriptional fusions to fluorescent proteins have been widely used. Under stress conditions, such as those occurring during colonization of the plant apoplast, P. syringae differentiates into distinct subpopulations based on the heterogeneous expression of key virulence genes (i.e., the Hrp type III secretion system). However, single-cell analysis of any given P. syringae population recovered from plant tissue is challenging due to the cellular debris released during the mechanical disruption intrinsic to the inoculation and bacterial extraction processes. The present report details a method developed to monitor the expression of P. syringae genes of interest at the single-cell level during the colonization of Arabidopsis and bean plants. The preparation of the plants and the bacterial suspensions used for inoculation using a vacuum chamber are described. The recovery of endophytic bacteria from infected leaves by apoplastic fluid extraction is also explained here. Both the bacterial inoculation and bacterial extraction methods are empirically optimized to minimize plant and bacterial cell damage, resulting in bacterial preparations optimal for microscopy and flow cytometry analysis.

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

The present protocol describes a method that allows single-cell gene expression analysis on Pseudomonas syringae populations grown within the plant apoplast.

אנליזה חד-תאית של ביטוי גנים של מזרקי Pseudomonas בתוך רקמת הצמח

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...

חקירת מנגנון הובלת אבץ בתאי יונקים באמצעות בדיקת FluoZin-3

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured indirectly by determining the expression level of the transporter under different concentrations of Zn2+. This was done by utilizing immunohistochemistry, measuring mRNA in the tissue, or determining the cellular Zn2+ levels. With the development of intracellular Zn2+ sensors, the activities of zinc transporters are currently primarily determined by correlating changes in intracellular Zn2+, detected using fluorescent probes, with the expression of the Zn2+ transporters. However, even today, only a few labs monitor dynamic changes in intracellular Zn2+ and use it to measure the activity of zinc transporters directly. Part of the problem is that out of the 10 zinc transporters of the ZnT family, except for ZnT10 (transports manganese), only zinc transporter 1 (ZnT1) is localized at the plasma membrane. Therefore, linking the transport activity to changes in the intracellular Zn2+ concentration is hard. This article describes a direct way to determine the zinc transport kinetics using an assay based on a zinc-specific fluorescent dye, FluoZin-3. This dye is loaded into mammalian cells in its ester form and then trapped in the cytosol due to cellular di-esterase activity. The cells are loaded with Zn2+ by utilizing the Zn2+ ionophore pyrithione. The ZnT1 activity is assessed from the linear part of the reduction in fluorescence following the cell washout. The fluorescence measured at an excitation of 470 nm and emission of 520 nm is proportional to the free intracellular Zn2+. Selecting the cells expressing ZnT1 tagged with the mCherry fluorophore allows for monitoring only the cells expressing the transporter. This assay is used to investigate the contribution of different domains of ZnT1 protein to the transport mechanism of human ZnT1, a eukaryotic transmembrane protein that extrudes excess zinc from the cell.

מחבר זרקור: חקר ויסות אבץ תאי באמצעות פונקציונליות ZnT1 

Zinc transport has proven challenging to measure due to the weak causal links to protein function and the low temporal resolution. This protocol describes a method for monitoring, with high temporal resolution, Zn2+ extrusion from living cells by utilizing a Zn2+ sensitive fluorescent dye, thus providing a direct measure of Zn2+ efflux.

אפיון מובילי אבץ של יונקים באמצעות בדיקת הובלת אבץ חוץ גופית

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...