המחברים רוצה להודות אריק Fishback (אוניברסיטת דה מוין, דה מוין, איווה, ארה ב) לסיוע שלו עם ירי ועריכת הוידאו. תאי פיברובלסט דמוי PS120 stably לבטא NHE3-wt או NHE3-YRK נמסרו באדיבות מאת ד ר מארק במושבים. שבהם (ג'ונס הופקינס הספר לרפואה של אוניברסיטת, בולטימור, MD, ארצות הברית).

הערה: שני מגברים נדרשים עבור הקלטת הפעילות של מובילי electroneutral על ידי ISE הפניה עצמית בשיתוף עם תיקון מחבר חובק למעקה, מגבר מלחציים תיקון כדי לשמור על התא תצורה של כל תא, (מגבר של impendence גבוהה אלקטרומטר) כדי להקליט הפעילות טרנספורטר באמצעות ISE (ראה טבלה של חומרים). תיקון קלאמפ המגבר מחובר ישירות ללוח הרכישה מסוף. אלקטרומטר קשורה המגבר הדיפרנציאלי מנוצל כדי לסנן ומגבירים את האות. המגבר הדיפרנציאלי מחובר ללוח הרכישה מסוף. Capmeter, תוכנה מלחציים תיקון מפקח על קיבולת תא, שימש מחקרים קודמים20 (ראה טבלה של חומרים). הפתרונות קאמרית זלוף הקלטה נשמרים ב- 37 מעלות צלזיוס.
1. הכנה של מדי סוכר ISEs
<ol><li>משוך את פיפטות של נימים זכוכית בורוסיליקט הקוטר החיצוני של 1.2 מ מ (ראה טבלה של חומרים) באמצעות פיפטה פולר2 .</li>
	<li>פולנית על פיפטה באמצעות את microforge. הקוטר של קצה פיפטה צריכה להיות 2-3 מיקרומטר.</li>
	<li>מקם את פיפטות בעל צנצנת פיפטות עם קצה פיפטה פונה כלפי מעלה (ראה טבלה של חומרים). שים לב: בצע שלבים 1.4-1.6 בשכונה fume כימי מאוורר היטב.</li>
	<li>לערבב את התערובת siliconization המורכבת טיפה 1 (~ 150 µL) של bis (דלמטלמינו) דימתיל silane ו 10 טיפות של tetrachloride פחמן (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>שופכים את התערובת siliconization לתוך הצנצנת וסגור המכסה הדוק.</li>
	<li>דגירה את הצנצנת עם התערובת siliconization במשך 24-48 שעות בשכונה fume כימי בטמפרטורת החדר עד התערובת הוא התאדו לגמרי.</li>
	<li>מילוי רקע פיפטה עם שרף יון סלקטיבי המתאים כדי ליצור עמודה של 2-4 מ מ. הערה: מימן ionophore אני קוקטייל B יכול להיות פעילות NHE לבנייתם הקלטה (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>הקש על קצה פיפטה להפיץ שרף סלקטיבית יון עד הקצה, ולמקם את פיפטה בצורה אנכית בתוך המחזיק צנצנת עם קצה פיפטה למטה.</li>
	<li>מתחת למיקרוסקופ ויבתר הקוקטייל שרף הגיע הסוף של הקצה. אם יש צורך, הפעילו לחץ חיובי כדי לדחוף את השרף עד הסוף.</li>
	<li>מילוי החצי-פיפטה עם הפתרון המתאים (~ 100 μL). . הנה, תשתמש 100 מ מ אשלגן ו- 10 מ מ HEPES ב- pH 7.0 אם משתמש ionophore אני קוקטייל B.</li>
	<li>להתחבר את ISE אלקטרומטר ולמקם את קצה ISE בתוך תמיסת אמבט משמש הקלטה. אפס את אלקטרומטר.</li>
	<li>בדיקת ה+-תגובה סלקטיבית ISE על-ידי שינוי ה-pH של התמיסה אמבט. ה ממוצע+-התגובה ISE סלקטיבית היא ~ 58 mV ליחידה של pH.</li>
	<li>מעת לעת להעריך את ההיענות ISE כיול.</li>
</ol>2. הכנת מלחציים תיקון סיליקון עבור הקלטת
הערה: השיטה המתוארת על ידי דונלד Hilgemann במאמרו על ערוץ אחד הקלטה21 מומלץ.
<ol><li>משוך את פיפטות ענק תיקון של נימים זכוכית בורוסיליקט (2.0 mmOD / 1.5 ממ ת. ז)22,232,פולר פיפטה.</li>
	<li>שימוש microforge רכוב על השלב של מיקרוסקופ הפוכה להגיע עם פיפטה רחב עצה (10-22 μm)23. להמיס חרוז (~ 0.5 מ ל) של זכוכית רכה על החוט פלטינה עבה של microforge. הערה: פלטינה חוט עבה יחסית נדרש (~0.5 מ"מ) כדי לבדות פיפטות ענק תיקון.</li>
	<li>מקם את פיפטה תיקון קרוב חרוז זכוכית רכה, ולהחיל חום מלא עד הקצה מתחילה לסגת. החוט פלטינה יעביר מעט לכיוון centerduring חימום.</li>
	<li>לכבות את האש, דחפו את הטיפ פיפטה חרוז זכוכית מרוככת. החוט קירור תמשוך ולשבור את הטיפ פיפטה.</li>
	<li>להחיל מחדש את החום כדי להחליק את הטיפ פיפטה וליצור טיפ פיפטה לקוטר הרצוי. הקוטר של הקצה תלויה בגודל של התא להיות שתוקנה (8-10 μm במחקר זה).</li>
</ol>3. הכנה של תאים
<ol><li>לחמם מלוחים מאגר פוספט (PBS) ללא Ca2 + , Mg2 +, טריפסין-EDTA פתרון מדיום הגידול ל- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>רחץ תאים פעמיים עם PBS. השתמש 1 מ"ל של המאגר לצלחת תא תרבות בקוטר 35 מ מ.</li>
	<li>להוסיף 0.5 מ של טריפסין בתאי לצלחת תא תרבות בקוטר 35 מ מ. הערה: כאשר התאים מתחילים מצוד, נענעי את הצלחת לצרף מבטל את התאים.</li>
	<li>עצרי טריפסין על-ידי הוספת 5 מ ל (כמות לצלחת תא תרבות בקוטר 35 מ מ) של מדיום הגידול מלאה בתוספת 10% סרום שור בעובר. הערה: זמן התגובה של טריפסין הוא סוג התא התלויים.</li>
	<li>המקום התאים על מטרף עם נדנדה כדי למנוע היווצרות גושים.</li>
	<li>השתמש תאים עבור עד 2 שעות לאחר trypsinization. הערה: הזמן עשויים להשתנות בהתאם לקו תא.</li>
</ol>4. הכנת מערכת זלוף אינטרה-פיפטה
<ol><li>חתך בגודל המתאים של קוורץ אבובים (150 מיקרומטר OD / 75 מיקרומטר ID) כדי להכין את הקו זלוף אינטרה-פיפטה.</li>
	<li>הכנס צד אחד של הצנרת קוורץ טיפ פיפטה µL 200. הדבק את הצנרור קוורץ על הטיפ, לחתוך את הקצה של הקצה עם סכין גילוח חד.</li>
	<li>להתחבר לקו זלוף (קוורץ אבובים דבוק אל קצה) חתיכה קטנה של צינורות סיליקון שישמש מאגר עבור הפתרון זלוף אינטרה-פיפטה.</li>
	<li>להתחבר לאורך צינור סיליקון מזרק כדי ליצור לחץ חיובי.</li>
	<li>הוספה הסוף חינם של הצנרת קוורץ דרך הצינורית פוליאתילן של בעל פיפטה זלוף פורט (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>להעריך את הקו זלוף עם הפתרון פיפטה.</li>
</ol>5. אופן ההכנה של פתרונות
<ol><li>להכין פתרון פיפטה בכבדות במאגר הקלטה NHE (115 מ מ אשלגן אספרטט (KAsp), 1 מ"מ EGTA, 0.5 מ מ MgCl2, 10 מ מ ג-ATP, 12.5 מ מ HEPES, צינורות 12.5 מ מ, המגבים 12.5 מ מ ו- 12.5 מ מ MES, pH 6.0 מותאם עם חומצה אספרטית). הערה: להכין את מניות פיפטה פתרון סינון. הוסף Mg-ATP לפני הקלטה.</li>
	<li>להכין פתרון אמבט טרי בכל פעם (140 מ"מ NaCl, מ מ 2 CaCl2, 2 מ מ MgCl2ו- pH טריס-HCl 0.1 מ מ 8.2).</li>
</ol>6. רישום של פעילות טרנספורטר
<ol><li>לשמור על חדר ההקלטה ואת כל הפתרונות ב 37 מעלות צלזיוס, כי פעילות טרנספורטר היא תלוית טמפרטורה.</li>
	<li>מקם את התאים אל החדר הקלטה. חכו עד שהם להוריד לחלק התחתון של החדר, אבל אל תתנו להם לצרף אל התא.</li>
	<li>בחר תא המתאים. למדוד את הקוטר של התא עם עינית מיקרומטר. בחר תאים עם קטרים דומה. הערה: בדרך כלל, תא גדול יהיה השטח התאים ואולי יותר מובילי הביע על קרום פלזמה שלה, וכך גם יש יותר פעילות המשלח. עם זאת, זה לא בהכרח נכון, כמו פעילות טרנספורטר תלוי ספציפית לגבי המעלית ואת סוג התא שנבחנה.</li>
	<li>הר על פיפטה microelectrode יון סלקטיבית כדי micromanipulator, מילוי פיפטה מחבר תיקון-חובק למעקה עם הפתרון תאיים, עליך לוודא כי הפתרון מגיע הטיפ של פיפטה2. הערה: זה עשוי לדרוש הברזים עדין מספר לחסל בועות על חוד פיפטה.</li>
	<li>הר של פיפטה מחבר תיקון-חובק למעקה ראש לשלב אלקטרופיזיולוגיה להגדיר22,2,23. הערה: חשוב לשמור על הבמה ראש על זווית 45 מעלות לציר האופקי, זה מבטיח זווית הכניסה עבור פיפטה מתאים היווצרות של גושפנקה עמיד מאוד.</li>
	<li>החל לחץ חיובי קטן (~ 5 ס"מ H2O) על פיפטה תיקון כדי להקטין את הסיכוי של חוסם את הטיפ, ומניחים אותו בתוך תמיסת אמבט.</li>
	<li>. תפסיק לזוז על פיפטה מלחציים תיקון פעם הטיפ הוא קרוב התא.</li>
	<li>לשחרר את הלחץ חיובי בעוד פיפטה נוגע התא והפעילו לחץ שלילי קלה (~ 5 ס"מ H2O) כדי להשיג > 1000 MΩ (גיגה אוהם) חותם על קרום התא עם התיקון פיפטה23.</li>
	<li>למקם את פיפטה תיקון עם התא באותו מישור מוקד כמו ISE ולהזיז את פיפטה תיקון עם התא בסמיכות ISE (~ 5-10 מיקרומטר)2,5 אלא למנוע ומאפשר את התא כדי לפנות את ISE (איור 1 א').</li>
	<li>להבטיח כי החזקת פוטנציאלי הוא 0 mV.</li>
	<li>קרע את החותם עם סדרת ראספים קצר כדי להשיג את תצורת כל תא.</li>
	<li>להזיז את ISE (או פיפטה מלחציים תיקון) לאט משמאל או מעלה-מטה כדי להקליט את הפעילות של המשגר (איור 1B).</li>
	<li>להקליט את פסגות לפחות 5-8 (איור 1C, מ- A ל- B).</li>
	<li>החל גל מרובע לפליטת במהלך ההקלטה לעקוב אחר האיכות של החותם, קיבוליות של קרום התא (איור 1).</li>
	<li>להעריך את שטף H+ (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">) מן ההבדל בריכוז H+ חינם בין פני השטח תא הפתרון בתפזורת (ΔH+) <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq3v2.jpg"> הערה: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq4.jpg"> , <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq5.jpg"> H+ , מאגר המקדמים של דיפוזיה בהתאמה, BT הוא ריכוז מאגר הכולל, KD הוא קבוע דיסוציאציה של המאגר, r הוא התא רדיוס, ו <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq6.jpg"> קובע לשינוי מצב יציב הריכוז של ה מאוגד+ עבור שינוי קטן חינם H+. H+ מציין פרוטון חופשי בתמיסה. עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים, H+ פלקסים מומרים השטף אלקטרופיזיולוגיות יחידות על-ידי חישוב של מקבילות הנוכחי פלקסים (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">/faraday)3,הרשות הפלסטינית5].</li>
	<li>לנרמל את שטף פרוטון השטח תא זה ניתן לחשב את גודל התא או את קיבול הממברנה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiating+SLC+transporter+activity:+Emerging+drug+discovery+opportunities.">Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities.</a> Biochem Pharmacol. , (2017).</li><li>Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+fluxes+in+giant+excised+cardiac+membrane+patches+detected+and+quantified+with+ion-selective+microelectrodes.">Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes.</a> J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).</li><li>Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biophysical+and+molecular+basis+of+intracellular+pH+sensing+by+Na+/H++exchanger-3.">The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3.</a> FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).</li><li>Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+function+of+the+ubiquitous+mammalian+Na/H+exchanger+(NHE1)+in+relation+to+dimer+coupling+models+with+2Na/2H+stoichiometry.">Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry.</a> J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).</li><li>Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-+and+mechanosensitivities+of+sodium/hydrogen+exchangers+analyzed+by+electrical+methods.">Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).</li><li>Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrogenic+kinetics+of+a+mammalian+intestinal+type+IIb+Na(+)/P(i)+cotransporter.">Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter.</a> J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).</li><li>Smith, P. J., Trimarchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+measurement+of+hydrogen+and+potassium+ion+flux+from+single+cells+and+epithelial+structures.">Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).</li><li>Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+extracellular,+ion-selective+microelectrodes+to+study+the+function+of+heterologously+expressed+transporters+in+Xenopus+oocytes.">The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243 (2009).</li><li>Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A., Michael, A. C., Borland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electrochemical Methods for Neuroscience. , 373-406 (2007).</li><li>Orlowski, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+the+mammalian+sodium/proton+exchanger+SLC9+gene+family.">Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family.</a> Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).</li><li>Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+eukaryotic+sodium/proton+exchangers.">Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).</li><li>Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+/H++exchangers:+physiology+and+link+to+hypertension+and+organ+ischemia.">Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia.</a> Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).</li><li>Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC9/NHE+gene+family,+a+plasma+membrane+and+organellar+family+of+Na(+)/H(+)+exchangers.">SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers.</a> Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).</li><li>Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+physiology+of+intestinal+Na+/H++exchange.">Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange.</a> Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).</li><li>Girardi, A. C., Di Sole, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+mechanisms+of+the+Na+/H++exchanger-3+regulation+in+organ+dysfunction.">Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).</li><li>Bobulescu, I. A., Moe, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+/H++exchangers+in+renal+regulation+of+acid-base+balance.">Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance.</a> Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).</li><li>Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+and+intriguing+lives+of+PIP2+with+ion+channels+and+transporters.">The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters.</a> Sci STKE. (111), re19 (2001).</li><li>Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NHE3+activity+is+dependent+on+direct+phosphoinositide+binding+at+the+N+terminus+of+its+intracellular+cytosolic+region.">NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region.</a> J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).</li><li>Alexander, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+surface+charge+dictates+the+structure+and+function+of+the+epithelial+Na+/H++exchanger.">Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger.</a> EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).</li><li>Wang, T. M., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca-dependent+nonsecretory+vesicle+fusion+in+a+secretory+cell.">Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell.</a> J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).</li><li>Hilgemann, D. W., Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording. , 307-328 (1995).</li><li>Hilgemann, D. W., Lu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+membrane+patches:+improvements+and+applications.">Giant membrane patches: improvements and applications.</a> Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).</li><li>Matsuoka, S., Takeuchi, A., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch Clamp Techniques. , 207-218 (2012).</li><li>Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+mutation+abolishing+Na+/H++antiport+activity+in+hamster+fibroblasts+precludes+growth+at+neutral+and+acidic+pH.">A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).</li><li>Voipio, J., Pasternack, M., MacLeod, K., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microelectrode Techniques - The Plymouth Workshop Handbook. , 275-316 (1994).</li></ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

למרות הפונקציות מכריע של שנאים, השיטות הזמינות ללמוד את פעילותם הן יעילות ואף לא מתאימות. מגבלה אחת היא כי השיטות הזמינות למדוד תנועה יון מתווכת על-ידי טרנספורטר פעילות בלי להתחשב תנודות בהרכב יון תאיים במהלך ניסוי4. השיטה הציג מבטיחה שליטה מדויקת של יון חוץ-תאית, תאיים יצירות ומציע כלי רב עוצמה עבור שינוי יון תאיים, חלבון, שומנים בדם יצירות3,4,5.
הצעד החשוב ביותר של פרוטוקול זה הוא הכנת איסה זה יציבים במשך תקופה ארוכה25. מניסיוננו, ISE לא יציבה אינה siliconized היטב (למשל, שרף יון סלקטיבי מחולקת בצדדים פיפטה ISE), אשר ניתן להבחין על הסחף מתמדת ובלתי נשלט בתוך האות ISE. בנוסף, התפלגות שרף ב ISE צריך לפקח באופן הדוק במהלך הניסוי. הפתרון אמבט עשויים לדחוף שרף יון סלקטיבי בתוך ISE הפיפטה יצירת עמודת בפתרון אמבטיה לפני שרף25. במקרה זה, ISE להקליט את ריכוז יון מעמודה זו ולהיות מצבו לשינויים מעברי הצבע יון במהלך הניסוי. התאמת הגיאומטריה של ISE המפתח כדי להשיג תשובה ISE בטווח של 100 ms9 ואת להתגבר על עיכובים אפשריים בתגובות-ISE זמן מושווה שינויים הדרגתיים יון.
המגבלה העיקרית של השיטה הציג הוא ירש את התיקון מחבר חובק למעקה מדידה של פעילות טרנספורטר בתאי אפיתל. בעת ניתוק מתמיכה ומתוחזק ההשעיה, תאי אפיתל מקוטב עלולה לאבד לוקליזציה מקוטב של מובילי על קרום הפסגה או basolateral.
תיקון ששונה מחבר חובק למעקה מדידה אמור לשמש לומדים ערוצי, מסועי ב epithelia מקוטב. בהתחשב בעובדה כי תאים עשוי משוער לתוך גליל מאשר כדור חשוב בשעת שינוי צורה של מעבר הצבע H+ לתוך השטף דרך הנוסחה מסופקים. במקרה זה, יש לשנות את הנוסחה כדי <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq7.jpg"> שבו λ הוא אורך הגליל, r הוא רדיוס גליל, ad x הוא המרחק רדיאלי האמצע גליל שבמהלכן מעבר הצבע הוא נמדד5. פיתוח עתידי של טכניקה זו עוצמה ללמוד electroneutral מובילי להתמקד על שינוי השיטה כדי למטב את ההקלטה תאים גדל של טפט.

תחבורה בין יונים מומסים בגבול על פני קרום פלזמה היא חיונית להישרדותו של התאים ומכאן של אורגניזמים1. תחבורה סלקטיבית של יונים, מומסים בגבול מושגת על ידי מערך של חלבונים טרנספורטר וערוץ מיוחדת. מוטציות בחלבונים אלה לעיתים קרובות לגרום מגוון תנאים קליניים, עיבוד טרנספורטר וערוץ חלבונים מטרות אפשריות עבור טיפול תרופתי1. למרבה הצער, הבנת המנגנונים שבבסיס ערוץ וטרנספורטר ורגולציה לעיתים קרובות מוגבל על ידי הגישות לרשות המחקר שלהם פעילות2,3,4.
באופן ספציפי, מסועי בערך תת מתחלקים לשתי קבוצות גדולות בהתאם אם הם לשנות את הפוטנציאל transmembrane תא במהלך ההובלה של מומסים בגבול: מובילי שינוי יון electrogenic [למשל, נתרן-פוספט 2a טרנספורטר משותף (NaPi2a), נתרן סידן מחליף (NCX), וכו '.] או למעליות יון electroneutral ללא שינוי [כגון: מחליף נתרן-פרוטון (NHE), מוביל שיתוף סודיום-כלוריד, NaPi2c, ועוד.]. הפעילות של שני המעמדות של מובילי נחקרו בהרחבה באמצעות קליטת איזוטופים רדיואקטיביים, צבעי פלורסנט ממברנה-permeant2. שתי הגישות להעריך את הפעילות של מובילי על ידי מדידת שינויים בריכוז בצובר יונים ספציפיים cytoplasmic ולאחר שתי השיטות יש מגבלות, כגון רגישות בינונית ו ברזולוציה זמן לקוי השליטה תאיים חצרו. ואכן, הפעילות של מובילי רבים תלויה cytoplasmic ריכוז היונים נשאו (למשל, NHE3, NCX), צפויים שינויים בריכוזים אלה יון יש תפקיד חשוב בוויסות פעילות המשלח2 , 3 , 5. מדידה מדויקת של מנגנונים אלה בחקיקה מוגבל בשיטות קלאסיות.
כדי להתגבר על מגבלות אלה, שיטות מלחציים תיקון משמשים כדי לחקור את פעילות המשלח2,6. באופן ספציפי, הפניה עצמית אלקטרודות יון סלקטיבית (ISEs)7,8 בשילוב עם התיקון מחבר חובק למעקה המערכת אפשרה לאחרונה את המדידה של electroneutral טרנספורטר פעילות3,4 , 5. ISEs הם מבוססת על העובדה טרנספורטר פעילות יוצרת הדרגתי של יון בסמיכות קרום התא. איסה זזים למעלה כדי ורחוק קרום התא בחוזרות אופנה מתנדנדות רשומות שינוי מתח (µV). מתח ההבדלים יכולים להיות מומרים יון השטף ערכים באמצעות שיטה כיול כי חל החוק הראשון של Fick של דיפוזיה2,9. בעוד ISEs משמשים לזיהוי השטף של יונים זז מתוך תאים, שיטת מלחציים תיקון שני תאים שלמים או תצורות הפוכה משמשת לבקרה ההרכב יון פוטנציאליים, תאיים ממברנה. יתר על כן, היישום של הטכניקה מלחציים תיקון ענק מאפשר שינוי של ההרכב תאיים של לא רק יונים, אלא גם3,של שומנים, חלבונים-5.
לסיכום, צדדיות של השיטה מלחציים תיקון לעומת כי של שיטות אחרות כדי ללמוד פעילות המשלח עשה תיקון מחבר חובק למעקה מתאימים על מנת להתגבר על המגבלות נפוצות של השיטות האחרות. השילוב של הכוללות הפניה עצמית ISEs וטכניקות מלחציים תיקון מציעה את האפשרות ייחודי כדי למדוד את הפעילות של מובילי electroneutral בסביבה ניסיוני פיקוח הדוק, לגלות את הרומן biophysical ומולקולרית המאפיינים של קרום התא תחבורה3,4,5. גישה זו שימש בהצלחה ללמוד את הפעילות של NHE. משפחת יונקים חלבונים NHE מזרז ההחלפה נטו electroneutral חוץ-תאית נתרן (Na+) עבור פרוטון תאיים (H.+)10,11 ניצול של הדרגה Na+ פנימה. ביונקים, משפחת חלבונים NHE כולל חלבונים הקשורים 11 (NHE1-9 ו- NHA1-2) של הזרע ספציפי NHE10,12,13.
NHEs (SLC9a משפחה) נמצאים ubiquitously רוב היצורים החיים של אאוקריוטים פשוטה כדי פרוקריוטים גבוה ומעורבים במגוון של התא חיוני פונקציות10,11, כולל שליטה את ההגנה מליחות תא אאוקריוטים, שמירה על הומאוסטזיס חומצה בסיס וכרך תא, מווסת את ספיגת מלח ומים שונים מיוחדים epithelia10,12,14,15. התפקיד הביולוגי מפתח של NHEs ואת המשמעות של הפונקציות שלהם שנקבע באמצעות מספר מחקרים; עם זאת, מחקרים מעטים חקרו את המאפיינים biophysical ומולקולרית של יונקים NHEs בגלל מגבלות מתודולוגי4. לאחרונה, היישום של הכוללות הפניה עצמית של ISEs במהלך תיקון שלם-תא מחבר חובק למעקה חשפה את הרומן המנגנונים המולקולריים של NHE איזופורמים מוסדר על ידי שינויים ריכוזי יונים, חלבונים, פוספוליפידים3, תאיים 4.
באופן ספציפי, פרוטוקול בתנאי כתב יד זה מתאר את הדרכים ואת הגישות ללמוד את פעילות וויסות של NHE isoform 3 (NHE3), שחקן מרכזי לספיגת נוזלים HCO3– , Cl–, Na+ מברשת קרום הגבול של כליות, מעיים epithelia14,16. תובנה חדשה הבדלים הרגישות של פעילות NHE3 כדי phosphoinositides תאיים (phosphatidylinositide 4, 5-bisphosphate [PI (4.5) P2], phosphatidylinositide 3,4,5-טריפוספט [PI(3,4,5]P3]) הוא דיווח. תא תחבורה חלבונים, כגון ערוצי מובילים, מוסדרים על ידי phosphoinositides17, NHE3 נקשר ישירות P2 PI (4.5) והן P3 PI (3,4,5)18. על סמך הספרות הנוכחי, גם phosphoinositide יכול להיות רלוונטי להסדרת פיזיולוגיים או pathophysiological NHE35,18,19. הממצאים שלנו תומך בתפקידים נפרד PI (4.5) P2, P3 PI (3,4,5) בוויסות פעילות NHE3. הבחנה זו התאפשרה בשל היישום של טכניקות ISE בשילוב עם הקלטה מלחציים תיקון כל תא. טכניקה זו מאפשרת גם שליטה על התוכן הסלולר phosphoinositide ויה זלוף תאיים של phosphoinositides שונים במהלך המדידה של פעילות NHE3.

<table><tbody><tr><td>Patch clamp Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1650</td><td></td></tr><tr><td>Differential Amplifier (DP-301)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0044</td><td></td></tr><tr><td>Patch Clamp Software Based on MatLab</td><td>MatLab with acquisition toolbox</td><td></td><td>The capmeter software is recommended</td></tr><tr><td>ThermoClamp-1 Temperature Control System</td><td>&amp;nbsp;AutoMate Scientific</td><td>03-11-LL</td><td>In-line heater</td></tr><tr><td>Single-Channel Temperature Controller (TC-324C)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-2400</td><td></td></tr><tr><td>Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-3&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Used for ion selective electrodes</td></tr><tr><td>Micropipette Storage Jar</td><td>World Precision Instruments</td><td>E212</td><td></td></tr><tr><td>Bis(dimethylamino)dimethylsilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14755-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Carbon tetrachloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319961-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen ionophore I - cocktail B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95293</td><td></td></tr><tr><td>Thin Wall Borosilicate Tubing</td><td>&amp;nbsp;Sutter Instrument</td><td>B200-156-15</td><td>Used for patch clamp pipette&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Soft glass (Corning 8161 Patch Glass)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0815</td><td></td></tr><tr><td>Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID)</td><td>Molex (Polymicro Technologies)</td><td>106815-0018</td><td>Used for intra-pipette perfusion system</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Potassium aspartate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6558</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4880</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8</td><td>Echelon Biosciences</td><td>P-4508</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8</td><td>Echelon Biosciences</td><td>P-3908</td><td></td></tr></tbody></table>

application of electrophysiology measurement to study the activity of electro-neutral transporters

הובלת יונים דרך קרום התא מבטיחה שליטה בסדר של יון תוכן בתוך ומחוץ לתא שעליו היא הכרחית להישרדות התא. מנגנונים אלה התחבורה הם מתווכת על-ידי הפעילות של חלבונים מוביל מתמחה. באופן ספציפי, pH dynamics דק נשלטים על ידי מערכות ההבלטה קרום פלזמה פרוטונים (H.+), כגון Na+/H+ מחליף (NHE) חלבון המשפחה. למרות המאמצים ללמוד המנגנונים NHE תקנה, ההבנה הנוכחית שלנו של המאפיינים biophysical ומולקולרית של משפחת NHE זה לא מספיק בשל המוגבל של שיטות למדוד ביעילות NHE פעילות . כתב יד זה, השתמשנו H+-אלקטרודות סלקטיבית במהלך כל-תא תיקון הקלטה clamping כדי למדוד את השטף הנוצרות על-ידי NHE H+ . אנחנו הציע גישה זו כדי להתגבר על כמה מגבלות של בדרך כלל השתמשו בשיטות למדידת פעילות NHE, כגון ספיגת רדיואקטיבי permeants ממברנה פלורסנט. מדידה של פעילות NHE באמצעות השיטה המתוארת מאפשר רגישות גבוהה, זמן רזולוציה ובקרה יעיל יותר של ריכוזים H+ תאיים. H+-אלקטרודות סלקטיבית הן מבוססת על העובדה טרנספורטר פעילות יוצרת הדרגתי של יון בסמיכות קרום התא. H+-סלקטיבית אלקטרודה מעבר, הרחק קרום התא בצורה שחוזרת על עצמה, מתנדנדות רשומות שינוי מתח התלויים השטף H+ . בעוד H+-אלקטרודות סלקטיבי משמשים לזיהוי שטף H+ עוזבת התא, השיטה מלחציים תיקון בתצורה שלם-תא משמשת לבקרה ההרכב יון תאיים. יתר על כן, היישום של הטכניקה מלחציים תיקון ענק מאפשר שינוי של ההרכב תאיים של לא רק יונים, אלא גם שומנים. הפעילות מוביל של NHE isoform 3 (NHE3) נמדדה באמצעות גישה טכנית זו ללמוד את הבסיס המולקולרי של תקנה NHE3 על ידי phosphoinositides.

ISE הפניה עצמית במהלך ההקלטה מלחציים תיקון שלם-תא הוחל ללמוד ויסות פעילות NHE3 על ידי phosphoinositides. PS120 תאי פיברובלסט כמו24, שחסרה את הביטוי של קרום פלזמה אנדוגני NHEs, שימשו. NHE3 פראי-סוג (NHE3-wt) או מוטציות NHE3 זה אין איגוד phosphoinositides [טירוזין 501, ארגינין 503, ליזין 505 היו שהוחלפו עם אלנין, R503A/Y501A/K505A (NHE3-YRK)] היו stably לידי תאי פיברובלסט דמוי PS12018.
העקבות מוצגים באיור2. התא היה במוחי תצורה של תאים שלמים באמצעות פיפטה עבור תיקון מחבר חובק למעקה, ISE הוצב מול התא. במצב הזה, ISE הקליט את הריכוז של H חינם+ קרוב קרום התא (איור 1 א'); לאחר מכן, ISE (או פיפטה מלחציים תיקון) היה מיקרומטר רוחבית 50 הועברו באופן ידני ואשר נרשמו ריכוז חינם H+ הפתרון (איור 1B). ההבדלים מתח מוקלטות, המייצגים שתי העמדות של פיפטה תיקון עם התא לפני או הרחק את איסה הם נציג של פעילות NHE3 (איור 1C). זלוף אינטרה-פיפטה של apyrase (ATP-diphosphatase) מקטין את הריכוז תאיים של ATP, לאחר מכן להקטין את תוכן phosphoinositide5. מסכים עם מחקרים שדווחה בעבר5,18,19, התוכן phosphoinositide ירד מתווכת על ידי טיפול apyrase מופחת פעילות NHE3 (~ 50%), אשר הוקלט כמו ירידה ברמת המתח משרעת תנודה (איור 2). ההשפעה של apyrase (ניתן ב- 5 יחידות/ml) על פעילות NHE3 התהפכה לחלוטין על ידי זלוף אינטרה-פיפטה של apyrase בשילוב עם 2 מיקרומטר P3 PI (3,4,5) (איור 2 ו- 3 א). ממצאים אלה נתמכו על ידי הפעילות NHE3 הקליט בתאים PS120 stably לבטא מוטציות NHE3 (NHE3-YRK) הצליחו לקשור phosphatidylinositides18. זלוף של apyrase לבד או בשילוב עם PIP3 לא השפיע על הפעילות של NHE3 NHE3-YRK מוטציות (איור 3B). הפעילות של NHE3 אנדוגני היה גם מעוכבים על ידי טיפול apyrase תאי הכליה (OK) אופוסום3. זלוף אינטרה-פיפטה של PI (3,4,5) P3 להפוך עיכוב של פעילות NHE3 שנגזרות apyrase בתאים בסדר (איור 3C). ממצאים אלה מראים כי ההשפעה של P3 PI (3,4,5) על פעילות NHE3 אינה תא ייחודיים לסוג.
בשלב הבא, אנחנו נועדו לבדוק את ייחודה של PIP3 על ויסות בתיווך apyrase שינויים בפעילות NHE3. אנחנו עשינו את זה על-ידי assaying את ההשפעה על הפחתת apyrase תלויי על פעילות NHE3 לאחר זלוף של phosphoinositides אחרים, כגון P2 PI (4.5) PI (4.5) P2 (ב 10 מיקרומטר) לא השפיע על ירידה בפעילות NHE3 מתווכת על-ידי apyrase (איור 4A). בסופו של דבר, זלוף של המגבר-PNP, אנלוגי הלא-hydrolysable ATP, אינם חוסמים theapyrase תלויי-עיכוב של פעילות NHE3 (איור 4B). ממצאים אלה מראים תפקיד של P3 PI (3,4,5), אבל לא פאי (4.5) P2, בוויסות NHE3 לאחר דלדול ATP. זיהוי תפקידים נפרדים עבור PI (4.5) P2, P3 PI (3,4,5) ב NHE3 תקנה היה אפשרי רק בגלל זלוף המערכת של phosphoinositides במהלך המדידות ISE בשילוב עם מלחציים תיקון שלם-תא הקלטה5. פעולה ספציפית של P3 PI (3,4,5) יותר מאשר PI (4.5) P2 בוויסות פעילות NHE3 יקר, כדי לקבוע אם phosphoinositides תאיים שונים לווסת את הפונקציה של NHE3 באופן שונה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56630/56630fig1.jpg"> איור 1 . ייצוג סכמטי של H+ שטף ובחינת המתאם בין פעילות NHE ההבדלים הפוטנציאליים נרשם על ידי microelectrode ה-pH. ייצוג סכמטי של הגדרת הקלטה. תרשים א של הגדרת הניסוי הראשוני. התא שבידי בתצורה שלם-תא פיפטה מהדק התיקון, הניח לפני איסה. בתנוחה זו, ISE מתעדת את הריכוז של H חינם+ קרוב קרום התא. נולד ב ISE (או פיפטה מלחציים תיקון) הועברו באופן ידני רוחבית ~ 50 מיקרומטר, רושם את הריכוז של H חינם+ הפתרון במצב הזה. ג. ייצוג גרפי של מתח ההבדלים הקליטה באמצעות ISE. תנודות מעמדה (תא מול ISE) ל- B (תא רחוק ISE) הם נציג של פעילות NHE. התוכנה ששימשה רשום את המתח ההבדלים שהוקלט על ידי ISE ועורר לפליטת גל מרובע (20 mV, 0.2 kHz) כדי לנטר את קרום התא קיבוליות ואיכות החותם מלחציים תיקון. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56630/56630fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56630/56630fig2.jpg"> איור 2 . דוגמה של הקלטה להגדיר לפעילות טרנספורטר NHE3 בתא יחיד PS120 stably לבטא NHE3-wt לפני ואחרי זלוף עם apyrase ו- P3 PI (3,4,5) (PIP3). לאחר ההקלטה הראשונית, התא הייתה דלה של ATP על ידי זלוף אינטרה-פיפטה של apyrase. פעילות NHE3 בהדרגה ירד והיא שוחזרה על ידי PIP3 אינטרה-פיפטה זלוף. Apyrase תוספת מצוינת באמצעות העמודה האדומה, PIP3 תוספת מצוינת באמצעות הפס הירוק. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56630/56630fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56630/56630fig3.jpg"> איור 3 . ההשפעה של דלדול ATP זלוף PIP3 בפעילות טרנספורטר NHE3 בתאים PS120 ו- OK. ההשפעה של דלדול ATP בתיווך apyrase על פעילות NHE3, את הזמנת את השפעת apyrase על פעילות NHE3 שנגזרות זלוף אינטרה-פיפטה PIP3: א PS120 תאים לביטוי NHE3-wt או B. PS120 תאים לביטוי NHE3-YRK, NHE3 מוטציות אפשרות לבצע איגוד phosphoinositides. ג תאים בסדר להביע NHE3 אנדוגני. החוגים מוצק הצג נתונים ממוצע ניסויים בודדים (ארבעה ניסויים שבוצעו בתנאים זהים). קווי שגיאה מייצגים את האמצעים ± תקן שגיאות (SE). * P 0.05 < לעומת שליטה, ANOVA. $ P < 0.5, apyrase < 0.01 $$P לעומת apyrase + PIP3, ANOVA. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56630/56630fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56630/56630fig4.jpg"> איור 4 . ההשפעה של PI (4.5) P2 (PIP2) ו- ANP-PNP זלוף בפעילות NHE3 לאחר דלדול ATP. ההשפעה של א PIP2 או B. זלוף ANP-PNP אינטרה-פיפטה על צמצום תלויי-apyrase NHE3 פעילות בתאים PS120 לבטא NHE3-wt. החוגים מוצק הצג נתונים ממוצע ניסויים בודדים (ארבעה ניסויים שבוצעו בתנאים זהים). קווי שגיאה לייצג את האמצעים ± SE. * P < 0.05, * * P < 0.01 לעומת שליטה, ANOVA. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56630/56630fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters at JoVE.com

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

כתב יד זה מתאר את היישומים של אלקטרודות פרוטון סלקטיבית, תיקון מחבר חובק למעקה שיטות למדוד את הפעילות של מערכות תחבורה פרוטון. אלה שיטות להתגבר על כמה מגבלות של טכניקות המשמשות בדרך כלל ללימוד פעילות התחבורה פרוטון, כגון רגישות בינונית, רזולוציה זמן ובקרה לא מספיקות כאורחים סביבה תאיים.

יישום המדידה Electrophysiology ללמוד את הפעילות של מובילי אלקטרו-נייטרלי

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

application-electrophysiology-measurement-to-study-activity-electro

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

6.9K Views.  Des Moines University. כתב יד זה מתאר את היישומים של אלקטרודות פרוטון סלקטיבית, תיקון מחבר חובק למעקה שיטות למדוד את הפעילות של מערכות תחבורה פרוטון. אלה שיטות להתגבר על כמה מגבלות של טכניקות המשמשות בדרך כלל ללימוד פעילות התחבורה פרוטון, כגון רגישות בינונית, רזולוציה זמן ובקרה לא מספ...

Video: Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

Measuring the Induced Membrane Voltage with Di-8-ANEPPS

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell membrane, resulting in a voltage across the membrane. This voltage, termed the induced membrane voltage (also induced transmembrane voltage, or induced transmembrane potential difference) and denoted by &Delta;&Phi;, exists only as long as the external field is present. If the resting voltage is present on the membrane, the induced voltage superimposes (adds) onto it. By using one of the potentiometric fluorescent dyes, such as di-8-ANEPPS, it is possible to observe the variations of &Delta;&Phi; on the cell membrane and to measure its value noninvasively. di-8-ANEPPS becomes strongly fluorescent when bound to the lipid bilayer of the cell membrane, with the change of the fluorescence intensity proportional to the change of &Delta;&Phi;. This video shows the protocol for measuring &Delta;&Phi; using di-8-ANEPPS and also demonstrates the influence of cell shape on the amplitude and spatial distribution of &Delta;&Phi;.

External electric field induces a voltage on the membrane of a cell, termed the induced membrane voltage (&Delta;&Phi;). By using the potentiometric dye di-8-ANEPPS, it is possible to measure the &Delta;&Phi; noninvasively. This video shows the protocol for measuring &Delta;&Phi; using di-8-ANEPPS.

מדידת מתח ממברנה מושרה עם Di-8-ANEPPS

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell ...

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as tools for developing clinical therapies, many of which depend on the inhibition of membrane proteins such as transporters. However, most of the methods used to determine the inhibition of transport activity are difficult to perform in high-throughput routines and depend on labeled substrates availability thereby complicating the screening of large nanobody libraries. Solid-supported membrane (SSM) electrophysiology is a high-throughput method, used for characterizing electrogenic transporters and measuring their transport kinetics and inhibition. Here we show the implementation of SSM-based electrophysiology to select inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting an electrogenic secondary transporter and to calculate nanobodies inhibitory constants. This technique may be especially useful for selecting inhibitory nanobodies targeting transporters for which labeled substrates are not available.

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane SSM-Based Electrophysiology

Nanobodies are important tools in structural biology and pose a great potential for the development of therapies. However, the selection of nanobodies with inhibitory properties can be challenging. Here we demonstrate the use of solid-supported-membrane (SSM)-based electrophysiology for the classification of inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting electrogenic membrane transporters.

מבחר ננו-בודיות מעכבות ממוקדות טרנספורטר על-ידי אלקטרופיזיולוגיה מבוססת ממברנה מוצקה (SSM)

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as ...

Biochemistry

Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where the stimulus applied depends in real-time on the response of the system. Recent applications range from the implementation of virtual reality systems for studying motor responses both in mice1 and in zebrafish2, to control of seizures following cortical stroke using optogenetics3. A key advantage of closed-loop techniques resides in the capability of probing higher dimensional properties that are not directly accessible or that depend on multiple variables, such as neuronal excitability4 and reliability, while at the same time maximizing the experimental throughput. In this contribution and in the context of cellular electrophysiology, we describe how to apply a variety of closed-loop protocols to the study of the response properties of pyramidal cortical neurons, recorded intracellularly with the patch clamp technique in acute brain slices from the somatosensory cortex of juvenile rats. As no commercially available or open source software provides all the features required for efficiently performing the experiments described here, a new software toolbox called LCG5 was developed, whose modular structure maximizes reuse of computer code and facilitates the implementation of novel experimental paradigms. Stimulation waveforms are specified using a compact meta-description and full experimental protocols are described in text-based configuration files. Additionally, LCG has a command-line interface that is suited for repetition of trials and automation of experimental protocols.

Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board.

אלקטרופיזיולוגיה בזמן אמת: שימוש בפרוטוקולי לולאה סגורה לDynamics עצבי בדיקה ומעבר

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

Neuroscience

Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively in the neuron and is essential for the proper functioning of Cl- homeostasis and consequently functional GABAergic inhibition. Failure in proper regulation of KCC2 is deleterious and has been associated with the prevalence of several neurological diseases, including epilepsy. There has been considerable progress with regard to understanding the mechanisms involved in the regulation of KCC2, accredited to the development of techniques that enable researchers to study its functions and activities; either via direct (assessing kinase regulatory sites phosphorylation) or indirect (observing and monitoring GABA activity) investigations. Here, the protocol highlights how to investigate KCC2 phosphorylation at kinase regulatory sites - Thr906 and Thr1007- using western blotting technique. There are other classic methods used to directly measure KCC2 activity, such as rubidium ion and thallium ion uptake assay. Further techniques such as patch-clamp-electrophysiology are used to measure GABA activity; hence, indirectly reflecting activated and/or inactivated KCC2 as informed by the assessment of intracellular chloride ion homeostasis. A few of these additional techniques will be briefly discussed in this manuscript.

The present protocol highlights the application of western blotting technique to study the functions and activities of neuronal K-Cl co-transporter KCC2. The protocol describes the investigation of KCC2 phosphorylation at kinase regulatory sites Thr906/1007 via western blotting. Also, additional methods to confirm KCC2 activity are briefly highlighted in this text.

חקר הפונקציות והפעילויות של קו-טרנספורטר K-Cl עצבי KCC2 באמצעות כתם מערבי

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called &#8220;concentric&#8221; ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.

We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.

Microelectrodes כפולה קנה וקונצנטריים עבור אותות המדידה של תאי יון ברקמת המוח

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into portions attributable to each channel type. This study demonstrates how impedance spectroscopy may be used to identify specific frequencies that highly correlate with the steady state current amplitude measured during voltage clamp experiments. The method involves inserting a noise function containing specific frequencies into the voltage step protocol. In the work presented, a model cell is used to demonstrate that no high correlations are introduced by the voltage clamp circuitry, and also that the noise function itself does not introduce any high correlations when no ion channels are present. This validation is necessary before the technique can be applied to preparations containing ion channels. The purpose of the protocol presented is to demonstrate how to characterize the frequency response of a single ion channel type to a noise function. Once specific frequencies have been identified in an individual channel type, they can be used to reproduce the steady state current voltage (IV) curve. Frequencies that highly correlate with one channel type and minimally correlate with other channel types may then be used to estimate the current contribution of multiple channel types measured simultaneously.
METHODS: Voltage clamp measurements were performed on a model cell using a standard voltage step protocol (-150 to +50 mV, 5mV steps). Noise functions containing equal magnitudes of 1-15 kHz frequencies (zero to peak amplitudes: 50 or 100mV) were inserted into each voltage step. The real component of the Fast Fourier transform (FFT) of the output signal was calculated with and without noise for each step potential. The magnitude of each frequency as a function of voltage step was correlated with the current amplitude at the corresponding voltages.
RESULTS AND CONCLUSIONS: In the absence of noise (control), magnitudes of all frequencies except the DC component correlated poorly (|R|&lt;0.5) with the IV curve, whereas the DC component had a correlation coefficient greater than 0.999 in all measurements. The quality of correlation between individual frequencies and the IV curve did not change when a noise function was added to the voltage step protocol. Likewise, increasing the amplitude of the noise function also did not increase the correlation. Control measurements demonstrate that the voltage clamp circuitry by itself does not cause any frequencies above 0 Hz to highly correlate with the steady-state IV curve. Likewise, measurements in the presence of the noise function demonstrate that the noise function does not cause any frequencies above 0 Hz to correlate with the steady-state IV curve when no ion channels are present. Based on this verification, the method can now be applied to preparations containing a single ion channel type with the intent of identifying frequencies whose amplitudes correlate specifically with that channel type.

There are technical obstacles to measuring current flux through multiple ion channels simultaneously, and later discerning what portion of the transmembrane current is due to each channel type. To address this need, this method presents a way to generate the IV curve of individual channel types using specific frequency components.

סיכום של Curve ערוץ IV יון באמצעות רכיבי תדר

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into ...

A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins

To date, more than 50% of all pharmacological drugs target the transport kinetics of membrane proteins. The electrophysiological characterization of membrane carrier proteins reconstituted in lipid bilayer membranes is a powerful but delicate method for the assessment of their physicochemical and pharmacological properties. The substrate turnover number is a unique parameter that allows the comparison of the activity of different membrane proteins. In an electrogenic transport, the gradient of the translocated substrate creates a membrane potential that directly correlates to the substrate turnover rate of the protein. By using silver chloride electrodes, a diffusion potential, also called liquid junction potential, is induced, which alters electrode potential and significantly disturbs precise membrane potential measurements. Diffusion potential can be minimized by a salt bridge, which balances electrode potential. In this article, a micro-agar salt bridge is designed to improve the electrophysiological set-up, which uses micropipettes for the membrane formation. The salt solution is filled into a microcapillary pipette tip, stabilized by the addition of agarose, and can be easily mounted to a standard electrode. The electrode potential of a micro-salt bridge electrode is more stable compared to a standard electrode. The implementation of this system stabilizes electrode potential and allows more precise measurements of membrane potential generated by a pH gradient. Using this system, the proton turnover rates of the mitochondrial carriers UCP1 and UCP3 are reinvestigated and compared to earlier measurements.

In electrophysiological measurements, the presence of a diffusion potential disturbs the precise measurement of the reverse potential by altering the electrode potential. Using a micro-agar salt bridge, the impact of the diffusion potential is minimized, which allows a more precise measurement of substrate turnover numbers of reconstituted recombinant membrane proteins.

אלקטרודה מיקרו-אגר מלח גשר ניתוח שיעור תחלופה פרוטון של חלבוני ממברנה רקומביננטי

To date, more than 50% of all pharmacological drugs target the transport kinetics of membrane proteins. The electrophysiological characterization of ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

מדידת תחבורת קטיון ידי Na, K-ו-H, K-ATPase ב<em&gt; Xenopus</em&gt; ביציות על ידי spectrophotometry קליטה האטומית: חלופית למבחני radioisotope

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

מבוא לממברנה מוצקה נתמכות המבוססת Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and neurotransmitter loading in synaptic vesicles. This acidification is described to be mediated by proton ATPases, coupled to ClC chloride transporters. Highly-conserved electroneutral protons transporters, the Na+/H+ exchangers (NHE) 6, 7 and 9 are also expressed in these compartments. Mutations in their genes have been linked with human cognitive and neurodegenerative diseases. Paradoxically, their roles remain elusive, as their intracellular localization has prevented detailed functional characterization. This manuscript shows a method to solve this problem. This consists of the selection of mutant cell lines, capable of surviving acute cytosolic acidification by retaining intracellular NHEs at the plasma membrane. It then depicts two complementary protocols to measure the ion selectivity and activity of these exchangers: (i) one based on intracellular pH measurements using fluorescence video microscopy, and (ii) one based on the fast kinetics of lithium uptake. Such protocols can be extrapolated to measure other non-electrogenic transporters. Furthermore, the selection procedure presented here generates cells with an intracellular retention defective phenotype. Therefore these cells will also express other vesicular membrane proteins at the plasma membrane. The experimental strategy depicted here may therefore constitute a potentially powerful tool to study other intracellular proteins that will be then expressed at the plasma membrane together with the vesicular Na+/H+ exchangers used for the selection.

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

יישום המדידה Electrophysiology ללמוד את הפעילות של מובילי אלקטרו-נייטרלי

Summary

Explore More Videos