1. המלצות לפני שמתחיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תשתמש בPSCs מזוהם בmycoplasma כי הם לא יבדילו כראוי לתאי צומת סינוס. מבחן לזיהום mycoplasma לפני תחילת הפרוטוקול. לעשות את זה באמצעות ערכת PCR לגילוי מהיר, רגיש מאוד של mycoplasmas ולעקוב אחר פרוטוקול manufacturer`s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל צלחת פטרי (צעד 2.3.4), מעיל סנטימטר אחד 10 צלחת תרבות 2 תא עם ג&#39;לטין סטרילי 7 מיליליטר 0.1% מעור דג מים קרים למשך שעת 1 ב 37 ° C. הסר את הג&#39;לטין ולתת יבש מנה בתנאים סטריליים בספסל סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שתוכל להתחיל את פרוטוקול הבידול אתה צריך שיבוט כפול עכבר היציב transfected ES קו תא המכיל את התכונות הבאות: i) מכוננת על ביטוי של TBX3 באמצעות וקטור ביטוי יונקים. Ii) גן התנגדות G418 תחת שליטתו של Myh6-האמרגן 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים שלא עברו התמיינות PSCs צריכים להיות שותף לטפחד עם תאים מזינים המוקרנים בתנאים סטנדרטיים כמתואר 1. </li></ol> 2. בידול נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ימים לפני התמיינות - הסר PSCs מהתאים מזינים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום, לשטוף את התאים עם מי מלח שנאגרו 10 מיליליטר פוספט PBS, להוסיף 7 מיליליטר פתרון Collagenase IV ודגירת התאים במשך 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס. מניחים מסנן 40 מיקרומטר סטרילי בשפופרת 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בזהירות את מושבות PSC (להימנע מלהסיר את התאים מזינים) על ידי pipetting פתרון collagenase למעלה ולמטה 5 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את ההשעיה התא למסנן 40 מיקרומטר, יש לשטוף את המסנן שלוש פעמים עם 8 מיליליטר PBS. להסתובב המסנן ולמקם אותו במהופך בצלחת פטרי. הסר את מושבות תאי PSC ידי pipetting 10 מיליליטר PBS לתחתית המסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את ההשעיה תא צינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 300 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBS, להשעות את התאים 1 מיליליטר Accutase וincubate על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיליליטר PBS, לערבב את פתרון התא על ידי pipetting מעלה ומטה 5 פעמים וצנטריפוגות במשך 5 דקות ב 300 x g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBS, להשעות את התאים במדיום גידול 10 מ&quot;ל ולקבוע את מספר התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע 15,000 / 2 סנטימטר על בקבוק 2 מסנן 75 סנטימטר ולטפח אותם במשך 2 ימים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לאחר 2 ימי הבקבוק צריך להיות 50-70% ומחוברות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 0 - התחל של בידול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום ולשטוף את התאים עם 10 מיליליטר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PBS, להוסיף 2 מיליליטר Accutase ו דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מניחים מסנן 40 מיקרומטר סטרילי בשפופרת 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיליליטר PBS, להעביר את ההשעיה התא למסנן 40 מיקרומטר, יש לשטוף את המסנן באמצעות תוספת של 10 מיליליטר PBS ו צנטריפוגות הזרימה דרך במשך 5 דקות ב 300 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את התאים בינוניים בידול 10 מיליליטר ולקבוע את מספר התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל tהוא תא השעיה עם מדיום בידול לריכוז סופי של 20,000 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 20 מיליליטר מים ו -5 מיליליטר תלוי טיפת פתרון (HD) בצלחת פטרי ריבועית, כדי למנוע התייבשות של HDS. הערה: לכל 24 iSABs צלחת המכילה גם (ראה סעיף 2.8.6.4/2.8.7) להתחיל עם 16 צלחות פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה עד 50 מיליליטר השעיה תא במגש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסתובב את המכסה של צלחת פטרי. הנח 180 HDS כל 20 μl המכיל (400 תאים / HD) השעיה תא על המכסה בעזרת פיפטה 12 ערוצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך בזהירות מסביב למכסה ומניח אותו על גבי צלחת פטרי. הערה: המהירות להסתובב המכסה היא מאוד חשובה. אם המכסה הסתובב לאט מדי או מהר מדי, את המתח של ההשעיה תא השטח אינו גבוה מספיק כדי לשמר את תליית טיפות על המכסה. לפני שאנסה לייצר HDS לאימון בפעם הראשון להסתובב עם המכסה 20 טיפות μl של מדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפח את התאים עבור 2 ימים בשעה 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 כדי לאפשר להם ליצור EBS. הערה: מקום צלחת פטרי אחת מלא במים בחלק העליון של ערימה של 5 צלחות פטרי. אחרת HD בצלחת פטרי העליונה יתייבש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך בזהירות מסביב למכסה של צלחת פטרי ריבועית ולהעביר את EBS נגזר משתי צלחות פטרי (360 EBS) לצינור 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה 10 דקות כדי לאפשר לEBS להתיישב בחלק התחתון של הצינור (אל צנטריפוגות EBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב באותה המידה בינונית ככל האפשר, להשעות את EBS ב 10 מיליליטר בינוני בידול ולהעביר את ההשעיה לצלחת פטרי 10 סנטימטרים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות 2-6 השעיה יום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפח את EBS בהשעיה למשך 4 ימים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, לשנות בינוני לאחר 2 ימים. הערה: למרות שצלחת פטרי לא מצופה (בניגוד לצלחת תרבית תאים) EBS לעתים קרובות לצרף אל פני השטח. לשלוט בצלחות פטרי לEBS מצורף בכל יום, ואם יש צורך ניתוק EBSמהמשטח על ידי pipetting העדין. אופציונאלי: לנער את צלחות פטרי ברציפות בתקופת תרבות השעיה. תיזהר עם המהירות של ייקר. EBS צריך לא לצבור באמצע ולא לצוף לגבול של צלחות פטרי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 6 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את EBS מאחד צלחת פטרי לג&#39;לטין אחד 10 סנטימטרים מצופים צלחת תרבות 2 תא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 7-12 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים צריכים להתחיל לנצח לאחר 8-12 ימים. בדקו אם מכה מוקדים של התאים יומיים תחת מיקרוסקופ. התאים מתחילים ליצור שכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה בינונית יומי. הערה: לאחר השינוי בינוני, התאים דורשים 3-4 שעות להתאושש ולהתחיל להכות שוב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירת 12-15 היום של תאי קטרי סינוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלושה ימים לאחר שהתאים החלו להכות (סביב היום 12-15), לשאוב מיליליטר 10 הבינוני ופיפטה של ​​מדיום בידול טרי המכיל G418 / מיליליטר 400 מיקרוגרם לתאים. </li></ol></li><li&gt; ארבעה ימים לאחר תחילת הבחירה לנתק את שכבת התאים. הערה: ייתכן ששכבת התאים כבר מנותקת מהשטח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום בזהירות מבלי aspirating שכבת התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מיליליטר של PBS ולהסיר את PBS בזהירות מבלי aspirating שכבת התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיליליטר של תמיסת Collagenase IV, להעביר את תאי צינור 50 מיליליטר ו דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במרץ לערבב את ההשעיה על ידי pipetting למעלה ולמטה 10 פעמים ודגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. השעיה של אשכולות קטנים צריכה להתרחש. אם יש עדיין חלקים עצומים של השכבה עזבה, חזור על שלב 2.8.4 פעמים נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 20 מיליליטר של PBS ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 300 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PBS בזהירות. הערה: אם iSABs הוא להיות שנוצר להמשיך עם צעד 2.8.7. אם תאים בודדים קטרי סינוס נגזר iSAB הם להיות שנוצרו להמשיך בשלב 2.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את התאיםב -12 מיליליטר בינוני בידול המכיל G418 / מיליליטר 400 מיקרוגרם וזרעם על 6 בארות של ג&#39;לטין מצופה 24 בארות (2 מיליליטר / טוב). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דור של תא בודד קטרי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את התאים מצעד 2.8.6 ב 5 מיליליטר Accutase ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במרץ לערבב את ההשעיה על ידי pipetting למעלה ולמטה 10 פעמים ודגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 20 מיליליטר של PBS ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 300 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את התאים בינוניים בידול 12 מיליליטר מכילים G418 / מיליליטר 400 מיקרוגרם וזרעם על 6 בארות של ג&#39;לטין המצופה 24 בארות (2 מיליליטר / טוב). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום 2 לאחר ניתוק, לשאוב את המדיום ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. הוסף 1 מיליליטר בינוני בידול / טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 4-8 לאחר הניתוק, לשנות בינוני כל 2 nd יום. ביום 10 אחרי iSABs שימוש דיסוציאציה או בסינוסים נגזרים iSAB קטרי תאים בודדים זמינים לניתוח נוסף. </li></ol>

<ol>
	<li>Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+mouse+embryonic+stem+cells+are+able+to+differentiate+into+cardiomyocytes+expressing+chronotropic+responses+to+adrenergic+and+cholinergic+agents+and+Ca2++channel+blockers.">Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers.</a> Differentiation. 48 (3), 173-182 (1991).</li><li>David, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MesP1+drives+vertebrate+cardiovascular+differentiation+through+Dkk-1-mediated+blockade+of+Wnt-signalling.">MesP1 drives vertebrate cardiovascular differentiation through Dkk-1-mediated blockade of Wnt-signalling.</a> Nat Cell Biol. 10, 338-345 (2008).</li><li>David, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+programming+of+pluripotent+stem+cells+towards+distinct+cardiovascular+cell+types.">Forward programming of pluripotent stem cells towards distinct cardiovascular cell types.</a> Cardiovasc Res. 84 (2), 263-272 (2009).</li><li>Hoogaars, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx3+controls+the+sinoatrial+node+gene+program+and+imposes+pacemaker+function+on+the+atria.">Tbx3 controls the sinoatrial node gene program and imposes pacemaker function on the atria.</a> Genes Dev. 21 (9), 1098-1112 (2007).</li><li>Klug, M. G., Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+selected+cardiomyocytes+from+differentiating+embronic+stem+cells+form+stable+intracardiac+grafts.">Genetically selected cardiomyocytes from differentiating embronic stem cells form stable intracardiac grafts.</a> J Clin Invest. 98 (1), 216-224 (1996).</li><li>Marger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaker+activity+and+ionic+currents+in+mouse+atrioventricular+node+cells.">Pacemaker activity and ionic currents in mouse atrioventricular node cells.</a> Channels (Austin). 5 (3), 241-250 (2011).</li><li>Jung, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+and+isolation+of+highly+pure+physiologically+and+pharmacologically+functional+sinus-nodal+bodies+from+pluripotent+stem+cells).">Programming and isolation of highly pure physiologically and pharmacologically functional sinus-nodal bodies from pluripotent stem cells).</a> Stem cell reports. 2 (5), 592-605 (2014).</li><li>Maltsev, V. A., Wobus, A. M., Rohwedel, J., Bader, M., Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+differentiated+in+vitro+from+embryonic+stem+cells+developmentally+express+cardiac-specific+genes+and+ionic+currents.">Cardiomyocytes differentiated in vitro from embryonic stem cells developmentally express cardiac-specific genes and ionic currents.</a> Circulation research. 75 (2), 233-244 (1994).</li><li>He, J. Q., Ma, Y., Lee, Y., Thomson, J. A., Kamp, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+develop+into+multiple+types+of+cardiac+myocytes:+action+potential+characterization.">Human embryonic stem cells develop into multiple types of cardiac myocytes: action potential characterization.</a> Circ Res. 93 (1), 32-39 (2003).</li><li>Yanagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels+and+T-type+calcium+channels+confer+automaticity+of+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels and T-type calcium channels confer automaticity of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem cells. 25 (11), 2712-2719 (2007).</li><li>Barbuti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+composition+and+functional+properties+of+f-channels+in+murine+embryonic+stem+cell-derived+pacemaker+cells.">Molecular composition and functional properties of f-channels in murine embryonic stem cell-derived pacemaker cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 46 (3), 343-351 (2009).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents.">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American journal of physiology. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H2006-H2017 (2011).</li><li>David, R., Franz, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+pluripotency+to+distinct+cardiomyocyte+subtypes.">From pluripotency to distinct cardiomyocyte subtypes.</a> Physiology (Bethesda). 27 (3), 119-129 (2012).</li><li>Scavone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-derived+CD166++precursors+develop+into+fully+functional+sinoatrial-like+cells).">Embryonic stem cell-derived CD166+ precursors develop into fully functional sinoatrial-like cells).</a> Circ Res. 113 (4), 389-398 (2013).</li><li>Morikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation+and+characterization+of+HCN4-positive+pacemaking+cells+derived+from+murine+embryonic+stem+cells+during+cardiac+differentiation.">Identification, isolation and characterization of HCN4-positive pacemaking cells derived from murine embryonic stem cells during cardiac differentiation.</a> Pacing Clin Electrophysiol. 33 (33), 290-303 (2010).</li><li>Wiese, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+sinus+node+head+and+differentiation+of+sinus+node+myocardium+are+independently+regulated+by+Tbx18+and+Tbx3.">Formation of the sinus node head and differentiation of sinus node myocardium are independently regulated by Tbx18 and Tbx3.</a> Circ Res. 104 (3), 388-397 (2009).</li><li>Kleger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+calcium-activated+potassium+channels+induces+cardiogenesis+of+pluripotent+stem+cells+and+enrichment+of+pacemaker-like+cells.">Modulation of calcium-activated potassium channels induces cardiogenesis of pluripotent stem cells and enrichment of pacemaker-like cells.</a> Circulation. 122 (18), 1823-1836 (2010).</li><li>Bakker, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-box+transcription+factor+TBX3+reprogrammes+mature+cardiac+myocytes+into+pacemaker-like+cells.">T-box transcription factor TBX3 reprogrammes mature cardiac myocytes into pacemaker-like cells.</a> Cardiovasc Res. 94 (3), 439-449 (2012).</li><li>Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+quiescent+cardiomyocytes+to+pacemaker+cells+by+expression+of+Tbx18.">Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18.</a> Nat Biotechnol. 31 (1), 54-62 (2013).</li><li>Johns, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+expression+of+a+voltage-gated+potassium+channel+in+vitro+(rat+cardiac+myocytes)+and+in+vivo+(rat+liver).+A+novel+strategy+for+modifying+excitability.">Adenovirus-mediated expression of a voltage-gated potassium channel in vitro (rat cardiac myocytes) and in vivo (rat liver). A novel strategy for modifying excitability.</a> J Clin Invest. 96 (2), 1152-1158 (1995).</li><li>Nuss, H. B., Marban, E., Johns, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+a+human+potassium+channel+suppresses+cardiac+hyperexcitability+in+rabbit+ventricular+myocytes.">Overexpression of a human potassium channel suppresses cardiac hyperexcitability in rabbit ventricular myocytes.</a> J Clin Invest. 103 (6), 889-896 (1999).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

היכולת לייצר תאי גזע קוצב לב תא נגזרים לב עשוי לאפשר הכינון מחדש של קצב הלב התקין, במובן של &quot;קוצבי לב ביולוגיים&quot;. כמו כן, בדיקות סמים במבחנה תיהנה מזמינותם. PSCs יכול להצמיח כל סוג תא בגוף של היונקים, כולל שריר לב עם מאפייני תא קוצב לב 8,9,10,11,12,13. עם זאת, בדרך כלל א?...

&quot;תסמונת סינוס החולה&quot; הטווח מסכמת מחלות מרובות שהובילו להידרדרות מערכת קוצב לב. היא כוללת ברדיקרדיה פתולוגי, סימפטומטי סינוס, בלוק sinoatrial, מעצר סינוס, כמו גם את תסמונת טכיקרדיה-ברדיקרדיה. וכך, &quot;תסמונת סינוס חולה&quot; מלווה לעתים קרובות במחל לב כלליות כגון מחלת לב איסכמית, cardiomyopathies או דלקת שריר לב. נכון לעכשיו, גישות טיפוליות המבוססות על השתלת קוצבי לב של חשמל. עם זאת, זה הולך ביחד עם מספר הסיכונים, כגון זיהומים וכשל סוללה. בסך הכל, השכיחות של סיבוכים היא עדיין גבוהה מאוד בחולים שהושתלו קוצב לב מלאכותי. יתר על כן, בניגוד לקוצב לב אנדוגני, התקנים אלה אינם מגיבים לגירוי הורמונלי. חלופה עתידית עשויה להסתמך על הזמינות של &quot;קוצבי לב ביולוגיים&quot; שיכול לשמש PSCsכמקור סלולארי מתאים ושיהיה גם יקר מאוד במבחנת בדיקות סמים. עם זאת, בעיה עיקרי טמון בהופעה נדירה מאוד של תאי קטרי סינוס בתוך גופי embryoid (EBS) - זה בדרך כלל אינו עולה על 0.5% ~ 1. בעבר, ניתן היה לראות כי &quot;תכנות קדימה&quot; לקראת תת cardiomyocyte ספציפי ניתן לביצוע באמצעות ביטוי יתר של גורמים שונים בתחילת שעתוק לב וכלי דם כגון גורם המזודרם ספציפי, אחורי 1 (MesP1) ושעתוק NK2 הקשורים, לוקוס 5 (Nkx2.5) 2, 3. לגודל ותפקוד של צומת sinoatrial (SAN) רגילים, Tbx3 גורם שעתוק T-התיבה הוא חיוני, אשר הוכח כדי ליזום את תכנית גן קוצב לב ולשלוט בידול של 4 SAN. אמנם זה משופר המראה של תאי קוצב פונקציונליים, התוכן עדיין לא עלה על ~ 40% בקרב אוכלוסיית תא cardiomyocytic כולו. לכן, צעד בחירת אנטיביוטיקה מבוסס Myh6-אמרגן נוסף 5 הוצג על ידינו. זה סופו של דבר מוביל לאגרגטים עד כה לא נצפו cardiomyocyte (&quot;גופים הנגרמים סין-פרוזדורים;&quot; iSABs &quot;) אשר התערוכה גדלו מאוד תדרי מכות (&gt; 400 פעימות לדקה) במבחנה, בפעם הראשונה לאלו של לב עכברי ודומים לטפח במבחנה תאי קטרי סינוס המבודדים מלב עכברי 6. תחת ממשל Isoprenaline אפילו תדרים פועמים של 550 פעימות לדקה מושגות. יש לציין, iSABs מורכב של מעל 80% תאי קטרי פונקציונליים כפי שעולים פיסיולוגי נרחב מנתח 7. לאחרונה, מספר גישות ליצירת תאי סינוס קטרי באמצעות תכנות מחדש ישיר 19, משטח סמני 14 או טיפול תרופתי עם מולקולות קטנות 16,17 תוארה. עם זאת, אף אחת מהשיטות הללו הוביל לטוהר גבוה כל כך של תאי קוצב לב ומכה את תדרים קרובים לעכברי הואאמנות כפי שנצפה בiSABs. יתר על כן, במודל vivo לשעבר של פרוסות חדרית מעובד עכבר מבוגר שאבדו את פעילות המכות הספונטנית שלהם, iSABs מסוגל להשתלב ברקמה הפרוסה, כך שנותרו פעיל באופן ספונטני ובאופן עמיד צעדה פרוסות לב להתכווצויות 7. פרוטוקול מפורט לדור של iSABs אלה מתואר במאמר זה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="597">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:131px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iscove&#39;s liquid medium with stable glutamine</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>FG 0465</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM liquid medium without Na-pyruvate, with stable glutamine</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>FG 0435</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CLS type IV, CLS IV</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>C4-22</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Non-essential amino acids</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>K 0293</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS Superior</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>S 0615</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>L 0473</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G 418-BC liquid (ready-to-use solution), sterile</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>A 2912</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent reservoir PP f.multichannel pip. 60ml,sterile</td>
			<td>Brand</td>
			<td>703409</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Accutase</td>
			<td>eBioscience,Inc.</td>
			<td>00-4555-56</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, electronic pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000155</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon Cell Strainer 40&#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>P11-010</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Petri Dishes</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>663102</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS without Ca and Mg</td>
			<td>PAN-Biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>PAN-Biotech</td>
			<td>P30-3302</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leukemia inhibitory factor</td>
			<td>Phoenix Europe GmbH</td>
			<td>LIF-250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quadratic petri dishes</td>
			<td>Roth</td>
			<td>PX67.1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>G7765</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>M3148&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Thioglycerol</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>M6145</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue culture dishes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue culture flask</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue culture test plates (24 well)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92424</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of murine cardiac pacemaker cell aggregates based on es-cell-programming in combination with myh6-promoter-selection

טיפול ב&quot; תסמונת סינוס החולה &quot;מבוסס על קוצבי לב מלאכותיים. אלה נושאים סכנות כגון כשל סוללה וזיהומים. יתר על כן, הם חסרים את היענות הורמון וההליך הכולל הוא עלות עתיר. &quot;קוצבי לב ביולוגיים&quot; שנוצרו מPSCs עשוי להיות אלטרנטיבה, עדיין התוכן האופייני לתאי קוצב לב בגופים Embryoid (EBS) הוא נמוך ביותר. הפרוטוקול המתואר משלב &quot;תכנות קדימה&quot; של PSCs העכברי באמצעות TBX3 inducer צומת סינוס עם בחירת אנטיביוטיקה מבוססת Myh6-אמרגן. זה מניב אגרגטים cardiomyocyte עקביים של תאי קוצב לב מבחינה פיזיולוגית תפקודיים&gt; 80%. אלה &quot;הנוצרים על-sinoatrial-גופים&quot; (&quot;iSABs&quot;) באופן ספונטני הידבקות בתדרים עדיין unreached (400-500 פעימות לדקה) המתאימים לתאי קטרי מבודדים מלב עכבר והם מסוגלים לצעוד שריר לב vivo לשעבר עכברי. באמצעות הפרוטוקול המתואר סינוס הטהור ביותריכולים להיות שנוצרו תאים בודדים קטרי שלדוגמה ניתן להשתמש במבחנת בדיקות סמים. יתר על כן, iSABs שנוצר על פי פרוטוקול זה עלול להפוך לצעד מכריע לקראת הנדסת רקמות לב.

הפרוטוקול המתואר מאפשר דור של iSABs בתדירות פעימות סביב 450 פעימות לדקה מPSCs (שמוצג בסרט) שנמצא ליד לתדר פעימות לב עכבר. לאחר הניתוק של iSABs (שלב 2.8.8) תאים בודדים שנצפו להראות את הצורה האופיינית לתאים של צומת סינוס (תאי כישור ועכביש) כפי שמוצג באיור 1. תאים אלה חלבונים...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection at JoVE.com

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר רקמת קטרי פונקציונלית סינוס מתאי גזע עכבריים pluripotent (PSC). T-Box3 ביטוי יתר (TBX3) בתוספת מבחר אנטיביוטי אמרגן שרירן-כבד-שרשרת לב (Myh6) מוביל לאגרגטים תא קוצב לב טהורים מאוד. אלה &quot;הנוצרים על-sinoatrial-גופים&quot; (&quot;iSABs&quot;) מכילים מעל 80 תאי קוצב%, להראות גדלו מאוד שיעורי מכות והם מסוגלים לצעוד שריר לב vivo לשעבר.

דור של אגרגטים תא Murine לב קוצב לב בהתבסס על ES-Cell-תכנות בשילוב עם Myh6-יזם-בחירה

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

generation-murine-cardiac-pacemaker-cell-aggregates-based-on-es-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.6K Views.  University of Rostock.  פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר רקמת קטרי פונקציונלית סינוס מתאי גזע עכבריים pluripotent (PSC). T-Box3 ביטוי יתר (TBX3) בתוספת מבחר אנטיביוטי אמרגן שרירן-כבד-שרשרת לב (Myh6) מוביל לאגרגטים תא קוצב לב טהורים מאוד. אלה "הנוצרים על-sinoatrial-גופים" ("iSABs") מכי...

Video: Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in vitro toxicity testing of potential drugs. To provide a solid scientific basis for such assays, it will be important to gain quantitative information on the time course of development and on the underlying regulatory mechanisms by systems biology approaches. Two assays have therefore been tuned here for these requirements. In the UKK test system, human embryonic stem cells (hESC) (or other pluripotent cells) are left to spontaneously differentiate for 14 days in embryoid bodies, to allow generation of cells of all three germ layers. This system recapitulates key steps of early human embryonic development, and it can predict human-specific early embryonic toxicity/teratogenicity, if cells are exposed to chemicals during differentiation. The UKN1 test system is based on hESC differentiating to a population of neuroectodermal progenitor (NEP) cells for 6 days. This system recapitulates early neural development and predicts early developmental neurotoxicity and epigenetic changes triggered by chemicals. Both systems, in combination with transcriptome microarray studies, are suitable for identifying toxicity biomarkers. Moreover, they may be used in combination to generate input data for systems biology analysis. These test systems have advantages over the traditional toxicological studies requiring large amounts of animals. The test systems may contribute to a reduction of the costs for drug development and chemical safety evaluation. Their combination sheds light especially on compounds that may influence neurodevelopment specifically.

The protocols describe two in vitro developmental toxicity test systems (UKK and UKN1) based on human embryonic stem cells and transcriptome studies. The test systems predict human developmental toxicity hazard, and may contribute to reduce animal studies, costs and the time required for chemical safety testing.

תאי גזע אנושיים pluripotent בהתבסס התפתחותית רעילות מבחני לביולוגיה הקרנה ומערכות בטיחות כימית נתונים דור

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

We have developed a protocol improving current Embryoid Body (EB) culture which allows the study of self-organization, symmetry breaking, axial elongation and cell fate specification using aggregates of mouse embryonic stem cells (mESCs) in suspension culture. Small numbers of mESCs are aggregated in basal medium for 48 hr in non-tissue-culture-treated, U-bottomed 96-well plates, after which they are competent to respond to experimental signals. Following treatment, these aggregates begin to show signs of polarized gene expression and gradually alter their morphology from a spherical mass of cells to an elongated, well organized structure in the absence of external asymmetry cues. These structures are not only able to display markers of the three germ layers, but actively display gastrulation-like movements, evidenced by a directional dislodgement of individual cells from the aggregate, which crucially occurs at one region of the elongated structure. This protocol provides a detailed method for the reproducible formation of these aggregates, their stimulation with signals such as Wnt/&#946;-Catenin activation and BMP inhibition and their analysis by single time-point or time-lapse fluorescent microscopy. In addition, we describe modifications to current whole-mount mouse embryo staining procedures for immunocytochemical analysis of specific markers within fixed aggregates. The changes in morphology, gene expression and length of the aggregates can be quantitatively measured, providing information on how signals can alter axial fates. It is envisaged that this system can be applied both to the study of early developmental events such as axial development and organization, and more broadly, the processes of self-organization and cellular decision-making. It may also provide a suitable niche for the generation of cell types present in the embryo that are unobtainable from conventional adherent culture such as spinal cord and motor neurones.

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

We have developed a protocol to generate aggregates of mouse embryonic stem cells that display self-organization, symmetry breaking and elongation paralleling axial development. This technique allows the study of axial developmental processes and the generation of cell types that are otherwise difficult to perform in monolayer culture.

דור של אגרגטים של תאי עכבר גזע עובריים שצג שבירת סימטריה, קיטוב והתנהגות קולקטיבית מתהווה<em&gt; במבחנה</em

We have developed a protocol improving current Embryoid Body (EB) culture which allows the study of self-organization, symmetry breaking, axial elongation ...

Aggregate Size Optimization in Microwells for Suspension-based Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates. Conventional aggregate formation of hPSCs involves dissociating cell colonies into smaller clumps, with size control of the clumps crudely controlled by pipetting the cell suspension until the desired clump size is achieved. One of the main challenges of conventional aggregate-based cardiac differentiation of hPSCs is that culture heterogeneity and spatial disorganization lead to variable and inefficient cardiomyocyte yield. We and others have previously reported that human embryonic stem cell (hESC) aggregate size can be modulated to optimize cardiac induction efficiency. We have addressed this challenge by employing a scalable, microwell-based approach to control physical parameters of aggregate formation, specifically aggregate size and shape. The method we describe here consists of forced aggregation of defined hPSC numbers in microwells, and the subsequent culture of these aggregates in conditions that direct cardiac induction. This protocol can be readily scaled depending on the size and number of wells used. Using this method, we can consistently achieve culture outputs with cardiomyocyte frequencies greater than 70%.

Conventional methods to initiate suspension aggregate based cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) are plagued with culture heterogeneity with respect to aggregate size and shape. Here, we describe a robust method for cardiac differentiation employing microwells to generate size-controlled hPSC aggregates cultured under cardiac-promoting conditions.

אופטימיזציה גודל המצרפי Microwells עבור מבוססי השעיה בידול לב של תאי גזע אנושיים pluripotent

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates.  Conventional aggregate formation ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

רומן חדש פאט שומן טכניקת השתלת לדמיין את כלי השיט הדור של כלי הדם בתאי גזע אנדותל

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

דור של אינסולין נטולת לגרדום, תלת מימדי לבטא Pancreatoids העכבר אבות הלבלב במבחנה

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

ניתוח התפתחות קאמרית הלב במהלך מופרה העכבר באמצעות כל הר Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in developmental cardiology have led to generating cardiac cells from pluripotent stem cells, it is unclear if the two cardiac fields - the first and second heart fields (FHF and SHF) &#8212; are induced in pluripotent stem cells systems. To address this, we generated a protocol for in vitro specification and isolation of heart field-specific cardiac progenitor cells. We used embryonic stem cells lines carrying Hcn4-GFP and Tbx1-Cre; Rosa-RFP reporters of the FHF and the SHF, respectively, and live cell immunostaining of the cell membrane protein Cxcr4, a SHF marker. With this approach, we generated progenitor cells which recapitulate the functional properties and transcriptome of their in vivo counterparts. Our protocol can be utilized to study early specification and segregation of the two heart fields and to generate chamber-specific cardiac cells for heart disease modelling. Since this is an in vitro organoid system, it may not provide precise anatomical information. However, this system overcomes the poor accessibility of gastrulation-stage embryos and can be upscaled for high-throughput screens.

The purpose of this method is to generate heart field-specific cardiac progenitor cells in vitro in order to study the progenitor cell specification and functional properties, and to generate chamber specific cardiac cells for heart disease modelling.

בדור מחוץ לתחום של לב העכבר שדה מסוים בתאי לב

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine mammary gland is composed of two distinct epithelial cell compartments, serving different functions: the outer, contractile myoepithelial compartment and the inner, secretory luminal compartment. Here, we describe a method by which the cells comprising these compartments are isolated and then combined to investigate their individual lineage contributions to mammary gland morphogenesis and differentiation. The method is simple and efficient and does not require sophisticated separation technologies such as fluorescence activated cell sorting. Instead, we harvest and enzymatically digest the tissue, seed the epithelium on adherent tissue culture dishes, and then use differential trypsinization to separate myoepithelial from luminal cells with ~90% purity. The cells are then plated in an extracellular matrix where they organize into bilayered, three-dimensional (3D) organoids that can be differentiated to produce milk after 10 days in culture. To test the effects of genetic mutations, cells can be harvested from wild type or genetically engineered mouse models, or they can be genetically manipulated prior to 3D culture. This technique can be used to generate mosaic organoids that allow investigation of gene function specifically in the luminal or myoepithelial compartment.

The mammary gland is a bilayered structure, comprising outer myoepithelial and inner luminal epithelial cells. Presented is a protocol to prepare organoids using differential trypsinization. This efficient method allows researchers to separately manipulate these two cell types to explore questions concerning their roles in mammary gland form and function.

הדור של הפסיפס של חלב באמצעות טריסיזציה דיפרנציאלית

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the blood that can disrupt delicate brain function. As such, the BBB is a major obstacle to the delivery of therapeutics to the CNS. Accumulating evidence suggests that the BBB plays a key role in the onset and progression of neurological diseases. Thus, there is a tremendous need for a BBB model that can predict penetration of CNS-targeted drugs as well as elucidate the BBB&#39;s role in health and disease.
We have recently combined organ-on-chip and induced pluripotent stem cell (iPSC) technologies to generate a BBB chip fully personalized to humans. This novel platform displays cellular, molecular, and physiological properties that are suitable for the prediction of drug and molecule transport across the human BBB. Furthermore, using patient-specific BBB chips, we have generated models of neurological disease and demonstrated the potential for personalized predictive medicine applications. Provided here is a detailed protocol demonstrating how to generate iPSC-derived BBB chips, beginning with differentiation of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells (iBMECs) and resulting in mixed neural cultures containing neural progenitors, differentiated neurons, and astrocytes. Also described is a procedure for seeding cells into the organ chip and culturing of the BBB chips under controlled laminar flow. Lastly, detailed descriptions of BBB chip analyses are provided, including paracellular permeability assays for assessing drug and molecule permeability as well as immunocytochemical methods for determining the composition of cell types within the chip.

The blood-brain barrier (BBB) is a multicellular neurovascular unit tightly regulating brain homeostasis. By combining human iPSCs and organ-on-chip technologies, we have generated a personalized BBB chip, suitable for disease modeling and CNS drug penetrability predictions. A detailed protocol is described for the generation and operation of the BBB chip.

הדור של המוח האנושי מבוסס על-ידי שבב דם-מחסום

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...