בדור מחוץ לתחום של לב העכבר שדה מסוים בתאי לב

השיטה שלנו שואפת ליצור תאי לב ספציפיים ללב תאי לב מתאים גזע עובריים של עכבר. קו תאי גזע זה של כתב שדה הלב מאפשר מחקר תפוקה גבוהה של המנגנונים שבבסיס מחלת לב מולדת, ומספק מערכת נוחה למניפולציה גנטית ופרמקולוגית. ישנן מספר מחלות לב מולדות ספציפיות לתא.

על ידי recapitulating cardiogenesis במבחנה, פרוטוקול זה מאפשר את המחקר של מנגנון המחלה ופיתוח של טיפולים רגנרטיביים בעתיד. פרוטוקול זה יכול לספק תובנה כיצד תאי לב של תאים שונים מוגדרים במהלך התפתחות הלב. התחילו בגידול תאי גזע עובריים מהודרים ב-0.1% צלוחיות T25 מצופות ג'לטין במדיום 2i.

כאשר התאים מגיעים 70 עד 80%confluence, לשטוף את התרבויות עם PBS ולהוסיף מיליליטר אחד של טריפסין לכל בקבוק כדי לנתק את התרבות לתאים בודדים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. כאשר התאים התנתקו, לנטרל את התגובה עם ארבעה מיליליטר 10 FBS ב DMEM ולספירת התאים בשיטה מתאימה. מדללים את התאים לפי שלושה בערך עד חמשת התאים לריכוז בינוני טרי, ואוסף את התאים באמצעות צנטריפוגה.

לאחר מכן תוכלו למחזר את גלולת הכדור בחמישה מיליליטר של מדיום 2i טרי לחזרה על בקבוקונים חדשים מצופים 0.1% ג'לטין T25. עבור דור CPC מ spheroids לב, לאסוף 2.5 פעמים 10 לשישה של עכבר מנותק מדגם תא גזע עוברי על ידי צנטריפוגה, ו resuspend התאים ב 25 מיליליטר של מדיום SFD. צלחת ההשעיה התא לתוך אחד 150 על ידי 25 מילימטר צלחת סטרילית עבור דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 48 שעות.

בסוף הדגירה, לאסוף את כדורי הלב לתוך צינור חרוט. מעים את הכדורים על ידי צנטריפוגה כדי להקל על בידוד סלקטיבי של כדוריות כדי למנוע תאים בודדים. תן את הכדורידים ב 25 מיליליטר של בינוני SFD טרי בתוספת ננוגרם אחד למיליליטר של activin A ו 1.5 ננוגרם למיליליטר של חלבון מורפוגנטי עצם ארבע.

להחזיר את הכדורידים בחזרה לאותה צלחת תרבות עבור דגירה 24 שעות ביממה באינקובטור תרבות התא. למחרת, זכרו את כל כדורי הלב על ידי צנטריפוגה. תן מחדש את הגופים העובריים המובחנים ב-25 מיליליטר של מדיום SFD טרי עבור ציפוי בבקבוקון בריבוע באורך 75 ס"מ באינקובטור של תרבות התאים למשך 48 שעות.

לבידוד של CPC ספציפי לשדה הלב באמצעות כתבים פלואורסצנטיים, לאסוף את הגופות העובריות על ידי צנטריפוגה לנתק את תרבויות 3D עם מיליליטר אחד של טריפסין ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. בסוף הדגירה, מערבבים היטב על ידי צינור כדי לנטרל את התאים ולנטרל את התגובה עם ארבעה מיליליטר של 10%FBS ב DMEM. מעבירים את התערובת מעל מסננת של 70 מיקרומטר כדי להסיר גופים עובריים שאינם ניתוקים, ומנחים את התאים המסוננים על ידי צנטריפוגה.

כדי למיין את ה- CPCs לפי ביטוי הכתב הפלואורסצנטי שלהם, השתמש מחדש את גלולה ב 500 מיקרוליטרים FACS פתרון ולסנן את התאים דרך מסננת תא 40 מיקרומטר לתוך צינור פוליסטירן 5 מיליליטר עגול התחתון על קרח. לאחר מכן מיין את התאים כדי לבודד את התאים המבטאים את RFP ו- GFP לפי FACS, ואוסף את התאים במיליליטר אחד של FBS. כדי לבודד CPCs שדה הלב הראשון לעומת השני מבוסס על ביטוי Cxcr4 חלבון פני השטח שלהם, resuspend תא גזע עוברי עכבר יחיד RFP ביטוי תאי אב לב ב 300 microliters של 10%FBS ב PBS בתוספת נוגדן אנטי Cxcr4 מצומד פלואורסצנטי.

לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף את התאים שלוש פעמים אחד עד שני מיליליטר של PBS טרי, קר לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, תן שימוש חוזר בתאים ב-500 מיקרוליטרים של פתרון FACS וסנן את התאים דרך מסננת של 40 מיקרומטר לצינור של חמישה מיליליטר ועגול. לאחר מכן מיין את התאים לפי ביטוי Cxcr4 שלהם, איסוף הן Cxcr4 חיובי ואוכלוסיות שליליות לתוך צינורות בודדים המכילים מיליליטר אחד של FPS לכל צינור על קרח.

כדי לתרבת מחדש את תאי הלב המבודדים, הספציפיים לשדה הלב, לאסוף את התאים ממוינים לפי צנטריפוגה ולתלות מחדש את כדורי במדיום SFD. לאחר מכן זרע כשלוש פעמים 10 לארבעת התאים ל באר בצלחת מצופה 0.1% ג'לטין, 384 היטב. אם מוות מוגבר של תאים מצוין לאחר המיון, הוסף מעכב רוק 10 מיקרומולרי לכל באר.

לאחר יומיים של תרבות, יש לצפות במכות ספונטניות. כדי לנתח את היכולת של CPCs מצופים להבדיל קרדיומיוציטים, לאסוף את התאים ביום 12 של הבחנה עם טריפסין, כפי שהוכח, כדי לבודד את cardiomyocytes יחיד ו resuspend התאים ב 4% paraformaldehyde. לאחר 30 דקות בטמפרטורת החדר, לאסוף את התאים הקבועים על ידי צנטריפוגה ולשטוף את גלולה PBS כדי להסיר את התיקון עודף.

לאחר מכן, השתמשו מחדש בתאים ב-10%FBS ב-PBS, והדגירה חצי מדגם התא עם נוגדן T נגד טרופונין עכבר ולהשתמש בחצי השני של המדגם כפקד שלילי. לאחר 30 דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף את התאים פעמיים PBS טרי resuspend את הדגימות ב 10%FBS בתוספת PBS בתוספת נוגדן משני מתאים. לאחר דגירה נוספת של 30 דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף את התאים פעמיים PBS טרי לכל לשטוף מחדש את התאים ב 200 microliters של PBS לצינור לניתוח על ציטומטר זרימה.

לאחר כ 132 שעות של בידול, Tbx1-RFP ו Hcn4-GFP תאי אב לב ניתן לזהות על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטי. בדרך כלל, הן תאי GFP והן תאי RFP מופיעים בערך באותו הזמן, ושתי האוכלוסיות של תאי האדון ממשיכות להתרחב בסמיכות ובדרך כלל בתבנית משלימה. התאמת הריכוזים של activin A וחלבון מורפגנטי עצם ארבע ישנה את האחוזים של תאים ראשונים לעומת שדה לב שני אבי הלב.

באופן דומה, באמצעות RFP כתב עכבר קו תאי גזע עובריים, לאחר 132 שעות של בידול, RFP חיובי תאי לב. לאחר כשל חיסוני עבור Cxcr4, תאים חיוביים ל- RFP, Cxcr4 חיוביים וחיוביים ל- RFP, ניתן לבודד תאים שליליים Cxcr4. Immunostaining עבור טרופונין לב T ביום 12 של הבחנה מאשר כי תאי שדה הלב הראשון להבדיל בעיקר לתוך מיוציטים.

באופן דומה, תאים הנגזרים RFP חיובי, Cxcr4 שלילי תאי הצאצא הלב ללדת cardiomyocytes באחוזים גבוהים בהרבה בהשוואה לתאי Cxcr4 אחד חיובי לב. מדי פעם, תאי גזע עובריים של העכבר אינם מצליחים להבדיל ביעילות ויוצרים מספרים נמוכים מאוד של תאי לב ספציפיים ללב. התזמון, הריכוז והעקביות של תוספת הציטוקיני ומספר התאים הם קריטיים עבור דור מוצלח של תאי לב ספציפיים לתאים.

בעקבות הליך זה, החוקרים יכולים לנתח את המאפיינים הפיזיולוגיים של האוכלוסיות השונות של תאי אביה לב כדי לקבל תובנה נוספת על המפרט והתפקוד שלהם.