עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מהמערב התיכונה אוניברסיטת קולג &#39;למדעי בריאות מחקר הנחיית גרנט זכה לEEH ומשרד אוניברסיטת המערב התיכון של מחקר ותוכניות ממומנים ביצוע העצמי גרנט זכה לKJL.

פרוטוקול זה תואם את עקרונות הרווחה AVMA בעלי החיים לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה ואושר על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) באוניברסיטה במערב התיכון. 1. הכנת ההרדמה, הציוד, ומדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dechlorinate כ -1.5 ליטר של מים ברז או באמצעות סוכן מסחרי dechlorinating (זמין בחנויות לחיות מחמד) או על ידי ומאפשר עמדת מים למשך 24 שעות. להשיג שלוש 1 כוסות L ולמלא כל אחד עם 500 מיליליטר מים dechlorinated. תווית אחת להחזקת דגים לפני כל הליך ואחד להתאוששות. לכוס השלישית, להוסיף 100 מיקרוגרם / מיליליטר של methanesulfonate tricaine; זה הופך את הכוס שבדגים יהיו בהרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מגש רדוד עם קרח, לחמם את מדיום התרבות (1640 RPMI, 10% FBS (בסרום שור עוברי), 50 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin, 100 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin, 25 מ&quot;מ HEPES) לRT, ולאסוף פינצטה של ​​צורף נקי. פינצטה נקייה על ידי immerלשיר הטיפים באתנול 70% ועוברים דרך מבער בונזן, המאפשר אתנול לשרוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליט אם ההליך יבוצע ללא הגדלה, עם זכוכית מגדלת מסחרית, טבלה עליונה מואר עם 2 - 10X הגדלה, או לנתח מיקרוסקופ (תלוי לחלוטין בהעדפה אישית). </li></ol> 2. הקמת תרבויות explant <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפוס את המספר הרצוי של דגים ומקום בכוס אחזקה. העבר את דג בודד לכוס ההרדמה; עדיף להרדים דגים בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקוב אחר ההשפעות של הרדמה על ידי התבוננות תנועת שחייה וזימים של הדג. כהרדמה מתקדמת, תנועת זימים מאטה והדגים ישחו בצורה לא יציב ולעתים קרובות במהופך; לשקול דגים הרדימו בהקדם תנועת זימים מפסיקה. אל תשאירו את הדגים לתקופות ארוכות יותר באמבטיה ההרדמה כמו זה עלול לגרום למותם של הדגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר דגים מכוס ההרדמה וההעברהלקרח, הצבת הדגים אופקי עם הזנב מול מחזיקה פינצטה ביד. אם חווה עם הטכניקה ואם דגים מרובים לשמש כדי להפוך את explants, לשקול הצבת הדגים הבאים בכוס ההרדמה בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר קשקשים, פינצטה עמדה במקביל לדג עם קצה בקצה קנה המידה. לדכא צד שטוח של פינצטה מעט לצדו של הדג כדי לגרום לקנה המידה לרומם מהגוף של הדג. אחוז בקנה מידה עם פינצטה, למרוט, ומקום (ללא היפוך) בצלחת תרבית רקמה. חזור על התהליך, הסרת מקסימום של 12 קשקשים ממבוגרים גדולים (6 מכל צד), הימנעות אזור הזימים, קו הרוחב, וסנפירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הדגים לתוך כוס ההתאוששות ולפקח כדי להבטיח שהיא מתאוששת מההשפעות של הרדמה. בשלב זה, ניתן להעביר בחזרה לדגי טנק בודד. לאפשר לדגים להתאושש במשך לפחות 21 ימים כדי לאפשר להתחדשות בקנה מידה מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לעיצוב ניסיוני, למקם עד 20 סולמות לכל צלחת שטופלה תרבות פלסטיק 35 מ&quot;מ רקמה או 4-6 קשקשים לכל צלחת זכוכית תחתונה. לאפשר קשקשים לדבוק בצלחת לפני הוספה בעדינות תקשורת כדי לא לנתק את הקשקשים מהצלחת. הערה: עם ניסיון, יכולים להיות מעובד דגים מרובים לפני התקשורת מתווספת למנה הראשונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1.2 מיליליטר של מדיה מלאה (ראה 1.2 לעיל) לכל מנה 35 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצוי דגירה תרבויות explant על ​​28 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 לתקופה הרצויה של זמן, עם או בלי טיפול נוסף. לחלופין, דגירה תרבויות על במה מיקרוסקופ מחוממת או בתוך חדר תרבות תא חי למיקרוסקופיה וידאו. </li></ol> 3. Brightfield ומיקרוסקופי וידאו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנות עמדה המכילות גיליונות תא לבמה מיקרוסקופ ותחילה להתמקד באמצעות העדשה האובייקטיבית 4X. ניתן להשתמש בהגדלות גדולות יותר, תלוי בניסוי: הערה. סימון המיקום שלכל גיליון תא ו / או נטייה של המנה על הבמה יקל לקחת תמונות לאורך זמן עם הגיליונות בערך באותו הכיוון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מנות מהחממה ולצלם בנקודות זמן שונות, על פי כל פרוטוקול ניסוי ואת המקום בחזרה לתוך החממה ולו רק תמונות סטילס נדרשות על מסגרת זמן הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת ביצוע מיקרוסקופיה וידאו, לשים לב לדברים הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את קנה המידה / גיליון התא מתפתח בתוך שדה הראייה כך שגיליון התא הנודד נשאר בשדה הראייה למשך הווידאו. הערה: זה עשוי לקחת קצת ניסיון בהתבוננות כיצד תאים להעביר מתחת לקנה המידה. לקטעי וידאו קצרים, זה פחות דאגה מאשר לקטעי וידאו ארוכים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למסגרות זמן קצרות יותר, דגירה על RT. למסגרות זמן ארוכות יותר (18 + שעות), להשתמש בבמה מחוממת או תא דגירה כדי לשמור על טמפרטורה, איזון pH, וכדי למזער את האידוי של התרבות מ &#39;edium. </li></ol></li></ol> 4. קיבוע לImmunofluorescence מיקרוסקופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מראש חמים כל הפתרונות לC ° 28. על מנת לצפות בkeratocytes תחת הקרינה, לגדול תרבויות explant כפי שתואר לעיל באמצעות כלים תרבית רקמת 35 מ&quot;מ זכוכית תחתונה. לחלופין, להשתמש בשקופיות קאמריות זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.8 מיליליטר של paraformaldehyde 4% ב1.1x PBS לכל מנה. אל תסיר את התקשורת והתרבות ראשונה. לדגור על RT במשך 5 דקות לאחר מכן לשאוב כדי להסיר את הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.8 מיליליטר של paraformaldehyde 4% ב1.1x PBS לכל מנה. לדגור על RT במשך 5 דקות לאחר מכן לשאוב כדי להסיר את הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלא אם כן משתמש בligands החיצוני או epitopes החיצונית, תאי Permeabilize על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של 0.2% Triton X-100 ב 1X PBS. לדגור על RT במשך 5 דקות לאחר מכן לשאוב כדי להסיר את הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מיליליטר BSA של 1% ב1x PBS ו דגירה עבור שעה 1 (ב RT) או O / N (4 ° C). הערה: בהתאם לתנאי ניסוי, PHAlloidin ניתן להוסיף בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לשאוב כדי להסיר את הפתרון ולהמשיך במכתים נוגדן. לחלופין, לאחסן את הכלים התרבות על ידי הוספה לפחות 1-2 מיליליטר של BSA 1% ב1x PBS ל3-4 שבועות ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> פרוטוקול 5. Immunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרונות נוגדן ראשוניים ומשניים לפי המלצות היצרן. הערה: אם המלצות יצרן אינן זמינות, דילול טוב התחלה של נוגדנים ראשוניים (בBSA 1% ב 1x PBS) היא 1: 500 לpolyclonal ו1: 1,000 לנוגדנים חד-שבטיים; דילול התחלה טוב לנוגדנים משני הוא 1: 1,000. התאם דילולים של המניה המקורית שהתקבלה מהיצרן גבוה יותר אלה אם האות חלש, נמוך יותר אם האות חזק ורקע הוא בעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב BSA 1% בפתרון 1x PBS. הוסף 0.5 מיליליטר של תמיסת נוגדן ראשונית דגירה עבור שעה 1 (ב RT) או O / N (4 ° C). </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון הנוגדן הראשוני, מקום לתוך נקי ושכותרתו 1.5 מיליליטר צינור microcentrifuge, ולהקפיא ב -20 ° C. הערה: זה מאפשר לשימוש החוזר של הנוגדן הראשוני, במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצלחת 3 - 5 פעמים עם PBS 1x, הסרת ושלכת PBS לאחר כל שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מיליליטר של פתרון נוגדנים משני. אם תרצה, להוסיף phalloidin fluorescently שכותרת (להלן הריכוז המומלץ של כל יצרן) בשלב זה. דגירה עבור שעה 1 (ב RT) או O / N (4 ° C). הערה: שימוש בfluorescently שכותרתו phalloidin מאפשרת הדמיה של סיביים אקטין; מצאנו כי phalloidin 488 שכותרתו עובד הכי טוב בkeratocytes דג הזברה שלנו, אבל יכולה לשמש fluorophores אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר וזורקים את פתרון נוגדנים משני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצלחת 3 - 5 פעמים עם PBS 1x, הסרת ושלכת PBS לאחר כל שטיפה. הערה: המנה יכולה להיות מאוחסנת, מכוסה מהאור, ב 4 ° C אם אין אפשרות להתחרותw באופן מיידי; ודא 1x PBS מתווסף לתוך הצלחת לפני האחסון על מנת להבטיח את התאים לא יתייבשו אבל חם לRT (20 - 30 דקות), ולאחר מכן להסיר PBS רק לפני שתמשיך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מוכן להתבונן, להוסיף 2-3 טיפות של הרכבה בינונית, עם או בלי DAPI, בהתאם לצרכים הניסיוניים, לתוך הצלחת ולתת לשבת במשך 10 דקות ב RT. הערה: אנו משתמשים במדיום זמין מסחרי, המבוסס על גליצרול הרכבה עם DAPI, אך ניתן להשתמש בי תקשורת הרכבה אחרת. המאפשר 10 דקות להרכבה בינונית לשבת בצלחת מאפשר הסרה קלה של coverslip הזכוכית מתחתית הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, ללחוץ בעדינות על צידי הצלחת כדי לשחרר ולהסיר את coverslip. להוסיף טיפה נוספת של תקשורת הרכבה על גבי זכוכית ולמקם את coverslip, תאים למטה, לשקופית. הערה: שקול איטום coverslip לשקופית באמצעות ציפורניים ברורות אם השקופית צריכה להיות כל הזמן ליותר מ1-2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לשקופית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הערה: רוב התמונות שלנו נלקחו באמצעות עדשה אובייקטיבית 40X או 63X תחת טבילת שמן, אבל העדשה האובייקטיבית הספציפית המשמשת יהיו תלויה בפרוטוקול הניסוי. </li></ol>

<ol>
	<li>Burton, K., Park, J. H., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratocytes+generate+traction+forces+in+two+phases.">Keratocytes generate traction forces in two phases.</a> Molecular Biology of the Cell. 10, 3745-3769 (1999).</li><li>Keren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+shape+determination+in+motile+cells.">Mechanism of shape determination in motile cells.</a> Nature. 453, 475-480 (2008).</li><li>Lacayo, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+large-scale+cell+morphology+and+movement+from+local+actin+filament+growth+dynamics.">Emergence of large-scale cell morphology and movement from local actin filament growth dynamics.</a> PLOS Biology. 5, 233 (2007).</li><li>Lee, J., Ishihara, A., Theriot, J. A., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+locomotion+for+simple-shaped+cells.">Principles of locomotion for simple-shaped cells.</a> Nature. 362, 167-171 (1993).</li><li>Kolega, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Movement+of+Cell+Clusters.">The Movement of Cell Clusters.</a> J. Cell Sci. 49, 15-32 (1981).</li><li>Kolega, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mechanical+tension+on+protrusive+activity+and+microfilament+and+intermediate+filament+organization+in+an+epidermal+epithelium+moving+in+culture.">Effects of mechanical tension on protrusive activity and microfilament and intermediate filament organization in an epidermal epithelium moving in culture.</a> The Journal of Cell Biology. 102, 1400-1411 (1986).</li><li>Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+of+primary+zebrafish+keratocytes.">Collective cell migration of primary zebrafish keratocytes.</a> Experimental Cell Research. 326, 155-165 (2014).</li><li>Richardson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Zebrafish+as+a+Model+System+for+Cutaneous+Wound-Healing+Research.">Adult Zebrafish as a Model System for Cutaneous Wound-Healing Research.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133, 1655-1665 (2013).</li><li>Cheon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+pro-inflammatory+cytokines+and+metalloproteinase-1+by+TGF-b1+in+synovial+fibroblasts+from+rheumatoid+arthritis+and+normal+individuals.">Increased expression of pro-inflammatory cytokines and metalloproteinase-1 by TGF-b1 in synovial fibroblasts from rheumatoid arthritis and normal individuals.</a> Clinica., &amp; Experimental Immunology. 127, 547-552 (2002).</li><li>Sandeman, S. R., Faragher, R. G. A., Allen, M. C. A., Liu, C., Lloyd, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+MMP-2+expression+and+secretion+change+with+increasing+serial+passage+of+keratocytes+in+culture.">Does MMP-2 expression and secretion change with increasing serial passage of keratocytes in culture.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 122, 157-167 (2001).</li><li>Schnaper, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+extracellular+matrix+proteins+and+decreased+expression+of+matrix+proteases+after+serial+passage+of+glomerular+mesangial+cells.">Increased expression of extracellular matrix proteins and decreased expression of matrix proteases after serial passage of glomerular mesangial cells.</a> Journal of Cell Science. 109, 2521-2528 (1996).</li><li>Tondreau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+study+of+matrix+metalloproteinase/tissue+inhibitor+of+metalloproteinase+production+by+mesenchymal+stromal+cells+in+response+to+inflammatory+cytokines:+the+role+of+their+migration+in+injured+tissues.">In vitro study of matrix metalloproteinase/tissue inhibitor of metalloproteinase production by mesenchymal stromal cells in response to inflammatory cytokines: the role of their migration in injured tissues.</a> Cytotherapy. 11, 559-569 (2009).</li><li>Zimmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+rheumatoid+arthritis+synovial+fibroblasts+from+primary+culture+-+primary+culture+cells+markedly+differ+from+fourth-passage+cells.">Isolation and characterization of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts from primary culture - primary culture cells markedly differ from fourth-passage cells.</a> Arthritis Research. 3, 72-76 (2001).</li><li>McDonald, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+keratocyte+explant+cultures+as+a+wound+healing+model+system:+differential+gene+expressio.,+&amp;+morphological+changes+support+epithelial&#8211;mesenchymal+transition.">Zebrafish keratocyte explant cultures as a wound healing model system: differential gene expressio., &amp; morphological changes support epithelial&#8211;mesenchymal transition.</a> Experimental Cell Research. 319, 1815-1827 (2013).</li><li>Tan, B., Pascual, A., de Beus, A., Cooper, K., Hull, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFb+(transforming+growth+factor+b)+and+keratocyte+motility+in+24-hour+zebrafish+explant+cultures.">TGFb (transforming growth factor b) and keratocyte motility in 24-hour zebrafish explant cultures.</a> Cell Biology International. 35, 1131-1139 (2011).</li><li>Barut, B. A., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Realizing+the+potential+of+zebrafish+as+a+model+for+human+disease.">Realizing the potential of zebrafish as a model for human disease.</a> Physiological Genomics. 2, 49-51 (2000).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews Genetics. 8, 353-367 (2007).</li><li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooked!+Modeling+human+disease+in+zebrafish.">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).</li><li>Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T., Westerfield, M., Detric, H. W., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2011).</li><li>Li, P., White, R. M., Zon, L. I., Westerfield, M., White, H. W., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. 105, 403-417 (2011).</li><li>Yen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+heterogeneity+and+mutational+burden+of+engineered+melanomas+in+zebrafish+models.">The genetic heterogeneity and mutational burden of engineered melanomas in zebrafish models.</a> Genome Biology. 14, R113 (2013).</li><li>Bouzaffour, M., Dufourcq, P., Lecaudey, V., Haas, P., Vriz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+and+Sdf-1+Pathways+Interact+during+Zebrafish+Fin+Regeneration.">Fgf and Sdf-1 Pathways Interact during Zebrafish Fin Regeneration.</a> PLoS One. 4, e5824 (2009).</li><li>Dufourcq, P., Vriz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+SDF-1+regulates+blastema+formation+during+zebrafish+fin+regeneration.">The chemokine SDF-1 regulates blastema formation during zebrafish fin regeneration.</a> Development Genes and Evolution. 216, 635-639 (2006).</li><li>Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+signaling+instructs+position-dependent+growth+rate+during+zebrafish+fin+regeneration.">Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.</a> Development. 132, 5173-5183 (2005).</li><li>Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Electroporation+of+Morpholinos+into+the+Regenerating+Adult+Zebrafish+Tail+Fin.">In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin.</a> Journal of Visualized Experiments. 61, e3632 (2012).</li><li>Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+of+Gene+Expression+in+the+Adult+Zebrafish+Brain+Using+Cerebroventricular+Microinjection+of+Morpholino+Oligonucleotides.">Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides.</a> Journal of Visualized Experiments. 75, e50415 (2013).</li><li>Konantz, J., Antos, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetic+Morpholino+Approach+Using+Cardiac+Ventricular+Injection+to+Transfect+Multiple+Difficult-to-target+Tissues+in+the+Zebrafish+Larva.">Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva.</a> Journal of Visualized Experiments. 88, e51595 (2014).</li><li>Rambabu, K. M., Rao, S. H., Rao, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+expression+of+transgenes+in+adult+zebrafish+by+electroporation.">Efficient expression of transgenes in adult zebrafish by electroporation.</a> BMC Biotechnology. 5, 29 (2005).</li><li>Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=During+collective+migration,+leader+keratocytes+generate+tension+in+sheet+and+may+become+follower+or+individually+migrating+cells.">During collective migration, leader keratocytes generate tension in sheet and may become follower or individually migrating cells.</a> Experimental Cell Research. In press, (2014).</li><li>Safferling, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+revised:+A+novel+reepithelialization+mechanism+revealed+by+in+vitro+and+in+silico+models).">Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models).</a> The Journal of Cell Biology. 203, 691-709 (2013).</li><li>McDonald, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+and+collective+cell+migration+in+24+primary+zebrafish+explant+cultures:+MMP13+plays+an+inhibitory+role+and+MMP14+may+respond+to+stretch+during+reepithelialisation.">Matrix metalloproteinases and collective cell migration in 24 primary zebrafish explant cultures: MMP13 plays an inhibitory role and MMP14 may respond to stretch during reepithelialisation.</a> Cell Biology International Reports. 20, 24-36 (2013).</li><li>Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase-14+is+a+mechanically+regulated+activator+of+secreted+MMPs+and+invasion.">Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2014).</li><li>Sire, J. -. Y., Girondot, M., Babiar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marking+zebrafish,+Danio+rerio+(cyprinidae),+using+scale+regeneration.">Marking zebrafish, Danio rerio (cyprinidae), using scale regeneration.</a> The Journal of Experimental Zoology. 286, 297-304 (2000).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teleost+skin,+an+ancient+mucosal+surface+that+elicits+gut-like+immune+responses.">Teleost skin, an ancient mucosal surface that elicits gut-like immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 13097-13102 (2013).</li><li>Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+flow+in+rapidly+moving+cells.">Intracellular fluid flow in rapidly moving cells.</a> Nature Cell Biology. 11, 1219-1224 (2009).</li><li>Bereiter-Hahn, J., Strohmeier, R., Kunzenbacher, I., Beck, K., Voth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotion+of+Xenopus+epidermis+cells+in+primary+culture.">Locomotion of Xenopus epidermis cells in primary culture.</a> Journal of Cell Science. 52, 289-311 (1981).</li><li>Nishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization,+and+in+vitro+culture+of+larval+and+adult+epidermal+cells+of+the+frog+Xenopus+laevis.">Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis.</a> In Vitro Cellula., &amp; Developmental Biology. 26, 1128-1134 (1990).</li><li>Schober, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+kinase+modulates+tension+signaling+to+control+actin+and+focal+adhesion+dynamics.">Focal adhesion kinase modulates tension signaling to control actin and focal adhesion dynamics.</a> The Journal of Cell Biology. 176, 667-680 (2007).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

השלב הקריטי ביותר להצלחה של תרבות explant keratocyte מאפשר קנה המידה לדבוק בתרבות הצלחת כ 2-3 דקות לפני תוספת של מדיום התרבות. כ -75% מקשקשים ידבק ולגדול גיליונות (מספר התרבויות שנקבעו לגבי כל ניסוי צריך להיות מותאם בהתאם). גיליונות Keratocyte לא יוצרים סביב כל קנה מידה הוסרה מהדגים ו?...

<html> מחקרים של תנועתיות תא התמקדו בעיקר בתאים בנפרד נודדים. Keratocytes תרבית מדגים ודו-חי explants הוכיח להיות מערכת מודל רבת עוצמה כדי לחקור את המנגנונים של תנועתיות תא באמצעות מודלים מתמטיים והן ניסיוניים גישות 1-6. עבודה ניסויית בתאים בנפרד נודדים נעזר בתנועה המהירה, חלקת הגלישה של התאים, תוך שמירה על צורה, מהירות, וכיוון אחיד. עם זאת, in vivo, תאים לעתים קרובות לעבור באופן קולקטיבי, תוך שמירה על צמתים תא-תא, במיוחד בעובר, ריפוי פצעים, וגרורות. לפיכך, נדידת תאים קולקטיבית הוא אזור גידול והבולט יותר ויותר של מחקר בתחום של נדידת תאים. לאחרונה ההגירה הקולקטיבית של תאים אלה תוארה 7 ויש לו תכונות ייחודיות רבות ההופכות אותו למערכת רבת עוצמה כדי לחקור נדידת תאים קולקטיבית במודל ריפוי פצע. &quot;&gt; כאשר מאזניים קטפו מדג זברה מבוגרת בהרדמה, כמה רקמות אפיתל נשארה מחוברת לחלק התחתון של הסולם. כאשר מדיום תרבית תאים הוא הוסיף, תאי האפיתל אלה, או keratocytes ove_content, להעביר במהירות כיחידה קולקטיבית מהסולם. ניתן לצפות בתרבות explant כמודל ריפוי פצע אפיתל, שבו התאים לנדוד הרחק מexplant כפי שהם היו על פני המטריצה ​​הזמנית של פצע המיטה כדי לבסס מחדש את האפיתל ללא פגע. נתונים אחרונים מצביעים על כך שvivo לשעבר זה מחקה תרבות תכונות רבות של in vivo ריפוי הפצע בדג זברה מבוגרת. שיעורי סגירת פצעים 8 לתרגם למהירות הגירה דומה לזה שנצפה במערכת vivo לשעבר 7. בנוסף, בפצע in vivo ריפוי מודל, הטיפול בקומדין מצביע על כך שיש עצירה דימום אין כל השפעה על שיעור של ריפוי, בעוד שהטיפול בהידרוקורטיזון כדי להקטין את התגובה חיסונית לא לעכב reepithelialization 8 </sup&gt;. כדג הזברה אינה לדמם כאשר קנה המידה היא להסיר את בעלי החיים, עצירת דימום הוא לא שחקן מרכזי. למרות שמצאנו תאים חיסוניים בexplants, יש לנו לא בחנו את ההשפעות שאולי יש להם בנדידת תאים קולקטיבית. הפרוטוקול המובא כאן מתאר כיצד להקים תרבויות explant keratocyte דג הזברה שלהבטיח עקביות ושחזור לשימוש במבחנים רבים ביולוגיים. תרבויות explant אלה הן משכנעים במיוחד במודל חוץ גופית לנדידת תאים קולקטיבית מכמה סיבות. ראשית, keratocytes דג הזברה הם תאים ראשוניים בשימוש בתוך שעות של הקמת תרבויות explant. לכן, תאים אלה לא עברו שינויים מורפולוגיים וביטוי גנים הקשורים למעבר של תאים ראשוניים 9-13. שנית, מערכת זו מהווה מודל לחקר reepithelialization בתגובה לפציעתם 14 ו, כחלק מהתגובה לפציעה, אפיתל לtr mesenchymalansition תהליך (EMT) הוא יזם כפי שמעיד שינויים בביטוי הגנים וארגון מחדש cytoskeletal 14,15. לפיכך, השינויים בביטוי הגנים הרקע ותנועתיות המתרחשים בתאים שלא טופלו כבר מאופיינים ולספק הקשר לפרש שינויים בטיפול. יתר על כן, keratocyte הדגים וkeratinocyte האנושית הן תפקודיות שווי ערך; שניהם תאי האפיתל העיקריים של מיניהם ולשחק תפקיד מפתח בריפוי פצע אפיתל. דג הזברה שלישית, מבוגר זוכה להכרה כמערכת מודל עבור מגוון רחב של מחלות בבני אדם 16-18 כוללים מלנומה וסוגי סרטן אחרים 19-21, פצע cutaneous ריפוי 8,14 ורקמות התחדשות 22-24. יתרונות טכניים של מערכת מודל זה הם פחות משכנעים. מספר הולך וגדל של קווים מוטנטים ומהונדסים זמינים ללא כוונת רווח, מתקנים מרכזיים. באופן ספציפי, דג הזברה מוטצית הפרויקט (ZMP) בWellcome Trust סנגר המכון שואף ליצור אלל נוקאאוט בכל חלבון קידוד גנטי בגנום דג הזברה. נכון לעכשיו, יש להם מוטציה 11,892 גנים, כ -45% מהגנום, עם 24088 אללים מאופיינים. בנוסף, ZMP מקבל הצעות ויפיק לדפוק outs ללא תשלום. השיטות האחרונות במציאת גן בדג זברה זחל והמבוגר 25-28 לספק גמישות ללמוד את הפונקציה של גנים חשובים מבחינה התפתחותית שלגישות מהונדסים הן בעייתיות או לא מעשיות. בשלהם שיעורים מאוד מהירים של תנועתיות ~ 145 מיקרומטר / hr זמן קצר לאחר הקמתה של תרבויות 29, ניתן להשלים במהירות מבחני (בדרך כלל 24 שעות באו פחות). כפי שניתן הושלמו ניסויים במהירות ובתרבויות לגדול גם ב RT, כמה מהמכשולים הטכניים הקשורים למבחני נדידת תאי יונקים מעורבים מיקרוסקופיה וידאו נמנעים. בנוסף, בגיל של הידוק תקציבי מחקר, zebrafish נשמרים בקלות ובזול. המבנה וההתנהגות של explant הוא מורכב. כדגים לא לדמם כאשר קנה המידה מוסר, אין זה סביר כי הרבה יותר משכבות אפידרמיס השטחיות יוסרו עם הסולם. Keratocytes נראה סוג התא הדומיננטי בexplant כאשר קשקשים לראשונה הוסרו מהדגים כמו הרוב המכריע של תאים מופיעים להכתים עם נוגדן אנטי E-cadherin 14. יתר על כן, אין ראיות של fibroblasts בתרבות הראשונית כמו להישפט על ידי העדר כתמי vimentin על ידי immunofluorescence 14. עם זאת, עם הסרת קנה מידה חוזרת ונשנית, נראה שיש מספר רב של נויטרופילים בexplant (ראה וידאו 1). אנו זיהינו תאים אלה כנויטרופילים המבוססים על תצפיות מורפולוגיים לגודל שלהם, במהירות תנועתיות, והגירתם אל מחוץ לגיליון התא בעת החשיפה לLPS (מידע לא מוצג). בנוסף, תאים אלה כתם בהיר שנינותh נוגדנים לגורם cytosolic נויטרופילים, כמו גם עם מגוון רחב של נוגדני IgG משניים, אשר מציין כי יש להם בשפע FcRs על פני השטח שלהם (מידע לא מוצגים). שכבות תאים מרובות נמצאות בתוך explant. מיקרוסקופיה Confocal חושפת את הנוכחות של שכבה אחת ליד הקצה המוביל ליותר משתי שכבות של keratocytes ליד קנה המידה עם נויטרופילים נראים מעל, מתחת, ובין סדיני keratocyte התא. בנקודות זמן מוקדמות, תאים בקצה לקטב explant הרב שכבתי, ייזום הגירה קולקטיבית של keratocytes מexplant בשיעורים ראשוניים של ~ 145 מיקרומטר / hr. האזור המכוסה על ידי explant מגדיל במהירות, מה שמוביל לתא התפשטות, מתח בתוך גיליון, ושיעור ירידה במראש של הקצה קדמי. interconversions המהיר בין תאי מנהיג וחסיד הם נצפו בקצה המוביל במהלך ההיווצרות וסגירת חורים שנוצרו באופן ספונטני בתוך גיליון 7. כתהליך EMT יזם עם explant ממשיך, הברים וכו &#39;וkeratocytes לאבד תנועתיות מיוחדת, המהירה. ביטוי גנים ושינויים מורפולוגיים בקנה אחד עם EMT, ריפוי פצעים, ותגובות דלקתיות להתרחש תוך 7 ימים של תרבות עם explants נשקלים קיימא עבור כ 10 ימים 14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="777">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:320px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P35GC-1.5-14-C</td>
			<td style="width:320px;">1.5 mm&#160; thickness is best for coverslip removal.&#160; 14 mm diameter provides more culture area.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21909-460</td>
			<td style="width:320px;">We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish keratocyte explants to study collective cell migration and reepithelialization in cutaneous wound healing

בשל המאפיינים הייחודיים שלהם ניע, keratocytes הדגים ניתק מתרבויות explant כבר מזמן משמשות כדי לחקור את המנגנונים של נדידת תאים בודדת. עם זאת, כאשר explants הוקם, תאים אלה גם לנוע באופן קולקטיבי, שמירה רב של התכונות ההופכות את פרט keratocytes מודל אטרקטיבי ללמוד הגירה: שיעורים מהירים של תנועתיות, lamellae אקטין עשיר נרחב עם כבל אקטין בניצב, ומהירות קבועה יחסית ו כיוון ההגירה. בexplants המוקדם, הדדי המהירה של תאים נודדים באופן אישי עם אלה נודדים באופן קולקטיבי מאפשר הלימוד של התפקיד של הידבקויות תאי תאים בקביעת המצב של הגירה, ומדגיש את הקישורים המולקולריים בין שני המצבים של הגירה. תאים בexplants מאוחר יותר לאבד את היכולת שלהם לנוע במהירות ובאופן קולקטיבי כאפיתל מעבר mesenchymal מתרחש וגנים הקשורים לריפוי פצעים ודלקת באים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי. לפיכך, explants keratocyte יכול לשמש כמודל במבחנה לreepithelialization המתרחש במהלך ריפוי פצע עורי ויכול לייצג את מערכת ייחודית ללמוד מנגנונים של נדידת תאים קולקטיבית בהקשר של תכנית מוגדרת של שינויי ביטוי גנים. מגוון רחב של קווי דג הזברה מוטציה ומהונדסים זמין, המאפשר explants שיוקם מדגים עם רקע גנטי שונה. זה מאפשר את התפקיד של חלבונים שונים בתוך תהליכים אלה יש לטפל באופן ייחודי. הפרוטוקולים המפורטים כאן מתארים שיטה קלה ויעילה להקמת תרבויות explant אלה לשימוש במגוון רחב של מבחני הקשורים לנדידת תאים קולקטיבית.

כפי שמודגם באיור 1, גיליונות של keratocytes ניתן לצפות נודדים החוצה מתחת לקנה המידה בתוך שעות של הקמת תרבות explant. מדי פעם, יכול להיות שנצפה keratocyte בנפרד נודדת שהתנתק מהגיליון הנודד באופן קולקטיבי. בנוסף, כexplant הוקם מדגים שנתלשו בעבר, יש בשפע נויטרופילים הנודדים דרך ג...

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing at JoVE.com

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

keratocytes דג הזברה להעביר בגיליונות תא מexplants ולספק מודל במבחנה לחקר המנגנונים של נדידת תאים קולקטיבית בהקשר של ריפוי פצע אפיתל. פרטים אלה פרוטוקולי דרך יעילה להקמת תרבויות explant עיקריות לשימוש במבחני נדידת תאים קולקטיביים.

Explants Keratocyte דג הזברה לחקר הגירה קולקטיבית סלולארי וReepithelialization בריפוי פצע עורית

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

zebrafish-keratocyte-explants-to-study-collective-cell-migration

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.9K Views.  Midwestern University.  keratocytes דג הזברה להעביר בגיליונות תא מexplants ולספק מודל במבחנה לחקר המנגנונים של נדידת תאים קולקטיבית בהקשר של ריפוי פצע אפיתל. פרטים אלה פרוטוקולי דרך יעילה להקמת תרבויות explant עיקריות לשימוש במבחני נדידת תאים קולקטיביים. 

Video: Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

אופטימיזציה של assay Scratch הפצע כדי לזהות שינויים בנדידת תאי Murine mesenchymal סטרומה לאחר נזק על ידי תמצית עשן סיגריות מסיס

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

כמו תא גזע<em&gt; Xenopus</em&gt; Explants העובריים לחקר תכונות המוקדמות עצבי התפתחותית<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

ניתוח<em&gt; In vivo</em&gt; נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

פיתוח מודל כבד אתנול-induced fibrotic דג הזברה ללמוד ובתאים בתיווך תא התחדשות Hepatocyte

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene therapy in organ-cultured corneas. The diabetic corneal disease is a complication of diabetes with frequent abnormalities of corneal nerves and epithelial wound healing. We have also documented significantly altered expression of several putative epithelial stem cell markers in human diabetic corneas. To alleviate these changes, adenoviral gene therapy was successfully implemented using the upregulation of c-met proto-oncogene expression and/or the downregulation of proteinases matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) and cathepsin F. This therapy accelerated wound healing in diabetic corneas even when only the limbal stem cell compartment was transduced. The best results were obtained with combined treatment. For possible patient transplantation of normalized stem cells, an example is also presented of the optimization of gene transduction in stem cell-enriched cultures using polycationic enhancers. This approach may be useful not only for the selected genes but also for the other mediators of corneal epithelial wound healing and stem cell function.

An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.

תרפיה adenoviral ג&#39;ין עבור סוכרתית keratopathy: השפעות על ריפוי פצע גזע ביטוי נייד מרקר ב קרניות אדם איברים בתרבית תאים לימבלית אפיתל

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

תרבות של מבוגר דג הזברה טראנסגנטי רשתית Explants עבור Live- תא הדמיה ידי multiphoton מיקרוסקופי

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

מכשיר לביצוע נדידת תאים / ריפוי פצעים צלחת 96-ובכן

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

הר שלם בתוך היברידיזציה ב-Zebrafish עוברים ושיטת היווצרות צינור ב-iPSC-ECs ללמוד את התפקיד של אנגלין בפיתוח כלי דם

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it contains more than the diploid copy of its chromosomes, which is a result of endoreplication or cell fusion. In tissue repair, wound-induced polyploidization (WIP) has been found to be a conserved healing strategy from fruit flies to vertebrates. WIP has several advantages over cell proliferation, including resistance to oncogenic growth and genotoxic stress. The challenge has been to identify why polyploid cells arise and how these unique cells function. Provided is a detailed protocol to study WIP in the adult fruit fly epithelium where polyploid cells are generated within 2 days after a puncture wound. Taking advantage of D. melanogaster&#39;s extensive genetic tool kit, the genes required to initiate and regulate WIP, including Myc, have begun to be identified. Continued studies using this method can reveal how other genetic and physiological variables including sex, diet, and age regulate and influence WIP&#39;s function.

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Wound-induced polyploidization is a conserved tissue repair strategy where cells grow in size instead of dividing to compensate for cell loss. Here is a detailed protocol on how to use the fruit fly as a model to measure ploidy and its genetic regulation in epithelial wound repair.

מודל Drosophila לחקר פוליפלואידים הנגרמים על ידי פצע

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it ...

Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis

The murine excisional wound model has been used extensively to study each of the sequentially overlapping phases of wound healing: inflammation, proliferation and remodeling. Murine wounds have a histologically well-defined and easily recognizable wound bed over which these different phases of the healing process are measurable. Within the field, it is common to use an arbitrarily defined &#8220;middle&#8221; of the wound for histological analyses. However, wounds are a three-dimensional entity and often not histologically symmetrical, supporting the need for a well-defined and robust method of quantification to detect morphometric defects with a small effect size. In this protocol, we describe the procedure for creating bilateral, full-thickness excisional wounds in mice as well as a detailed instruction on how to measure morphometric parameters using an image processing program on select serial sections. The two-dimension measurements of wound length, epidermal length, epidermal area, and wound area are used in combination with the known distance between sections to extrapolate the three-dimension epidermal area covering the wound, overall wound area, epidermal volume and wound volume. Although this detailed histological analysis is more time and resource consuming than conventional analyses, its rigor increases the likelihood of detecting novel phenotypes in an inherently complex wound healing process.

This protocol describes how to generate bilateral, full-thickness excisional wounds in mice and how to subsequently monitor, harvest, and prepare the wounds for morphometric analysis. Included is an in-depth description of how to use serial histological sections to define, precisely quantify and detect morphometric defects.