This research was supported by the NIH Common Fund and Intramural Research Program of the National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases.

1. הכנת ממברנה מטריקס מרתף וציפוי של Plasticware <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מניית מטריקס קרום במרתף הקפואה מ-20 ° C על קרח ולהפשיר לילה בשעה 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפשרה, aliquots פיפטה 2 מ&quot;ג של מטריצת קרום במרתף לתוך צינורות eppendorf טרום צוננים. אחסן אלה ב -20 ° C עד צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין צלחות מצופים מטריצת קרום במרתף, להפשיר aliquot אחד על קרח עד החתיכה האחרונה של קרח בנעלם צינור Eppendorf (בדרך כלל תוך ~ 2 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפשרה, להוסיף מטריצת קרום במרתף 12 מיליליטר של DMEM / F12 הקר (4 מעלות צלזיוס) כדי להפוך את פתרון ציפוי מטריצת קרום במרתף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פתרון מטריצת קרום במרתף לכלי התרבות המתאימים. לצלחת 6-היטב, לוותר 1 מ&quot;ל לכל טוב. לערבל את הצלחת לוודא פתרון מטריצת הקרום במרתף מכסה לחלוטין כל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Parafilm לאטום את הצלחת / המנה מצופה מטריצת קרום במרתף, ולדגור על רוטמפרטורה מ &#39;במשך שעה 1 לפני השימוש. לחלופין, צלחות מצופים מטריצת קרום במרתף חנות / מנות ב 4 ° C ולהשתמש בתוך 2 שבועות של ציפוי. הערה: הוספת DMEM / F12 נוסף לצלחת / המנה מצופה מטריצת קרום במרתף כדי למנוע התייבשות. לפני שימוש 4 ° C צלחת / מנה מצופה מטריצת קרום במרתף מאוחסן, למקם אותו בארון בטיחות ביולוגי ולאפשר להם להגיע לטמפרטורת חדר למשך לפחות 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטריצת קרום במרתף לשאוב לפני התוספת של מדיום ותאים לחלוטין. </li></ol> 2. הכנת בינונית E8 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום תרבות E8 על ידי הפשרת תוספת E8 הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 10 מיליליטר של מדיום בסיס E8 מהמניות 500 מיליליטר וזורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה כל בקבוקון 10 מיליליטר של תוסף E8 ישירות לתוך 490 מיליליטר של מדיום בסיס E8. האם מדיום E8 מלא לא חם באמבט מים 37 מעלות צלזיוס, כמו תנודות טמפרטורה חוזרות ונשנות יכולות לבזות את bFGF במכלוליםבינוני te E8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בינוני E8 מלא בתוך 2 שבועות של תוספת של התוספת. </li></ol> 3. הפשרה של iPSCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בקבוקון של iPSCs הקפוא מהחנקן נוזלי ומניחים על קרח יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות להפשיר את הבקבוקון באמבט מים 37 מעלות צלזיוס; לערבל את הבקבוקון באמבט המים עד שבר זעיר בלבד של שרידי קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרסיס הבקבוקון עם 70% אתנול והעברה לארון בטיחות ביולוגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של dropwise הבינוני טמפרטורת חדר E8 ישירות לבקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה 2 מיליליטר, להעביר את dropwise ההשעיה תא לתוך 9 מיליליטר של מדיום E8 בצינור חרוטי 15 מיליליטר. לערבל את הצינור לעתים קרובות כדי להבטיח שהתאים ובינוניים מערבבים היטב במהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב XG 200 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant, וresuspend התא גלולה בנפח מתאים של E8 בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את התאים למספר מתאים של מרתף membranמצופי מטריצת דואר בארות, ומקום ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך הלילה. מומלץ צלחת לפחות 0.2 x 10 6 iPSC לכל טוב של 6-גם צלחת כדי לאפשר התאוששות מהירה לאחר הפשרה. </li></ol> 4. תחזוקה וPassaging השגרתי של iPSCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רענן בינוני E8 יומי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על המורפולוגיה וconfluency של תאים עם מיקרוסקופ הפוכה. iPSCs באיכות גבוהה גדל במושבות שטוחות עם גבולות ברורים; מושבות בודדות להחזיק הופעה &quot;כמו מרוצפת-&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר תאי iPSCs כאשר הם מגיעים ~ confluency 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון passaging EDTA על ידי הוספת 0.9 g NaCl ו -500 EDTA μl 0.5 M 500 מיליליטר DPBS. מערבבים היטב כדי לפזר NaCl, ומסנן אבק לעקר. לחמם aliquot של פתרון passaging באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לפני passaging. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למעבר, לשאוב בילה בינוני תרבות תאים לשטוף פעם אחת עם נפח שווה של pas החםsaging פתרון. לשאוב, ומספיק EDTA פיפטה פתרון passaging למעייל התאים (1 מיליליטר לכל טוב של 6-גם צלחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התאים תחת מיקרוסקופ הפוכה ולבחון את מושבות iPSC. המראה של חורים בתוך מושבות וגבולות מורמים יתברר בתוך 2 עד 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב פתרון passaging EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה 10 מיליליטר, לוותר 4 מיליליטר של מדיום E8 (אם משתמש בצלחת 6-היטב) בלחץ גבוה ישירות לתוך זה גם להיות passaged. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את גושי iPSC, ומחולק למספר מתאים של בארות בהתאם ליחס הפיצול בין 1: 8 ל01:12. לא, כמו פירוק של גושי תאים יגרום יתר פיפטה בכדאיות עניה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת בחממה, ולטלטל את הצלחת בחזרה-ושוב וכמה פעמים מצד לצד כדי לפזר את התאים. </li></ol> 5. הכנת MEFs וiPSCs לTansfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 48 שעות לפני transfection, iPSCs המעבר ב ~ 1: 6 לארבע או יותר בארות צלחת 6-גם מצופי מטריצת קרום במרתף, כך שהם יהיו מחוברים% 70 יומיים ומכאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להפשיר MEFs DR4 לתוך מדיום MEF בהיקף של DMEM (גלוקוז גבוהה) בתוספת 10% FBS ו1x MEM-NEAA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת MEFs DR4 לשתי מנות של 10 סנטימטר ב ~ 2 x 10 4 תאים / 2 סנטימטר ודגירת הלילה על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום transfection, לשנות בינוני MEF לE8 בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632 30 דקות לפני ביצוע transfection על iPSCs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: אם ניתוח התזרים cytometric של לאחר transfection iPSCs הוא רצוי, להסיר את צלחת קרום במרתף מצופה מטריצה ​​מ4 ° C ומקום בטמפ &#39;החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: 4 שעות לפני transfection, מוסף תרבות iPSC מראש transfection עם Y-27632 בריכוז הסופי של 10 מיקרומטר. </li></ol> 6. עדין-תא דיסוציאציה מגיב לטיפולnd Transfection של iPSCs באמצעות מערכת Electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון transfection התא ראשוני P3 מ4 ° C ולאפשר לו להגיע לטמפרטורת חדר למשך 30 דקות ~. להוסיף את תוספת 100 μl השלם לפתרון transfection לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגיב חם עדינים תאי ניתוק באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג AAVS1 TALENs (PZT-AAVS1-L1 וPZT-AAVS1-R1) תורם וAAVS1-CAG-EGFP מ-20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר iPSCs מן החממה ולשטוף פעם אחת עם DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של מגיב ניתוק עדין תאים לכל טוב, ודגירת iPSCs על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, או עד שיותר מ -50% מהתאים ניתקו מכלי התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה את התאים למעלה ולמטה כמה פעמים בעזרת פיפטה p1000 לנתק את כל תאים שנותרו מספינת התרבות, וכדי לשבור את גושי iPSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר של מדיום E8 היטב כל אחד, ופיפטה מספר פעמים למעלה ולמטה באמצעות פיפטה 10 מיליליטר לפיורדאאה disaggregate גושי תאים לתאים בודדים הערה: יעילות Transfection יורדת באופן משמעותי אם גושי תא אינם מספיק מפוצלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף iPSCs בצינור חרוטי 15 מיליליטר, ו צנטריפוגות ב 3 דקות 100 XG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant, ותאים גלולים בסכום מינימאלי של מדיום E8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים באמצעות hemocytometer לאחר היישום של כתם חיוני כמו 0.4% Trypan כחול. ודא כי תאים הם ניתקו מספיק תוך ספירת (1-3 תאים לכל &quot;גוש&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 3 x 10 6 תאים לכל אחד משני צינורות חרוטי 15 מיליליטר, וספין למטה שוב ב 100 XG במשך 3 דקות. הערה: צנטריפוגה במהירות נמוכה מפחיתה את מתח התא ומאפשרת מחדש השעיה קלה של iPSCs לפני electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מערכת electroporation לתכנית הספציפית תאים מהסוג לקו העוברי האנושי בתאי גזע H9 (תכנית CB-150). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant מcelכדורי l. לגלולה אחת, להוסיף 10 מיקרוגרם של תורם HR כמדגם שליטה. לגלולה אחרת להוסיף 10 מיקרוגרם של תורם HR, יחד עם 5 מיקרוגרם של כל Talen (PZT-AAVS1-L1 וPZT-AAVS1-R1) כמדגם ניסיוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל תא גלולה בפתרון של transfection התא הראשוני P3 100 μl, ולהעביר לקובט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את transfection ולהוסיף מייד 500 μl של מדיום E8 טמפרטורת חדר לכל קובט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את dropwise iPSCs transfected לצלחת 10 סנטימטרים אחד המכילה MEFs DR4 מוכן בשלב 5.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: להוסיף כמה טיפות מכל ניסוי ולאחת מצלחת 6-היטב מצופה מטריצת קרום במרתף אם זרימת cytometry anaylsis של יעילות transfection היא רצויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 6.15-6.17 לסיים שתי הדגימות. למחרת, לשטוף תאים עם DPBS פעמיים ולעבור מדיום התרבות NutriStem, המופיע לתמוך תרבות iPSC על מתקני האכלה טובות יותר מאשר E8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trפסגות ביטוי EGFP ansient ב48 עד 72 שעות לאחר transfection; להעריך את יעילות transfection כרצוי. </li></ol> 7. puromycin בחירה של iPSCs הממוקד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין בחירת puromycin 72 שעות לאחר transfection כאשר iPSCs להגיע 70% confluency. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לNCRM5 iPSCs, יתחיל בחירת puromycin ברמה של 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר puromycin (1/2 מנה המלאה) המדולל למדיום תרבות NutriStem. ריכוז puromycin האופטימלי עשוי להשתנות מ0.25 ל1 מיקרוגרם / MLL לכמה קווי iPSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> iPSCs תרבות ב0.5 מיקרוגרם / מיליליטר puromycin NutriStem + במשך 3 ימים, מרענן הבינוני יומי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 3 ימים, להגדיל את הריכוז של puromycin ל1 מיקרוגרם / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> iPSCs תרבות תחת 1 מיקרוגרם / בחירת puromycin מיליליטר במשך 7 עד 8 ימים נוספים, או עד מושבות שונות מופיעים גדולה מספיק למסיק מושבה. </li></ol> 8. מושבה קטיף והרחבה של iPSCs הממוקד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרום במרתף שימושמטריצה ​​למעייל צלחת 96-היטב על ידי מחלק 50 μl של פתרון ציפוי מטריצת קרום במרתף (מטריצת קרום במרתף 2 מ&quot;ג המדולל ל -12 מיליליטר DMEM / F12) לתוך כל טוב. אחסן את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס למשך לילה לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שאפשר את הצלחת מצופה מטריצת הקרום במרתף כדי להגיע לטמפרטורת חדר, לשאוב את מטריצת הקרום במרתף ולוותר 100 μl E8 בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632 לכל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מיקרוסקופ הפוכה לארון בטיחות ביולוגי, ולרסס קל עם 70% EtOH לעקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך זכוכית פיפטה פסטר מעל מבער בונזן להשיג כלי המושבה קטיף אידיאלי שיש לו &quot;וו&quot; זעיר בקצה. לעקר עם 70% EtOH, ואת המקום במכסת המנוע לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחת המכילה מושבות iPSC ממוקדות מהחממה, ואת המקום לתוך מכסה המנוע מתחת למיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר iPSCs על ידי התחקות מעגל סביב גבול המושבה עם כלי קטיף המושבה.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ב&quot; הוו &quot;של כלי המושבה הקטיף כדי לגרד בעדינות ולהסיר את המושבה iPSC מפני שטח של הצלחת. למושבות גדולות יותר, ציור X עם כלי קטיף המושבה לרבעון המושבה תקל תא צמיחה לאחר מחדש ציפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שגושי תאים מנותקים וצפים בחופשיות, להשתמש פיפטה p200 מוגדרת ~ 30 μl לאסוף iPSCs. פלייט תאים ישירות לתוך צלחת 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: להשתמש פיפטה P20 מוגדרת ~ 5 μl לאסוף iPSCs לתוך צינור eppendorf, ולאחר מכן להוסיף 50 μl מגיב ניתוק עדין תאים לעכל במשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס. לאחר עיכול, להוסיף בינוני E8 500 μl לתוך צינור eppendorf לדלל מגיב ניתוק העדין-תא ולסובב את התאים ב XG 200 בmicrocentrifuge טבלה העליון סטנדרטי למשך 5 דקות. אז לשאוב ביותר של המדיום ולהשאיר ~ 30 μl לresuspend ולהעביר את התאים לתוך הצלחת 96-היטב. הערה: זוגישה תקל על הניתוק של גוש התא והתרחבות מהירה של מושבה הרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך קטיף מושבה עד מספר מספיק של מושבות iPSC נאספו (בערך 20-30 מושבות לכל ניסוי מומלץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קטיף מושבה, למקם את צלחת 96-היטב באינקובטור במשך לילה. רענן עם מדיום מלא E8 למחרת, ותרבות ומחוברות עד ~ 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי מעבר מ96-היטב לתוך 24 גם, אז ל6-גם, כפי שמתוארים בשלבי 4.5-4.10. הערה: הכרכים של פתרון EDTA ובינוני E8 צריכים להיות מופחתים באופן יחסי בעת שימוש בבארות קטנות יותר מצלחת 6-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך הצלחת מיקוד בצומת PCR וניתוח כתם דרום כדי לאשר שילוב ממוקד קלטת והעדר וקטורים הוכנסו באופן אקראי 16. </li></ol>

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Hentze, H., Graichen, R., Colman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+and+the+safety+of+embryonic+stem+cell-derived+grafts.">Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts.</a> Trends Biotechnol. 25 (1), 24-32 (2007).</li><li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust,+persistent+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+is+achieved+with+AAVS1-targeted+integration.">Robust, persistent transgene expression in human embryonic stem cells is achieved with AAVS1-targeted integration.</a> Stem Cells. 26 (2), 496-504 (2008).</li><li>Lombardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+integration+and+tailoring+of+cassette+design+for+sustainable+gene+transfer.">Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer.</a> Nat Methods. 8 (10), 861-869 (2011).</li><li>Ogata, T., Kozuka, T., Kanda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+insulator+in+AAVS1,+a+preferred+region+for+integration+of+adeno-associated+virus+DNA.">Identification of an insulator in AAVS1, a preferred region for integration of adeno-associated virus DNA.</a> J Virol. 77 (16), 9000-9007 (2003).</li><li>Zwaka, T. P., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+in+human+embryonic+stem+cells.">Homologous recombination in human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).</li><li>Urbach, A., Schuldiner, M., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+for+Lesch-Nyhan+disease+by+gene+targeting+in+human+embryonic+stem+cells.">Modeling for Lesch-Nyhan disease by gene targeting in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 22 (4), 635-641 (2004).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+expressed+and+silent+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+using+zinc-finger+nucleases.">Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases.</a> Nature biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).</li><li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+of+a+disease-related+gene+in+human+induced+pluripotent+stem+and+embryonic+stem+cells.">Gene targeting of a disease-related gene in human induced pluripotent stem and embryonic stem cells.</a> Cell stem cell. 5 (1), 97-110 (2009).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases.">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nature. 29 (8), 731-734 (2011).</li><li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcription+activator-like+effector+toolbox+for+genome+engineering.">A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering.</a> Nature protocols. 7 (1), 171-192 (2012).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs.">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell stem cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Enhanced+Green+Fluorescent+Protein+Expression+After+Differentiation+and+Transplantation+of+Reporter+Human.">Stable Enhanced Green Fluorescent Protein Expression After Differentiation and Transplantation of Reporter Human.</a> Induced Pluripotent Stem Cells Generated by AAVS1 Transcription Activator-Like Effector Nucleases. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 821-835 (2014).</li><li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidase-deficient+neutrophils+from+X-linked+chronic+granulomatous+disease+iPS+cells:+functional+correction+by+zinc+finger+nuclease-mediated+safe+harbor+targeting.">Oxidase-deficient neutrophils from X-linked chronic granulomatous disease iPS cells: functional correction by zinc finger nuclease-mediated safe harbor targeting.</a> Blood. 117 (21), 5561-5572 (2011).</li><li>Luo, Y., Rao, M., Zou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+GFP+Reporter+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Using+AAVS1+Safe+Harbor+Transcription+Activator-Like+Effector+Nuclease.">Generation of GFP Reporter Human Induced Pluripotent Stem Cells Using AAVS1 Safe Harbor Transcription Activator-Like Effector Nuclease.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 29, 5A.7.1-5A.7.18 (2014).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Beers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passaging+and+colony+expansion+of+human+pluripotent+stem+cells+by+enzyme-free+dissociation+in+chemically+defined+culture+conditions.">Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions.</a> Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

השלבים הקריטיים ביותר עבור הדור המוצלח של נמל בטוח AAVS1 ממוקד iPSCs האנושי: (1) ביעילות מספק פלסמידים Talen ותורם לiPSCs ידי transfection; (2) אופטימיזציה של הניתוק של iPSCs לתוך תאים בודדים לפני transfection וציפוי צפיפות לאחר transfection; (3) אופטימיזציה של מינון וזמן של סמים-בחירה מבוססת על הצמיח?...

היכולת לתכנת מחדש תאים סומטיים אנושיים לתאים כמו תאי גזע עוברי הנגרמים גזע pluripotent (iPSCs) התגלה לראשונה על ידי et al טקהאשי. בשנת 2007 1. Fibroblasts עורי אדם transduced עם רטרווירוסים להביע ארבעה גורמי שעתוק (יאמאנאקה מה שזכה לכינוי גורמי Oct3 / 4, Sox2, c-Myc, וKlf4) הוצג להיות דומה מאוד לתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) המבוססים על מורפולוגיה, הפצה, ביטוי גנים, ומעמד אפיגנטיים; באופן מכריע, iPSCs גם מסוגל להבדיל לתאים של כל שלוש השכבות הנבט 1. הקיבולת הפוטנציאלית ובידול השגשוג של iPSCs גורמת להם כלים מאוד אטרקטיביים; על ידי תכנות מחדש של תאים מחולים הסובלים ממחלות מסוימות, יכול לשמש גם כiPSCs מערכות במבחנה מודל מחלה וכמו הרפוי פוטנציאלי. לצורך האחרון, כמה בעיות יש לטפל לפני את מלוא הפוטנציאל של iPSCsבסביבה קלינית יכול להתממש; הפוטנציאל הסרטני במבחנה של hESCs התרבותי וiPSCs, השימוש בנגזרי xenogenic במהלך תכנות מחדש ותחזוקת תא, והצורך לעקוב אחר תאים מושתלים in vivo כל המכשולים הקריטיים ליישום הקליני בתאי גזע pluripotent (נבדק על ידי et Hentze ב. 2). פתרון אידיאלי לצורך מעקב אחר תאים מובחנים לאחר ההשתלה יהיה כרוך סמן חזותי לגילוי שמתנגד השתקה ואת הגיוונים ללא תלות ביישום. ביטוי חזק ומתמשך של transgenes המשולב הוא הכי בקלות להשגה כאשר DNA אקסוגני מוחדר לוקוסים בטוח נמל; כלומר, אתרים הגנומי המאפשרים שעתוק מספק של וקטור משולב ובו בזמן מיתון הפרעות ביטוי בגנים 3 שכנים. אתר אחד כזה שהתאפיין גם מאוד מאז גילויו הוא integr וירוס adeno הקשוריםאתר ation 1 (AAVS1), באינטרון הראשון של 1 12C מקטע הרגולציה גן phosphatase החלבון (PPP1R12C). מוקד זה הוכח לא רק כדי לאפשר ספג וביטוי חזק של transgenes המשולב בזמן הוארך בתרבות ובבידול המבחנה 3, אלא גם כדי להגן מקיפים גנים מהפרעות תעתיק 4; שני התכונות נחשבות בשל נוכחותם של אלמנטים המבודדים הכרומטין אנדוגני איגוף אתר AAVS1 5. התקדמות בכלים הנדסי הגנום מעל רק בעשור האחרון הקלה באופן משמעותי את קלות ויעילות שבה ניתן להשיג מניפולציות גנטיות בכל סוג תא. בעוד ניסויים מוצלחים מוקדמים הסתמכו על רמות נמוכות ביותר של רקומבינציה אנדוגני ההומולוגית (HR) עם תורם הציג להשיג גן המיקוד בESCs 6,7, השימוש בnucleases אתר ספציפי, כגון nucleases אצבע אבץ (ZFNs), שsignificantly לגרום רקומבינציה ההומולוגית באמצעות הדור של הפסקת פעמיים תקועים DNA גדל היעילות של ניסויים כאלה 8,9 מאוד. Repurposing של שתי effectors כמו activator-השעתוק (הסיפורים) של סוגי Xanthomonas פתוגניים צמח וחוזר פרוקריוטים התקבץ interspaced באופן קבוע הקצר palindromic / מערכת Cas9 לnucleases מעצב אתר ספציפי יעיל (CRISPR) הפך גן מיקוד בתאי גזע pluripotent ונגיש מתודולוגיה מעשית 10-13. מאמר האחרון שתואר שיטה יעילה לשילוב היציב של קלטת כתב ניאון ירוקה למוקד בטוח נמל AAVS1 בiPSCs האנושי באמצעות nucleases TALE (TALENs) 14. iPSCs הממוקד אלו שומרים על הקרינה שלהם גם לאחר התמיינות מכוונת לשריר לב והשתלה לתוך מודל עכבר של אוטם שריר לב (MI), מתן ראיות חזקות לשירות כזהיציבות בתאי גזע pluripotent ניאון 14. כדי להשיג מושבות ממוקדות, שיטת גן-מלכודת שימשה בי שחבור-acceptor (SA), רצף הפפטיד ביקוע עצמי 2A מציב את puromycin N-אצטיל-transferase הגן (PAC) תחת השליטה של אמרגן PPP1R12C אנדוגני; כך, רק iPSCs ששלב תורם DNA במוקד AAVS1 להביע PAC, טיוח אותם לבחירה המבוסס על puromycin התנגדות; (איור 1, 15). פרוטוקול זה מפרט את הנהלים של יצירת AAVS1-GFP iPSCs דיווח בעיתון האחרון 14, כולל התהליך של transfecting iPSCs עם TALENs ותורם 9.8 kb לשלב קטע DNA 4.2kb למוקד AAVS1 בטוח-הנמל, בחירת iPSCs המבוססים על puromycin-התנגדות, ומושבות קטיף להרחבה משובט. הטכניקות המתוארות במסמך זה יכול להיות מיושם על ניסויי הנדסה גנטית רבים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1437">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:588px;">NAME OF MATERIAL/EQUIPMENT</td>
			<td style="width:123px;">COMPANY</td>
			<td style="width:123px;">CATALOG #</td>
			<td style="width:603px;">COMMENTS/DESCRIPTION</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Essential 8 Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>Store basal medium at 4&#176;C. Store supplement at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DR4 MEF 2M IRR - Academic</td>
			<td>GlobalStem</td>
			<td>GSC-6204G</td>
			<td>Store in liquid Nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-040</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Defined Fetal Bovine Serum, US Origin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Thaw at 4&#176;C overnight and aliquot. Store aliquots at -20&#176;C until needed.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4D-Nucleofector Core unit&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1001B</td>
			<td>part of the electroporation system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4D-Nucleofector X unit&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1001X</td>
			<td>part of the electroporation system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-3024</td>
			<td>Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Thaw overnight at 4&#176;C and warm an aliquot in a 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NutriStem XF/FF Culture Medium</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>01-0005</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Thaw overnight at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52637 and 52638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>22212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Prepare working aliquots of 1 mg/mL in ddH2O.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120V 60Hz</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-004-521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TX-750 4 &#215; 750mL Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75003607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transfection, selection, and colony-picking of human induced pluripotent stem cells talen-targeted with a gfp gene into the aavs1 safe harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.

הדמיה של הפרוטוקול מסופקת באיור 2, עם תקופות בי iPSCs בתרבית בינונית שונה מודגש על ידי שני ירוקים לE8 או הכחול לNutriStem. חשוב transfect רק iPSCs באיכות גבוהה; לבחון מנות תרבות ברחבי תחזוקה שוטפת ולוודא שתרבויות iPSC מכילות מושבות בעיקר ברורות נושאות מורפולוגיה כמו מרוצפת <st...

Watch this Scientific Journal Video about Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor at JoVE.com

Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

Transfection, בחירה, ומושבת קטיף של תאי גזע האנושי המושרה pluripotent Talen-ממוקד עם גן GFP לSafe Harbor AAVS1

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

transfection-selection-colony-picking-human-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

19.3K Views.  National Institutes of Health. TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

Video: Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

כימות תלת ממדיות של קוצים הדנדריטים מפירמידת נוירונים שמקורם בתאי גזע האנושי המושרה pluripotent

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They are also involved in many airway diseases through their innate immune response and interaction with immune and airway stromal cells. NECs are of particular interest for studies in children due to their accessibility during clinical visits. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been generated from multiple cell types and are a powerful tool for modeling human development and disease, as well as for their potential applications in regenerative medicine. This is the first protocol to lay out methods for successful generation of iPSCs from NECs derived from pediatric participants for research purposes. It describes how to obtain nasal epithelial cells from children, how to generate primary NEC cultures from these samples, and how to reprogram primary NECs into well-characterized iPSCs. Nasal mucosa samples are useful in epidemiological studies related to the effects of air pollution in children, and provide an important tool for studying airway disease. Primary nasal cells and iPSCs derived from them can be a tool for providing unlimited material for patient-specific research in diverse areas of airway epithelial biology, including asthma and COPD research.

This publication demonstrates methods for successful sampling and culture of nasal epithelial mucosa from children, and reprogramming these cells to induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs).

טפח תאי אפיתל באף הראשי מיילד לתכנת מחדש לתאי גזע מושרים

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

במבחנה בידול של האדם pluripotent בתאי גזע לתאי Trophoblastic

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is that the reprogramming of somatic cells to produce human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) avoids the ethical and legislative issues related to the use of human embryonic stem cells (hESCs). HiPSCs can be expanded and efficiently differentiated into different types of neuronal and glial cells, serving as test systems for toxicity testing and, in particular, for the assessment of different pathways involved in neurotoxicity. This work describes a protocol for the differentiation of hiPSCs into mixed cultures of neuronal and glial cells. The signaling pathways that are regulated and/or activated by neuronal differentiation are defined. This information is critical to the application of the cell model to the new toxicity testing paradigm, in which chemicals are assessed based on their ability to perturb biological pathways. As a proof of concept, rotenone, an inhibitor of mitochondrial respiratory complex I, was used to assess the activation of the Nrf2 signaling pathway, a key regulator of the antioxidant-response-element-(ARE)-driven cellular defense mechanism against oxidative stress.

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are considered a powerful tool for drug and chemical screening and for the development of new in vitro models for toxicity testing, including neurotoxicity. Here, a detailed protocol for the differentiation of hiPSCs into neurons and glia is described.

Protocol עבור הבחנה של תאים גזעיים Pluripotent Indoced האדם לתוך תרבויות מעורבות של נוירונים וגליה עבור בדיקה נוירוטוקסיות

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

שימוש האדם המושרה תאים דמויי Hepatocyte נגזר תאי גזע Pluripotent לגילוי סמים

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset cardiovascular disease due to marked elevation of LDL cholesterol (LDL-C) in blood. Statins are the first line of lipid-lowering drugs for treating FH and other types of hypercholesterolemia, but new approaches are emerging, in particular PCSK9 antibodies, which are now being tested in clinical trials. To explore novel therapeutic approaches for FH, either new drugs or new formulations, we need appropriate in vivo models. However, differences in the lipid metabolic profiles compared to humans are a key problem of the available animal models of FH. To address this issue, we have generated a human liver chimeric mouse model using FH induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived hepatocytes (iHeps). We used Ldlr-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (LRG) mice to avoid immune rejection of transplanted human cells and to assess the effect of LDLR-deficient iHeps in an LDLR null background. Transplanted FH iHeps could repopulate 5-10% of the LRG mouse liver based on human albumin staining. Moreover, the engrafted iHeps responded to lipid-lowering drugs and recapitulated clinical observations of increased efficacy of PCSK9 antibodies compared to statins. Our human liver chimeric model could thus be useful for preclinical testing of new therapies to FH. Using the same protocol, similar human liver chimeric mice for other FH genetic variants, or mutations corresponding to other inherited liver diseases, may also be generated.

Here, we present a protocol to generate a human liver chimeric mouse model of familial hypercholesterolemia using human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. This is a valuable model for testing new therapies for hypercholesterolemia.

מודל אנושי העכבר Chimeric הכבד היפרכולסטרולמיה משפחתית באמצעות Hepatocytes נגזר תאי גזע Pluripotent המושרה

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative therapeutic requires a safe, robust, and expedient reprogramming protocol. Here, we present a clinically relevant, step-by-step protocol for the extremely high-efficiency reprogramming of human dermal fibroblasts into iPSCs using a non-integrating approach. The core of the protocol consists of expressing pluripotency factors (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD fusion) from in vitro transcribed messenger RNAs synthesized with modified nucleotides (modified mRNAs). The reprogramming modified mRNAs are transfected into primary fibroblasts every 48 h together with mature embryonic stem cell-specific microRNA-367/302 mimics for two weeks. The resulting iPSC colonies can then be isolated and directly expanded in feeder-free conditions. To maximize efficiency and consistency of our reprogramming protocol across fibroblast samples, we have optimized various parameters including the RNA transfection regimen, timing of transfections, culture conditions, and seeding densities. Importantly, our method generates high-quality iPSCs from most fibroblast sources, including difficult-to-reprogram diseased, aged, and/or senescent samples.

Here we describe a clinically relevant, high-efficiency, feeder-free method to reprogram human primary fibroblasts into induced pluripotent stem cells using modified mRNAs encoding reprogramming factors and mature microRNA-367/302 mimics. Also included are methods to assess reprogramming efficiency, expand clonal iPSC colonies, and confirm expression of the pluripotency marker TRA-1-60.

מבוסס-RNA תכנות מחדש של האנושי Fibroblasts הראשי לתוך תאי גזע Pluripotent המושרה

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

יעיל הבידול של תאים האדם Pluriפוטנטי לתוך תאי הכבד

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

דור של תא צורב עור תלת-ממד של כבל דם-derived המושרה בתאי גזע Pluripotent

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...