Name: transfection, selection, and colony-picking of human induced pluripotent stem cells talen-targeted with a gfp gene into the aavs1 safe harbor
Uploaded: 2015-02-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor at JoVE.com

This research was supported by the NIH Common Fund and Intramural Research Program of the National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases.

1. 지하실 막 매트릭스의 준비 및 plasticware에의 코팅 <ol><li> 얼음에 -20 ° C에서 냉동 기저막 매트릭스 스톡을 넣고 4 ℃에서 밤새 해동. </li><li> 해동 후, 미리 차게 에펜 도르프 튜브에 기저막 매트릭스의 피펫 2 mg을 분취. 필요할 때까지 -20 ° C에서 이러한 보관하십시오. </li><li> , 기저막 매트릭스 코팅 된 플레이트를 준비 에펜 도르프 튜브 사라 얼음의 마지막 조각 (보통 2 ~ 내 시간)까지 얼음에 하나 나누어 해동합니다. </li><li> 해동 후, 기저막 매트릭스 코팅 용액을 차가운 (5 ° C) DMEM / F12 12 ml의 기저막 매트릭스를 추가한다. </li><li> 적절한 배양 용기에 기저막 매트릭스 솔루션을 추가한다. 6 잘 플레이트를 들어, 잘 당 1 ml의 분배. 기저막 매트릭스 솔루션은 완전하게 잘 다루고 있는지 확인하기 위해 판을 소용돌이. </li><li> 파라 필름은 기저막 매트릭스 코팅 플레이트 / 접시를 밀봉하고, 루 부화사용하기 전에 1 시간 동안 m 온도. 또한, 매장 기저막 매트릭스 코팅 플레이트 / 4 ° C에서 요리와 코팅 2 주 이내에 사용한다. 참고 : 건조를 방지하기 위해 기저막 매트릭스 코팅 플레이트 / 접시에 추가 DMEM / F12를 추가합니다. 39 ° C 보관 기저막 매트릭스 - 코팅판 / 접시를 사용하기 전에 생물학적 안전 캐비넷에 배치하고 적어도 30 분 동안 실온에 올 수있다. </li><li> 완전 배지 및 세포의 첨가 이전 대기음 기저막 매트릭스. </li></ol> E8 매체의 제조 2 <ol><li> 4 ℃에서 하룻밤 E8 보충을 해동하여 E8 문화 매체를 준비합니다. </li><li> 500 ml의 재고에서 E8 기초 10 ml의 배지를 제거하고 폐기합니다. </li><li> 직접 E8 기초 배지 490 ml의에 E8 보충의 전체 10 ml의 유리 병을 피펫. 반복 온도 변동 공단에서 bFGF에 저하 될 수로서, 37 ° C 물욕없는 따뜻한 완전한 E8 매체를 수행TE E8 매체. </li><li> 보충 또한 2 주 이내에 완료 E8 매체를 사용합니다. </li></ol> iPSCs 3. 해동 <ol><li> 드라이 아이스에 액체 질소와 장소에서 냉동 iPSCs의 병을 제거합니다. </li><li> 빠르게 37 ° C의 물을 욕조에 유리 병을 해동; 얼음 유적의 아주 작은 조각까지 수조의 유리 병을 소용돌이 친다. </li><li> 생물 안전 캐비닛에 70 % 에탄올 및 전송을 유리 병 스프레이. </li><li> 직접 유리 병에 실온 E8 매체 적가의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 2 ㎖를 피펫을 사용하여, 15ml의 원뿔형 튜브에 E8 배지 9 ㎖ 중에 세포 현탁액을 적가 옮긴다. 세포와 매체가 신속하게 잘 혼합되도록 자주 튜브를 소용돌이. </li><li> 5 분 동안 200 XG에 세포를 원심 분리기. </li><li> 상등액을 흡인하고, 10 μM Y-27632로 보충 E8의 적절한 부피 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 지하의 적절한 숫자로 셀을 추가 membran하룻밤 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 전자 매트릭스 코팅 우물과 장소. 그것은 해동 후 신속한 복구를 가능하게하는 6 웰 플레이트의 웰 당 최소 0.2 × 10 6 IPSC을 도금하는 것이 좋습니다. </li></ol> 4. 유지 보수 및 i​​PSCs의 일상과 Passaging <ol><li> 매일 E8 매체를 새로 고칩니다. </li><li> 거꾸로 현미경으로 형태와 세포의 포화 상태를 모니터링합니다. 높은 품질의 iPSCs는 별개의 테두리 평면 식민지에서 성장; 개별 식민지는 &quot;조약돌 같은&quot;모양을 가지고있다. </li><li> 통로 iPSCs 세포들은 70 % ~ 포화 상태에 도달 할 때. </li><li> 0.9 g의 NaCl 500 ML의 DPBS에 500 ㎕의 0.5 M EDTA를 추가하여 EDTA의 계대 솔루션을 준비합니다. NaCl을 살균하고, 진공 필터를 용해 잘 섞는다. 계대 이전에 37 ° C의 물을 용기에 계대 용액의 분취 량을 따뜻하게. </li><li> 통로, 기음 문화 매체를 소비하고 따뜻한 싶어서 같은 부피로 한 번 세포를 씻어솔루션을 징. 코트에 대기음, 피펫 충분히 EDTA 계대 솔루션 세포 (6 웰 플레이트의 웰 당 1 mL)를 첨가 하였다. </li><li> 거꾸로 현미경으로 세포를 놓고 IPSC 식민지를 관찰합니다. 자란 콜로니 테두리 내의 구멍의 모양은 2 내지 5 분 이내에 분명해질 것이다. </li><li> 조심스럽게 EDTA의 계대 솔루션을 대기음. </li><li> 직접 잘 계대 할 각에 고압 (6 웰 플레이트를 사용하는 경우) 10ml를 피펫을 사용하여, E8 매체의 4 ml의 분배. </li><li> IPSC 덩어리를 수집하고, 1 ~ 분할 비에 따라 웰의 적절한 개수로 분할 : 1:12 8. 오버 피펫으로 세포 덩어리의 세분화는 가난한 생존 발생합니다하지 마십시오. </li><li> 인큐베이터에서 플레이트를 배치하고, 세포를 분산시키는 전후 및 좌우로 수회 플레이트 바위. </li></ol> Tansfection에 대한 MEFs에와 iPSCs 5. 준비 <ol><li> transfectio하기 48 시간 전에N, 통로 iPSCs는 ~ 1 : 지하실 막 매트릭스 코팅 6 웰 플레이트의 네 개 이상의 우물에 6 그들은 이일 때문에 70 % 융합 될 수 있도록. </li><li> 다음 날, 10 % FBS 및 1X MEM-NEAA 보충 DMEM (높은 포도당)로 구성된 MEF 매체에 DR4 MEFs에 해동. </li><li> ~ 2 × 104 세포 / cm 2에서 2 개의 10-cm 요리에 플레이트 DR4 MEFs에와 하룻밤에 37 ° C를 품어. </li><li> 형질의 날, 30 분 iPSCs에 형질 전환을 수행하기 전에 10 μM Y-27632 보충 E8에 MEF 매체를 변경합니다. </li><li> 옵션 : iPSCs 후 형질의 유세포 분석이 필요한 경우, 실온에서 기저막 매트릭스 코팅 4 ° C 접시와 장소를 제거합니다. </li><li> 선택적 : 4 시간에 형질 감염 전 10 μM의 최종 농도 Y-27632 미리 형질 IPSC 배양을 보충. </li></ol> 6. 부드러운 세포 해리 시약 처리차 형질은 iPSCs의 일렉트로 시스템을 사용하여 <ol><li> 4 ° C에서 P3 일차 전지 형질 솔루션을 꺼내 ~ 실온에 30 분을 제공 할 수 있습니다. 사용하기 전에 형질 전환 솔루션으로 전체 100 μL 보충제를 추가합니다. </li><li> 37 ° C의 물을 욕조에 따뜻한 부드러운 세포 분리 시약. </li><li> AAVS1 TALENs (PZT-AAVS1-L1 및 PZT-AAVS1-R1) -20 ° C에서와 AAVS1 - CAG-EGFP 기증자를 구합니다. </li><li> 인큐베이터에서 iPSCs를 제거하고 DPBS 한 번 씻는다. </li><li> 웰 당 부드러운 세포 해리 시약 1 mL를 넣고 5 분 동안 37 ° C에서 배양 한 iPSCs, 또는 세포의 50 % 초과가 배양 용기로부터 해리 될 때까지. </li><li> 위로 배양 용기에 남아있는 모든 세포를 해리하고, IP​​SC 덩어리를 깨고 P1000 피펫을 사용하여 몇 번 아래로 세포를 피펫. </li><li> 푸르트에 10 ml의 피펫을 사용하여 각 웰에 E8 매체의 2 mL를 넣고 피펫 위아래로 여러 번어 하나의 세포로 세포 덩어리들을 분해 주 : 세포 덩어리가 충분히 세분화하지 않다면 형질 효율이 크게 감소한다. </li><li> 3 분 100 XG에 15 ML 원뿔 관에서 iPSCs, 원심 분리기를 수집합니다. </li><li> E8 매체의 최소량 대기음 상등액과 세포를 재현 탁. </li><li> 중요한 얼룩과 같은 0.4 % 트리 판 블루의 신청 후 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. ( &quot;덩어리&quot;1-3 셀)을 계산하는 동안 세포가 충분히 해리되어 있는지 확인합니다. </li><li> 두 15 ML 원뿔 튜브에 각각 3 × 10 6 세포를 분배하고, 3 분 동안 100 XG에서 다시 스핀 다운. 주 : 저속 원심 분리 세포 스트레스를 줄이고 전기 전에 iPSCs 쉽게 재 현탁한다. </li><li> 인간 배아 줄기 세포주 H9 (프로그램 CB-150)에 대한 세포 형 특정 프로그램에 전기 천공 시스템을 설정한다. </li><li> 원심 분리 후, CEL에서 뜨는을 대기음L 펠렛. 한 펠렛, 제어 샘플로 HR 기증자의 10 μg의를 추가합니다. 다른 펠렛의 5 μg의와 함께 HR 기증자의 10 μg의를 추가, 각 실험 시료로 TALEN (PZT-AAVS1-L1 및 PZT-AAVS1-R1). </li><li> P3 일차 세포 형질 감염 용액 100 ㎕ 각각의 세포 펠렛을 재현 탁하고, 큐벳에 옮긴다. </li><li> 형질 전환을 수행하고 즉시 각 큐벳에 실온 E8 매체의 500 μl를 추가합니다. </li><li> 단계 5.4에서 준비 DR4의 MEFs에를 포함 한 10 cm 접시에 형질 전환 iPSCs 적하을 전송합니다. </li><li> 옵션 : 형질 전환 효율의 anaylsis 유동 세포 계측법이 필요한 경우 기저막 매트릭스 코팅 6 웰 플레이트 잘 하나에 각 실험에서 몇 방울을 추가합니다. </li><li> 반복은 모두 샘플을 완료 6.15-6.17 단계를 반복합니다. 다음 날, DPBS로 세포를 두 번 씻어 E8보다 피더에 더 IPSC 문화를 지원하기 위해 나타납니다 NutriStem에 문화 매체를 전환합니다. </li><li> TR48 시간 포스트 형질 72에서 ansient EGFP 발현 피크; 원하는 형질 전환 효율을 평가. </li></ol> 표적으로 iPSCs 7. 퓨로 마이신 선택 <ol><li> iPSCs는 70 % 포화 상태에 도달하면 퓨로 마이신 선택을 형질 전환 후 72 시간을 시작합니다. </li><li> NCRM5 iPSCs를 들어, NutriStem 배양 배지로 희석하여 0.5 ㎍ / ㎖의 퓨로 마이신 (1/2 전체 용량)에서 퓨로 마이신 선택을 시작합니다. 최적의 퓨로 마이신 농도는 0.25에서 일부 IPSC 라인 1 ㎍ / MLL에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 매일 매체를 새로 고침 3 일간 NutriStem + 0.5 ㎍ / ㎖의 퓨로 마이신의 문화 iPSCs. </li><li> 삼일 후, 1 ㎍ / ml의 퓨로 마이신의 농도를 증가시킨다. </li><li> / ㎖의 퓨로 마이신 선택 1 μg의 아래 문화 iPSCs 다른 7~8일에 대한, 또는 때까지 별개의 식민지는 식민지 따기위한 충분 나타납니다. </li></ol> 8. 식민지 따기 및 대상 iPSCs의 확장 <ol><li> 사용 기저막코팅하는 매트릭스로 각 웰 (12 ㎖의 DMEM / F12에 희석이 MG 기저막 매트릭스) 기저막 매트릭스 코팅 용액 50 μL를 분배하여 96- 웰 플레이트. 4 ° C에서 하룻밤 사용하기 전에 판을 보관하십시오. </li><li> 기저막 기질 - 코팅 플레이트를 실온으로 온시킨 후, 기저막 매트릭스 대기음 10 μM Y-27632를 각 웰에 100 ㎕를 첨가하여 분배 E8. </li><li> 생물 안전 캐비닛에 거꾸로 현미경을 배치하고 소독 70 % EtOH로 가볍게 스프레이. </li><li> 끝에 작은 &quot;훅&quot;가 이상적인 식민지 따기 도구를 얻기 위해 분젠 버너 위에 유리 파스퇴르 피펫을 당깁니다. 70 % EtOH로 소독하고 건조 후드에 배치합니다. </li><li> 인큐베이터에서 대상 IPSC 식민지를 포함하는 요리를 제거하고 현미경으로 후드에 배치합니다. </li><li> 식민지 따기 도구를 사용하여 식민지 국경 주위에 원을 추적하여 iPSCs를 선택합니다.</li><li> 부드럽게 긁어 판의 표면에서 IPSC 식민지를 제거 식민지 따기 도구의 &quot;훅&quot;를 사용합니다. 큰 콜로니를 들어, 콜로니 재 도금 후 세포 성장을 용이하게 분기에 콜로니 피킹 도구 X 드로잉. </li><li> 세포 덩어리가 분리 자유롭게 떠되면, iPSCs를 수집 ~ 30 μl를 설정 P200의 피펫을 사용합니다. 직접 96 웰 플레이트에 플레이트 세포. </li><li> 옵션 : 다음 37 ℃에서 5 분 동안 소화 50 μL 부드러운 세포 분리 시약을 추가, 에펜 도르프 튜브에 iPSCs를 수집 ~ 5 μL로 설정 P20 피펫을 사용합니다. 소화 후, 부드러운 세포 해리 시약 희석시키고 5 분 동안 표준 테이블 탑 마이크로 원심 200 XG에서 세포를 스핀 다운 에펜 도르프 튜브에 500 μL E8 배지를 추가한다. 그런 매체의 대부분을 대기음 ~ 재현 탁하고 96 웰 플레이트에 세포를 전달하는 30 μl를 떠난다. 참고 :이방법은 세포 덩어리와 촬상 콜로니의 빠른 팽창 해리를 촉진 할 것이다. </li><li> IPSC 식민지 충분한 수의 수집 될 때까지 식민지 따기 계속 (약 실험 당 20 ~ 30 식민지 권장). </li><li> 식민지 따기 후, 하룻밤 인큐베이터에서 96 웰 플레이트를 배치합니다. 전체 E8 매체 다음날, 문화 ~ 70 %까지 합류로 새로 고칩니다. </li><li> 로 96 웰에서 통과 세포를 24- 웰, 다음에 6 자, 단계 4.5-4.10에 설명 된대로. 주 : 6- 웰 플레이트 웰보다도 작은 사용시 EDTA 용액 및 E8 매체의 볼륨이 감소 될 비례한다. </li><li> 무작위로 삽입 된 벡터 (16)의 타겟 카세트 통합 및 부재를 확인하기 위해 접합 PCR 남부 오 점 분석에 의해 표적으로 성공을 평가합니다. </li></ol>

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저자는 그들이 더 경쟁 금융 이익이 없다는 것을 선언합니다.

(1) 효율적으로 형질 전환에 의해 iPSCs에 TALEN 및 기증자 플라스미드를 전달; AAVS1 안전 항구의 성공적인 세대를위한 가장 중요한 단계는 인간의 iPSCs가되는 대상 (2) 형질 전환 후 형질 전환 및 도금 밀도 전에 단일 세포로 iPSCs의 분리를 최적화; (3) 투여 량 및 IPSC 라인의 성장에 기초한 약물 - 선택 시간을 최적화; (4)주의 깊게 해부 및 대상 식민지를 따기와 / 웰 새 접시에 전송. Hockemeyer의 용지 (10...

배아 줄기 세포와 유사한 유도 만능 줄기 세포로 (iPSCs)를 인간의 체세포를 재 프로그램 할 수있는 기능이 처음 다카하시 등에 의해 발견되었다. 2007 1. 레트로 바이러스는 네 개의 전사 인자를 발현하는 형질 도입 인간 피부 섬유 아세포 (소위 불리는 야마나카는 OCT3 요인 / 4, SOX2, C-Myc와, 그리고 Klf4)는 형태, 증식, 유전자 발현 및 후생 유전 학적 상태에 따라 인간 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기)에 매우 유사한 것으로 나타났다; 결정적 iPSCs 또한 모든 세 배엽 (1)의 세포로 분화 할 수있다. iPSCs의 증식 잠재력과 차별화 용량은 그들에게 매우 매력적인 도구를 만드는; 특정 질병을 앓고있는 환자로부터 세포를 재 프로그래밍함으로써 iPSCs 체외 질병 모델 시스템과 같은 잠재적 치료제로서 모두 사용될 수있다. 후자의 목적을 위해, 몇 가지 문제 iPSCs의 잠재력하기 전에 해결해야임상 환경에서 실현 될 수있다; 시험 관내 배양 된 인간 배아 줄기 및 iPSCs, 리 프로그래밍 및 세포 유지하는 동안 이종 유도체의 사용의 발암 가능성, 및 생체 내에서 이식 된 세포를 추적 할 필요성은 Hentze 외 의해 검토 다 능성 줄기 세포의 임상 적용 (모든 중요한 장애물이다. 2). 분화 된 세포를 이식 후 추적의 필요성에 이상적인 솔루션에 관계없이 응용 프로그램의 침묵과 잡색 레지스트 시각적으로 검출 마커를 포함한다. 외래 DNA가 안전한 항구 궤적에 도입 될 때 통합 된 유전자의 강력하고 지속적인 표현은 가장 쉽게 달성 할 수있다; 즉, 통합 벡터의 충분한 전사를 활성화 이웃 게놈 부위에서 유전자 발현의 3 교란을 완화하는 동시에. 아주 잘 그것의 발견 이후 특징으로 한 그러한 사이트는 아데노 관련 바이러스 integr입니다단백질 인산 가수 분해 효소 (1) 규제 서브 유닛 12C (PPP1R12C) 유전자의 첫 번째 인트론에 ATION 사이트 1 (AAVS1). 이 궤적 유지 및 연장 시간을 통해 통합 된 유전자의 강력한 표현 문화의 체외 분화 3뿐만 아니라, 전사 섭 4에서 유전자를 둘러싼 보호하기 위해 허용 할뿐만 아니라 보였다; 두 기능으로 인해 AAVS1 사이트 (5)의 측면에 내인성 염색질 절연체 요소의 존재에 의한 것으로 생각된다. 방금 지난 10 년간 게놈 엔지니어링 툴의 발전은 크게 임의의 세포 유형의 유전 조작이 달성 될 수있는 용이성 및 효율성을 촉진 하였다. 초기의 성공적인 실험는 ESC -6,7- 타겟팅 유전자를 달성하기 위해 도입 된 도너 내인성 상동 재조합 (HR)의 상당히 낮은 수준에 의존하지만, 예컨대 징크 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs), 유의 사항과 부위 - 특이 적 뉴 클레아 제의 사용ficantly 같은 실험 8,9의 효율성을 크게 증가 이중 가닥 DNA 휴식의 생성을 통해 상동 재조합을 유도한다. 모두 전사 활성제와 같은 이펙터 식물 병원성 크 산토 모나스 장군의 (이야기)와 원핵 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 회문 반복 (CRISPR) 효율적인 사이트 별 디자이너 클레아 제에 / Cas9 시스템의 용도 변경은 만능 줄기 세포에서 표적 유전자를했다 접근 실행 가능한 방법론 10-13. 최근의 논문은 이야기 클레아 제 (TALENs) (14)를 사용하여 인간 iPSCs의 AAVS1 안전 항구의 궤적에 녹색 형광 기자 카세트의 안정적 통합을위한 효율적인 방법을 설명했다. 이러한 목표 iPSCs는의 유용성에 대한 강력한 증거를 제공, 심지어 심근 경색 (MI)의 마우스 모델로 심근 세포 이식에 관한 분화 후 자신의 형광을 유지안정적으로 형광 만능 줄기 세포 (14). 타겟팅 콜로니를 수득하기 위해, 유전자 트랩 방법 플라이 싱 - 억 셉터 (SA)는, 2A 자체 절단 단백질 서열은 내인성 PPP1R12C 프로모터의 제어 하에서 퓨로 마이신 N- 아세틸 전이 효소 (PAC) 유전자를 배치 상기 사용 하였다; 따라서, AAVS1 유전자좌 DNA 공여체를 도입 한 경우에만 iPSCs는 퓨로 마이신 내성에 기초하여 선택 가능하게 이들을 렌더링 PAC 표현; (그림 1, 15). 이 프로토콜에 기반 iPSCs를 AAVS1-GFP iPSCs가 TALENs와 iPSCs를 형질 감염의 과정과 AAVS1 안전 항구의 궤적에 4.2kb DNA 단편을 통합 할 수있는 9.8 킬로바이트 기증자를 포함, 최근 종이 (14)에보고 생성 선택하는 절차의 자세한 사항 퓨로 마이신 저항 및 클론 확장을위한 따기 식민지. 본원에 설명 된 기술들은 많은 유전체 공학 실험에 적용 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10 ml</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>A1517001</td><td>Store basal medium at 4 &amp;deg;C. Store supplement at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Store at room temp. Once dissolved in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma</td><td>S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC-Treated Culture Dish</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>DR4 MEF 2M IRR - Academic</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6204G</td><td>Store in liquid Nitrogen.</td></tr><tr><td>DMEM, high glucose, pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11995-040</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Defined Fetal Bovine Serum, US Origin</td><td>HyClone</td><td>SH30070.03</td><td>Store at -20 &amp;deg;C. Thaw at 4 &amp;deg;C overnight and aliquot. Store aliquots at -20 &amp;deg;C until needed.</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>4D-Nucleofector Core unit&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>AAF-1001B</td><td>part of the electroporation system</td></tr><tr><td>4D-Nucleofector X unit&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>AAF-1001X</td><td>part of the electroporation system</td></tr><tr><td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td>Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td>Store at -20 &amp;deg;C. Thaw overnight at 4&amp;deg;C and warm an aliquot in a 37 &amp;deg;C water bath before use.</td></tr><tr><td>NutriStem XF/FF Culture Medium</td><td>Stemgent</td><td>01-0005</td><td>Store at -20 &amp;deg;C. Thaw overnight at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1)</td><td>Addgene</td><td>52637 and 52638</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor</td><td>Addgene</td><td>22212</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin Dihydrochloride</td><td>Life Technologies</td><td>A11138-03</td><td>Store at -20 &amp;deg;C. Prepare working aliquots of 1 mg/ml in ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.</td></tr><tr><td>Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120 V 60 Hz</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-004-521</td><td></td></tr><tr><td>TX-750 4 &amp;times; 750 ml Swinging Bucket Rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>75003607</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr></tbody></table>

transfection, selection, and colony-picking of human induced pluripotent stem cells talen-targeted with a gfp gene into the aavs1 safe harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.

프로토콜의 시각화는 iPSCs가 NutriStem에 대한 하나 E8 녹색 또는 청색에 의해 강조 다른 배지에서 배양있는 기간으로, 그림 2에서 제공됩니다. 그것은 단지 고품질 iPSCs를 형질 것이 중요하다; 일상적인 유지 보수 전반에 걸쳐 배양 접시를 검토하고 IPSC 문화는 조약돌 모양의 형태를 베어링 주로 별개의 식민지 (그림 3A)가 들어 있는지 확인; 분화 세포는 배양의 10 % 이상을 점?...

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Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

형질, 선택 및 인간 유도 만능 줄기 세포의 콜로니 따기는 AAVS1 세이프 하버 (Safe Harbor)에 GFP 유전자 TALEN는 타겟팅

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

transfection-selection-colony-picking-human-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

19.6K 조회수.  National Institutes of Health. TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

비디오: Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are restricted to two specific neurogenic niches: the subgranular zone of the dentate gyrus in the hippocampus and the ventricular-subventricular zone (V-SVZ; also called subependymal zone or SEZ) in the walls of the lateral ventricles. The development of in vivo gene transfer strategies for adult stem cell populations (i.e. those of the mammalian brain) resulting in long-term expression of desired transgenes in the stem cells and their derived progeny is a crucial tool in current biomedical and biotechnological research. Here, a direct in vivo method is presented for the stable genetic modification of adult mouse V-SVZ cells that takes advantage of the cell cycle-independent infection by LVs and the highly specialized cytoarchitecture of the V-SVZ niche. Specifically, the current protocol involves the injection of empty LVs (control) or LVs encoding specific transgene expression cassettes into either the V-SVZ itself, for the in vivo targeting of all types of cells in the niche, or into the lateral ventricle lumen, for the targeting of ependymal cells only. Expression cassettes are then integrated into the genome of the transduced cells and fluorescent proteins, also encoded by the LVs, allow the detection of the transduced cells for the analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects in the labeled cells and their progeny.

Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.

신경의 분석을위한 성인 마우스 V-SVZ에서 세포의 안정적이고 효율적인 유전자 변형 줄기 세포 자율 및 비 자치 효과

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

연구

발생학

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human development and investigate the pathophysiology of disease. By employing site-specific nucleases (SSNs) for genome editing, the rapid derivation of new hPSC lines harboring specific genetic alterations in an otherwise isogenic setting becomes possible. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 are the most commonly used SSNs. All of these nucleases function by introducing a double stranded DNA break at a specified site, thereby promoting precise gene editing at a genomic locus. SSN-meditated genome editing exploits two of the cell&#39;s endogenous DNA repair mechanisms, non-homologous end joining (NHEJ) and homology directed repair (HDR), to either introduce insertion/deletion mutations or alter the genome using a homologous repair template at the site of the double stranded break. Electroporation of hPSCs is an efficient means of transfecting SSNs and repair templates that incorporate transgenes such as fluorescent reporters and antibiotic resistance cassettes. After electroporation, it is possible to isolate only those hPSCs that incorporated the repair construct by selecting for antibiotic resistance. Mechanically separating hPSC colonies and confirming proper integration at the target site through genotyping allows for the isolation of correctly targeted and genetically homogeneous cell lines. The validity of this protocol is demonstrated here by using all three SSN platforms to incorporate EGFP and a puromycin resistance construct into the AAVS1 safe harbor locus in human pluripotent&#160;stem cells.

Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.

게놈 편집 인간 다 능성 줄기 세포의 설립 : 분리에 타겟팅에서

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing in mammalian cells. Here we describe detailed procedures to seamlessly genome edit the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus as an example in human pluripotent stem cells. Combining a piggyBac-based donor plasmid and the CRISPR-Cas9 nickase mutant in a two-step genetic selection, we demonstrate correct and efficient targeting of the HNF4&#945; locus.

Here, we describe a detailed method for seamless gene editing in human pluripotent stem cells using a piggyBac-based donor plasmid and the Cas9 nickase mutant. Two point mutations were introduced into exon 8 of the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus in human embryonic stem cells (hESCs).

원활한 게놈 편집을 사용하여 인간 만능 줄기 세포에 점 돌연변이 도입

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

유전학

Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional properties such as proliferation and differentiation, thereby promoting the development of hematologic malignancies. Efficient and precise genetic manipulation of HSPCs is required to model, characterize, and better understand the functional consequences of recurrent somatic mutations. Mutations can have a deleterious effect on a gene and result in loss-of-function (LOF) or, in stark contrast, may enhance function or even lead to novel characteristics of a particular gene, termed gain-of-function (GOF). In contrast to LOF mutations, GOF mutations almost exclusively occur in a heterozygous fashion. Current genome-editing protocols do not allow for the selective targeting of individual alleles, hampering the ability to model heterozygous GOF mutations. Here, we provide a detailed protocol on how to engineer heterozygous GOF hotspot mutations in human HSPCs by combining CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair and recombinant AAV6 technology for efficient DNA donor template transfer. Importantly, this strategy makes use of a dual fluorescent reporter system to allow for the tracking and purification of successfully heterozygously edited HSPCs. This strategy can be employed to precisely investigate how GOF mutations affect HSPC function and their progression toward hematological malignancies.

Novel strategies to faithfully model somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) are necessary to better study hematopoietic stem cell biology and hematological malignancies. Here, a protocol to model heterozygous gain-of-function mutations in HSPCs by combining the use of CRISPR/Cas9 and dual rAAV donor transduction is described.

인간 조혈 줄기 및 전구 세포에서 발암성 이형접합체 기능 획득 돌연변이 공학

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional ...

암 연구학

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

인간 유도 만능의 줄기 세포를 Transfecting 및 Nucleofecting

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

생물학

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is still time consuming. Comparative studies that use recombinant lines with transgenes integrated into safe harbor loci could benefit from approaches that use site-specific targeted recombinases, like Cre or FLPe, which are more rapid and less prone to off-target effects. Such methods have been described, although they do not significantly outperform gene targeting in most aspects. Using Zinc-finger nucleases, we previously created a master cell line in the AAVS1 locus of hPSCs&#160;that contains a GFP-Hygromycin-tk expressing cassette, flanked by heterotypic FRT sequences. Here, we describe the procedures to perform FLPe recombinase-mediated cassette exchange (RMCE) using this line. The master cell line is transfected with a RMCE donor vector, which contains a promoterless Puromycin resistance, and with FLPe recombinase. Application of both a positive (Puromycin) and negative (FIAU) selection program leads to the selection of RMCE without random integrations. RMCE generates fully characterized pluripotent polyclonal transgenic lines in 15 d&#160;with 100% efficiency. Despite the recently described limitations of the AAVS1 locus, the ease of the system paves the way for hPSC transgenesis in isogenic settings, is necessary for comparative studies, and enables semi-high-throughput genetic screens for gain/loss of function analysis that would otherwise be highly time consuming.

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Here we report a rapid and efficient gene editing method based on RMCE in the AAVS1 locus of human Pluripotent Stem Cells (hPSCs) that improves upon previously described systems. Using this technique, isogenic lines can be rapidly and reliably generated for proper comparative studies, facilitating transgenesis-mediated research with hPSCs.

에서 재조합 효소 중재 카세트 교환에 의해 재조합 인간 다 능성 줄기 세포의 신속하고 효율적인 생성<em&gt; AAVS1</em&gt; 로커스

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

의학

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) in the presence of sodium butyrate 1-3. We used this method to reprogram late passage (&gt;p10) human adult fibroblasts derived from Friedreich's ataxia patient (GM03665, Coriell Repository). The reprogramming approach includes highly efficient transduction protocol using repetitive centrifugation of fibroblasts in the presence of virus-containing media. The reprogrammed hiPSC colonies were identified using live immunostaining for Tra-1-81, a surface marker of pluripotent cells, separated from non-reprogrammed fibroblasts and manually passaged 4,5. These hiPSC were then transferred to Matrigel plates and grown in feeder-free conditions, directly from the reprogramming plate. Starting from the first passage, hiPSC colonies demonstrate characteristic hES-like morphology. Using this protocol more than 70% of selected colonies can be successfully expanded and established into cell lines. The established hiPSC lines displayed characteristic pluripotency markers including surface markers TRA-1-60 and SSEA-4, as well as nuclear markers Oct3/4, Sox2 and Nanog. 
The protocol presented here has been established and tested using adult fibroblasts obtained from Friedreich's ataxia patients and control individuals 6, human newborn fibroblasts, as well as human keratinocytes.

We present a protocol for efficient reprogramming of human somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) and identification of correctly reprogrammed hiPSC by live staining with Tra-1-81 antibody.

인간 유도 Pluripotent 줄기 세포의 선택 및 분리 식민지는 성인 섬유아 세포에서 다시 프로그램

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific genes. Multiple means of assessing non-coding DNA and various chromatin states have proven useful in predicting the presence of enhancer sequences in the genome, but validating the activity of these sequences and finding the organs and developmental stages they are active in is a labor-intensive process. Recent advances in adeno-associated virus (AAV) vectors have enabled the widespread delivery of transgenes to mouse tissues, enabling in vivo enhancer testing without necessitating a transgenic animal. This protocol shows how a reporter construct that expresses EGFP under the control of a minimal promoter, which does not drive significant expression on its own, can be used to study the activity patterns of candidate enhancer sequences in the mouse brain. An AAV-packaged reporter construct is delivered to the mouse brain and incubated for 1-4 weeks, after which the animal is sacrificed, and brain sections are observed under a microscope. EGFP appears in cells in which the tested enhancer is sufficient to initiate gene expression, pinpointing the location and developmental stage in which the enhancer is active in the brain. Standard cloning methods, low-cost AAV packaging, and expanding AAV serotypes and methods for in vivo delivery and standard imaging readout make this an accessible approach for the study of how gene expression is regulated in the brain.

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

This protocol describes a novel rAAV-based transient enhancer-reporter assay. This assay can be used to induce enhancer-driven expression in vivo in the mouse brain.

마우스 뇌 에서 생체 내 인핸서 기반 발현 구조체의 AAV 배포

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific ...

신경과학

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic genes remaining in actively transcribed regions of the genome, limit their potential for use in human therapeutic applications1. Additionally, non-human antigens derived from stem cell reprogramming or differentiation into therapeutically relevant derivatives preclude these hiPSCs from being used in a human clinical context2. In this video, we present a procedure for reprogramming and analyzing factor-free hiPSCs free of exogenous transgenes. These hiPSCs then can be analyzed for gene expression abnormalities in the specific intron containing the lentivirus. This analysis may be conducted using sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR), which has an advantage over less sensitive techniques previously used to detect gene expression differences3. Full conversion into clinical-grade good manufacturing practice (GMP) conditions, allows human clinical relevance. Our protocol offers another methodology&#8212;provided that current safe-harbor criteria will expand and include factor-free characterized hiPSC-based derivatives for human therapeutic applications&#8212;for deriving GMP-grade hiPSCs, which should eliminate any immunogenicity risk due to non-human antigens. This protocol is broadly applicable to lentiviral reprogrammed cells of any type and provides a reproducible method for converting reprogrammed cells into GMP-grade conditions.

We describe a protocol for deriving lentiviral-based reprogrammed and characterized factor-free human induced pluripotent stem cells and conversion into putative clinical-grade conditions.

의 유도 및 특성 형질 전환 유전자가없는 인간 유도 다 능성 정의 임상 수준의 조건으로 세포주 및 변환 줄기

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...

세포 배양에서 Crude Vector Production 및 효율적인 DNA Delivery

Transgene Expression in Cultured Cells Using Unpurified Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors

Recombinant adeno-associated viral vectors (rAAV) can achieve potent and durable transgene expression without integration in a broad range of tissue types, making them a popular choice for gene delivery in animal models and in clinical settings. In addition to therapeutic applications, rAAVs are a useful laboratory tool for delivering transgenes tailored to the researcher&#39;s experimental needs and scientific goals in cultured cells. Some examples include exogenous reporter genes, overexpression cassettes, RNA interference, and CRISPR-based tools, including those for genome-wide screens. rAAV transductions are less harmful to cells than electroporation or chemical transfection and do not require any special equipment or expensive reagents to produce. Crude lysates or conditioned media containing rAAVs can be added directly to cultured cells without further purification to transduce many cell types&#8212;an underappreciated feature of rAAVs. Here, we provide protocols for basic transgene cassette cloning and demonstrate how to produce and apply crude rAAV preparations to cultured cells. As proof of principle, we demonstrate the transduction of three cell types that have not yet been reported in rAAV applications: placental cells, myoblasts, and small intestinal organoids. We discuss appropriate uses for crude rAAV preparations, the limitations of rAAVs for gene delivery, and considerations for capsid choice. This protocol outlines a simple, low-cost, and effective method for researchers to achieve productive DNA delivery in cell culture using rAAV without the need for laborious titration and purification steps.

저자 스포트라이트: 세포 배양 연구에서 정제되지 않은 재조합 AAV의 잠재력 공개 

Recombinant adeno-associated virus (rAAV) is widely used for clinical and preclinical gene delivery. An underappreciated use for rAAVs is the robust transduction of cultured cells without the need for purification. For researchers new to rAAV, we provide a protocol for transgene cassette cloning, crude vector production, and cell culture transduction.

Unpurified Recombinant Adeno-associated Viral Vectors를 사용한 배양 세포에서의 전이유전자 발현

Recombinant adeno-associated viral vectors (rAAV) can achieve potent and durable transgene expression without integration in a broad range of tissue ...