This research was supported by the NIH Common Fund and Intramural Research Program of the National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases.

1. Bodrum Membran Matrix hazırlanması ve Plasticware Kaplama <ol><li> Buz üzerine -20 ° dondurulmuş bazal membran matris stok yerleştirin ve 4 ° C&#39;de bir gece eritin. </li><li> Çözündükten sonra, önceden soğutulmuş Eppendorf tüpleri içine taban membran matrisi pipet 2 mg&#39;lik parçalara. Gerekli olana kadar -20 ° C&#39;de bu saklayın. </li><li> , Bazal membran matris kaplı plakaları hazırlamak Eppendorf tüp kaybolana buz son parçası (genellikle 2 ~ içinde saat) kadar buz üzerinde bir kısım Çözülme için. </li><li> Çözündükten sonra, bazal membran matris kaplama çözeltisi yapmak için soğuk (4 ° C), DMEM / F12 içinde 12 ml kadar bazal membran matrisi ekleyin. </li><li> Uygun bir kültür teknesine bazal membran matris solüsyonu ekleyin. 6-çukurlu plaka için, oyuk başına 1 ml akıtın. Bazal membran matris çözümü tamamen her iyi kapsar emin olmak için plakayı girdap. </li><li> Parafilm bazal membran matris kaplı plaka / çanak mühür ve roo inkübekullanımdan önce 1 saat m sıcaklığı. Seçenek olarak ise, mağaza bazal membran matris kaplı plakalar / 4 ° C&#39;de yemekleri ve kaplamanın 2 hafta içinde kullanın. NOT: kurumasını önlemek için bazal membran matris kaplı plaka / çanak ekstra DMEM / F12 ekleyin. 4 ° C &#39;de depolanmıştır bazal membran matris kaplı plaka / çanak kullanmadan önce, bir biyolojik güvenlik kabini içine koyun ve en az 30 dakika boyunca oda sıcaklığına gelmesine izin. </li><li> Tam ortam ve hücreler ilave edilmeden önce aspire taban membran matrisi. </li></ol> E8 ortamının 2. Hazırlık <ol><li> 4 ° C&#39;de gece boyunca E8 takviyesi çözülme E8 kültür ortamı hazırlayın. </li><li> 500 ml stoktan E8 bazal ortam 10 ml çıkarın ve atın. </li><li> Doğrudan E8 bazal ortam 490 ml E8 takviyesi tüm 10 ml flakon Pipet. Tekrarlanan sıcaklık dalgalanmaları comple içinde bFGF düşürebilir gibi, bir 37 ° C su banyosunda değil sıcak komple E8 orta yapınte E8 ortamı. </li><li> Eki ek 2 hafta içinde tam E8 ortamı kullanın. </li></ol> IPSCs 3. Çözülme <ol><li> Kuru buz üzerinde, sıvı azotun ve yerden dondurulmuş iPSCs bir şişe çıkarın. </li><li> Hızla bir 37 ° C su banyosunda şişeyi çözülme; buz kalıntıları sadece küçük bir parçası kadar su banyosunda şişeyi girdap. </li><li> Biyolojik güvenlik kabini% 70 etanol ve transferi ile şişeyi püskürtün. </li><li> Doğrudan flakon oda sıcaklığı E8 orta damla damla 1 ml ekleyin. </li><li> 2 ml&#39;lik bir pipet kullanılarak, 15 ml konik bir tüp içinde E8 ortamın 9 ml hücre süspansiyonu, damla damla aktarın. Hücreler ve orta hızlı iyice karıştırın sağlamak için sık sık tüp girdap. </li><li> 5 dakika süreyle 200 x g&#39;de hücreleri santrifüjleyin. </li><li> Süpernatanı havalandırın, ve 10 uM Y-27632 ile takviye E8 uygun hacimde bir hücre pelletini. </li><li> Bodrum uygun sayıda hücrelerin ekleyin membrangecede 37 ° C,% 5 CO 2 inkübatör e matris kaplı kuyuları ve yer. Bu çözmeden sonra hızlı bir iyileşme sağlamak için, 6 gözlü bir plakanın her bir kuyucuğu başına en azından 0.2 x 10 6 IPSC plaka tavsiye edilir. </li></ol> 4. Bakım ve iPSCs rutin Pasajlanması <ol><li> Günlük E8 orta yenileyin. </li><li> Bir inverted mikroskop ile morfolojisi ve hücre konfluent izleyin. yüksek kaliteli iPSCs farklı sınırları düz koloniler halinde büyür; Bireysel koloniler &quot;Arnavut kaldırımı gibi&quot; bir görünüm sahip. </li><li> Passage iPSCs hücreler ~ 70% confluency ulaştığınızda. </li><li> 0.9 g NaCI ve 500 ml DPBS 500 ul 0.5 M EDTA ilave ederek bir EDTA pasajı çözelti hazırlayın. Sterilize etmek NaCl ve vakum filtresi çözmek için iyice karıştırın. Pasajlayarak önce 37 ° C&#39;lik bir su banyosu içerisinde pasajı çözeltisi bir kısım ısıtın. </li><li> Geçit için, aspirat kültür ortamı geçirdi ve sıcak pas eşit hacimde ile bir kez hücreleri yıkayınçözelti saging. Kaplamak için aspire ve pipet yeterli EDTA pasajı çözeltisi hücreleri (6-çukurlu plaka içinde çukur başına 1 mi). </li><li> Ters döndürülmüş bir mikroskop altında hücre yerleştirin ve iPSC kolonilerin. koloniler ve yükseltilmiş sınırları içinde delik görünümü 2 ila 5 dakika içinde belirgin hale gelmelidir. </li><li> Dikkatle EDTA Pasajlanması çözüm aspire. </li><li> Şirketinden de geçişli her içine yüksek basınç altında (6 çukurlu bir plaka kullanılarak varsa) 10 ml&#39;lik bir pipet kullanılarak, E8 ortamının 4 ml dağıtmak. </li><li> IPSC kümeleri toplamak, ve 1 ila bölme oranına bağlı olarak, deliklerin bir uygun sayıda bölünmüş: 01:12 ila 8. Aşırı pipet, hücre kümeleri parçalanma zayıf canlılığı neden olur vermeyin. </li><li> Bir inkübatör plaka koyun, ve hücreleri dağıtmak için geri ve ileri-ve yan-yan birkaç kez plaka sallayın. </li></ol> Tansfection için MEF&#39;ler ve iPSCs 5. N- <ol><li> Transfectio 48 saat önceN, geçit iPSCs ~ 1 için: bir bazal membran matris ile kaplanmış 6-çukurlu plaka dört veya daha fazla kuyu içine 6 iki gün dolayısıyla% 70 konfluent olacak şekilde. </li><li> Bir sonraki gün,% 10 FBS ve 1 x MEM-NEAA ile takviye edilmiş DMEM (yüksek glukoz) &#39;den oluşan MEF ortam içine DR4 MEFS eritin. </li><li> • 2 x 10 4 hücre / cm2 de iki adet 10 cm&#39;lik kaplar içine levhalar DR4 MEFS ve gece boyunca 37 ° C enkübe edilir. </li><li> Transfeksiyondan bir gün, 30 dakika iPSCs üzerinde transfeksiyon gerçekleştirilmeden önce 10 uM Y-27632 ile takviye edilmiş E8 MEF aracını değiştirme. </li><li> İsteğe bağlı: iPSCs transfeksiyondan akış sitometrik analizi, arzu edildiği takdirde, oda sıcaklığında, bir bazal membran matris ile kaplanmış 4 ° C plaka ve yer çıkarın. </li><li> İsteğe bağlı 4 saat, transfeksiyondan önce, 10 uM nihai konsantrasyon-Y-27632 ile ön transfeksiyon iPSC kültür tamamlar. </li></ol> 6. Nazik-hücreli Ayrılma Reaktif Tedavind transfeksiyonu iPSCs bir Elektroporasyon Sistemi kullanılarak <ol><li> 4 ° C ve P3 birincil hücre transfeksiyon solüsyonu çıkarın ve ~ boyunca oda sıcaklığına 30 dk gelmesini sağlar. Kullanımdan önce transfeksiyon çözeltisine, tüm 100 ul ek ekleyin. </li><li> 37 ° C&#39;lik bir su banyosu içinde sıcak nazik-hücre ayrıştırma reaktifi. </li><li> AAVS1 TALENS (PZT-AAVS1-L1 ve PZT-AAVS1-R1), -20 ° C ve AAVS1-CAG-EGFP donör elde edilir. </li><li> Inkübatörden iPSCs çıkarın ve DPBS ile bir kez yıkanır. </li><li> Oyuk başına nazik-hücre ayrıştırma reaktifi 1 ml ilave edilir, ve 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe iPSCs veya hücrelerin% 50&#39;den daha fazla kültür teknesine ayrışmış kadar. </li><li> Yukarı ve kültür kabından kalan hücreleri ayırmak için, ve iPSC öbekler kırmak için bir P1000 pipet kullanarak birkaç kez aşağı hücreleri pipetle. </li><li> Fürth için 10 ml&#39;lik pipet kullanarak her bir kuyunun E8 orta 2 ml ekleyin ve pipet yukarı ve aşağı birkaç kezer tek hücre içine hücre kümeleri parçalara ayırma NOT: hücre kümeleri yeterince ayrıştırılmış değilse Transfeksiyon verimliliği önemli ölçüde azalır. </li><li> 3 dakika boyunca 100 x g&#39;de 15 ml konik bir tüp içinde iPSCs ve santrifüj toplayın. </li><li> E8 ortamının en az bir miktarda aspire yüzer madde ve tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Bir canlı bir boya gibi% 0.4 tripan mavisi uygulanmasından sonra bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın. (&quot;Küme&quot; başına 1-3 hücre) sayım sırasında hücreler yeterince ayrışmış emin olun. </li><li> İki 15 ml konik tüplerin her birine 3 x 10 6 hücre koyun ve 3 dakika boyunca 100 xg&#39;de tekrar aşağı doğru döndürün. NOT: Düşük hız santrifüj hücre stresi azaltır ve elektroporasyon önce iPSCs kolay yeniden asılmasını sağlıyor. </li><li> İnsan embriyonik kök hücre hattı H9 (Program CB-150) hücre tipi özel program elektroporasyon sistemi ayarlayın. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, cel süpernatant aspirel peletler. Bir pelet için, kontrol örneği olarak, sıcak verici 10 ug ekleyin. Diğer pelet 5 mikrogram ile birlikte İK donörün 10 ug, eklediğiniz her deney numune olarak TALEN (PZT-AAVS1-L1 ve PZT-AAVS1-R1). </li><li> P3 birincil hücre transfeksiyon solüsyonundan 100 ul her bir hücre pelletini, bir küvete aktarılır. </li><li> Transfeksiyon gerçekleştirin ve hemen her küvete oda sıcaklığı E8 orta 500 ul ekleyin. </li><li> Adım 5.4 hazırlanan DR4 MEFS içeren bir 10 cm&#39;lik çanak transfekte iPSCs damla damla aktarın. </li><li> İsteğe bağlı: Transfeksiyon verimi analizlerinin nasıl sitometri akışı istendiği takdirde, bir bazal membran matris ile kaplanmış 6-çukurlu plaka içinde bir kuyuya her bir deney birkaç damla ekleyin. </li><li> Tekrar her iki örnekleri bitirmek için 6,15-6,17 adımları. Ertesi gün, DPBS hücreleri iki kez yıkayın ve E8 daha besleyici daha iyi iPSC kültürünü desteklemek için görünür NutriStem, kültür ortamı geçmek. </li><li> Tr48 saat sonrası transfeksiyon 72 en ansient EGFP ifade zirveleri; arzu edilen transfeksiyon etkinliğini değerlendirmek. </li></ol> Hedefli iPSCs 7. puromisin seçimine <ol><li> IPSCs% 70 confluency ulaştığında puromisin Seçimi transfeksiyondan sonra 72 saat başlayın. </li><li> NCRM5 iPSCs için NutriStem kültür ortamında seyreltilmiş 0.5 ug / ml puromisin (1/2 tam doz) ile puromisin seçimi başlar. Optimal puromisin konsantrasyonu 0.25 bazı iPSC hatları için 1 ug / MLL bağlı olarak değişebilir. </li><li> Günlük olarak orta ferahlatıcı 3 gün NutriStem ± 0.5 ug / ml puromisin Kültür iPSCs. </li><li> 3 gün sonra, 1 ug / ml puromisin konsantrasyonunun arttırılması için. </li><li> / Ml puromısin seçimi 1 ug altında Kültür iPSCs başka bir 7 ila 8 gün için, ya kadar farklı koloniler koloni toplama için yeterince büyük görünür. </li></ol> 8. Koloni Toplama ve Hedeflenen iPSCs Yaygınlaştırılması <ol><li> Kullanım bazal membrankaplamak için matris, her oyuğa (12 mi DMEM / F12 içinde seyreltilmiş, 2 mg bazal membran matris) bazal membran matris kaplama solüsyonu 50 ul dağıtma ile 96 oyuklu plaka. 4 ° C&#39;de bir gece boyunca, kullanımdan önce plaka saklayın. </li><li> Bazal membran matris kaplı plaka, oda sıcaklığına gelmeye bırakıldıktan sonra, bazal membran matrisi aspire ve 10 uM Y-27632, her bir oyuğa ile takviye edilmiş 100 ul E8 dağıtın. </li><li> Bir biyolojik güvenlik kabini içine ters bir mikroskop yerleştirin ve sterilize etmek için% 70 EtOH ile hafifçe sprey. </li><li> Ucunda küçük bir &quot;kanca&quot; olan ideal bir koloni toplama aracı edinmek için Bunsen beki üzerinde cam Pasteur pipet çekin. % 70 EtOH ile sterilize ve kurumaya kaputun yerleştirmek. </li><li> Inkübatör hedeflenen iPSC kolonileri içeren çanak çıkarın ve mikroskop altında kaputun içine yerleştirin. </li><li> Koloni toplama aracı ile koloni sınır etrafında bir daire izleme tarafından iPSCs seçin.</li><li> Hafifçe kazıyın ve plaka yüzeyinden iPSC kolonisi kaldırmak için koloni-toplama aracı &quot;kanca&quot; kullanın. Daha büyük koloniler için, koloni tekrar kaplamadan sonra hücre büyümesini kolaylaştıracak çeyrek koloni toplama aracı ile bir X çizim. </li><li> Hücre kümeleri müstakil ve serbestçe yüzen sonra, iPSCs toplamak için ~ 30 ul set P200 pipet kullanın. Doğrudan 96 oyuklu bir plakaya Levha hücreleri. </li><li> İsteğe bağlı: daha sonra 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca sindirimi 50 ul nazik-hücre ayrışma reaktifmi, bir Eppendorf tüpüne iPSCs toplamak için ~ 5 ul ayarlanmış bir p20 pipet kullanın. Sindirimden sonra, yumuşak-hücre ayrıştırma reaktifi seyreltilmesi ve 5 dakika için standart bir masa üstü mikrosantrifüj 200 xg&#39;de hücreleri yavaşlamalarını Eppendorf tüpüne, 500 ul E8 orta ekleyin. Daha sonra sıvı ortamı en iyi aspire ve • tekrar süspansiyon ve 96 oyuklu bir plakaya hücreleri aktarmak için 30 ul bırakın. NOT: Buyaklaşım hücre küme ve aldı koloninin hızlı genişleme ayrışma kolaylaştıracaktır. </li><li> IPSC koloniler yeterli sayıda toplanmıştır kadar koloni toplama devam (kabaca deney başına 20-30 kolonileri tavsiye edilir). </li><li> Koloni toplama sonra, gece boyunca bir kuluçka makinesi içinde 96 oyuklu plaka yerleştirilir. Tam E8 orta Ertesi gün, ve kültür 70 ~ kadar% konfluent ile yenileyin. </li><li> Içine 96 oyuklu geçişin hücreleri, 24-çukurlu, daha sonra bir 6-çukurlu, adım 4,5-4,10 hazırlanır. NOT: 6-çukurlu plaka daha küçük kuyu kullanıldığında EDTA çözeltisi ve E8 ortamının hacmi orantısal olarak azaltılmalıdır. </li><li> Rastgele eklenen vektörlerin 16 hedeflenmiş kaset entegrasyonu ve yokluğunu onaylamak için kavşak PCR ve Southern blot analizi ile hedefleme başarısını değerlendirmek. </li></ol>

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Hentze, H., Graichen, R., Colman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+and+the+safety+of+embryonic+stem+cell-derived+grafts.">Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts.</a> Trends Biotechnol. 25 (1), 24-32 (2007).</li><li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust,+persistent+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+is+achieved+with+AAVS1-targeted+integration.">Robust, persistent transgene expression in human embryonic stem cells is achieved with AAVS1-targeted integration.</a> Stem Cells. 26 (2), 496-504 (2008).</li><li>Lombardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+integration+and+tailoring+of+cassette+design+for+sustainable+gene+transfer.">Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer.</a> Nat Methods. 8 (10), 861-869 (2011).</li><li>Ogata, T., Kozuka, T., Kanda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+insulator+in+AAVS1,+a+preferred+region+for+integration+of+adeno-associated+virus+DNA.">Identification of an insulator in AAVS1, a preferred region for integration of adeno-associated virus DNA.</a> J Virol. 77 (16), 9000-9007 (2003).</li><li>Zwaka, T. P., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+in+human+embryonic+stem+cells.">Homologous recombination in human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).</li><li>Urbach, A., Schuldiner, M., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+for+Lesch-Nyhan+disease+by+gene+targeting+in+human+embryonic+stem+cells.">Modeling for Lesch-Nyhan disease by gene targeting in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 22 (4), 635-641 (2004).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+expressed+and+silent+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+using+zinc-finger+nucleases.">Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases.</a> Nature biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).</li><li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+of+a+disease-related+gene+in+human+induced+pluripotent+stem+and+embryonic+stem+cells.">Gene targeting of a disease-related gene in human induced pluripotent stem and embryonic stem cells.</a> Cell stem cell. 5 (1), 97-110 (2009).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases.">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nature. 29 (8), 731-734 (2011).</li><li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcription+activator-like+effector+toolbox+for+genome+engineering.">A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering.</a> Nature protocols. 7 (1), 171-192 (2012).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs.">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell stem cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Enhanced+Green+Fluorescent+Protein+Expression+After+Differentiation+and+Transplantation+of+Reporter+Human.">Stable Enhanced Green Fluorescent Protein Expression After Differentiation and Transplantation of Reporter Human.</a> Induced Pluripotent Stem Cells Generated by AAVS1 Transcription Activator-Like Effector Nucleases. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 821-835 (2014).</li><li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidase-deficient+neutrophils+from+X-linked+chronic+granulomatous+disease+iPS+cells:+functional+correction+by+zinc+finger+nuclease-mediated+safe+harbor+targeting.">Oxidase-deficient neutrophils from X-linked chronic granulomatous disease iPS cells: functional correction by zinc finger nuclease-mediated safe harbor targeting.</a> Blood. 117 (21), 5561-5572 (2011).</li><li>Luo, Y., Rao, M., Zou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+GFP+Reporter+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Using+AAVS1+Safe+Harbor+Transcription+Activator-Like+Effector+Nuclease.">Generation of GFP Reporter Human Induced Pluripotent Stem Cells Using AAVS1 Safe Harbor Transcription Activator-Like Effector Nuclease.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 29, 5A.7.1-5A.7.18 (2014).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Beers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passaging+and+colony+expansion+of+human+pluripotent+stem+cells+by+enzyme-free+dissociation+in+chemically+defined+culture+conditions.">Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions.</a> Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

(1) verimli transfeksiyonla iPSCs içine TALEN ve donör plazmitlerini teslim;: AAVS1 güvenli liman başarılı nesil için en kritik adımlar insan iPSCs vardır hedefli (2) transfeksiyondan sonra transfeksiyon ve kaplama yoğunluğu önce tek hücre içine iPSCs ayrılmasını optimize; (3) doz ve iPSC hattının büyüme dayalı ilaç seçimi süresi optimize; (4) dikkatli diseksiyon ve hedeflenen koloniler toplama ve / kuyu yeni plaka transfer. Hockemeyer en kağıt 10 kullanılan benzer yöntemlerle kar...

embriyonik kök hücre benzeri uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine (iPSCs), insan somatik hücreleri yeniden programlamak için yeteneği ilk olarak Takahashi ve arkadaşları tarafından keşfedildi. 2007&#39;de 1. retrovirüsler dört transkripsiyon faktörlerini ifade ile transdük İnsan dermal fibroblastlar (so-dublaj Yamanaka Oct3 faktörleri / 4, Sox2, c-Myc ve Klf4) morfoloji, çoğalması, gen ekspresyonu ve epigenetik durumuna göre, insan embriyonik kök hücreler (HESC) büyük ölçüde benzer olduğu gösterilmiştir; önemlisi, iPSCs da, tüm üç germ 1 hücrelerine ayrım yapabilmektedir. iPSCs çoğalma potansiyeli ve farklılaşma kapasitesi onlara çok cazip araçlar yapar; Belirli hastalıklara yakalanmış hastalardan alınan hücrelerin yeniden programlanması, iPSCs, in vitro bir hastalık modeli olarak ve potansiyel terapötik maddeler olarak hem de kullanılabilir. İkinci amaçla, çeşitli konularda iPSCs tam potansiyeline önce ele alınmalıdırKlinik bir ortamda gerçekleştirilebilir; In vitro kültürlenmiş HESC ve iPSCs, yeniden programlama ve hücre bakım sırasında ksenojenik türevlerinin kullanımına tümörojenik potansiyeli ve in vivo olarak nakledilen hücrelerin izlemek için olan ihtiyaç en Hentze et tarafından yapılmıştır pluripotent kök hücrelerin klinik uygulama (tüm önemli engeller vardır. 2). Farklılaşmış hücreler transplantasyon sonrası izleme ihtiyacı için ideal bir çözüm ne olursa olsun uygulama susturulması ve renklilik direnen bir görsel tespit işaretleyici içerecektir. Eksojen DNA güvenli liman loci içine sokulduğunda entegre transgenlerin sağlam ve kalıcı sentezleme en kolayca elde edilebilir; yani, bir entegre vektör yeterli transkripsiyonunu sağlayacak genomik siteleri komşu genlerin 3 ifade düzensizlikler hafifletici aynı zamanda da. Çok iyi keşfedildiğinden beri karakterize edilmiştir Böyle bir site adeno-ilişkili virüs, Integr olanprotein fosfataz 1 düzenleyici alt birimi 12C (PPP1R12C) geninin ilk intronu içinde tirme Alanı 1 (AAVS1). Bu odağı sürekli ve genişletilmiş zaman içinde entegre transgenlerin sağlam ifade kültürü ve in vitro farklılaşma 3, aynı zamanda transkripsiyonel pertürbasyon 4 genlerin çevreleyen korumak için izin veren değil, sadece gösterilmiştir; Her iki özellik nedeniyle AAVS1 sitesini 5 yan endojen kromatin izolatör elemanlarının varlığı olduğu düşünülmektedir. Sadece son on yılda genom mühendislik araçları gelişmeler büyük ölçüde herhangi bir hücre tipinde genetik manipülasyonlar elde edilebildiği kolaylığı ve verimliliği kolaylaştırmıştır. Erken başarılı deneyler EKH 6,7 hedefleme geni elde etmek için bir tanıttı donörü ile endojen homolog rekombinasyon (HR) olarak son derece düşük seviyelerde dayanıyordu ederken, çinko parmak nükleazlardır (ZFNs), signi ki gibi site-spesifik nükleazlara, kullanımıficantly, bu gibi deneylerin 8,9 verimliliğini arttırdı büyük bir çift-iplikçikli DNA kırılmasının nesil ile homolog rekombinasyonu teşvik eder. Her iki transkripsiyon aktivatörü gibi etkileyicilerin bitki patojeni xanthomanas cinslerin (Tales) ve prokaryotik kümelenmiş düzenli interspaced kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) verimli site-spesifik tasarımcı nükleazlara içine / Cas9 sistemi yeniden amaç pluripotent kök hücreleri hedef geni yaptı erişilebilir ve Uygulanabilir metodoloji 10-13. Yeni bir kağıt TACE&#39;nin nükleazlar (TALENS) 14 kullanılarak insan iPSCs olarak AAVS1 güvenli liman lokusuna yeşil flüoresan raportör kaseti kararlı entegrasyonu için etkili bir yöntem açıklamıştır. Bunlar hedeflenen iPSCs böyle bir programı için güçlü kanıtlar sunan, hatta miyokard infarktüsü (MI) bir fare modeli kardiyomiyositlerinin ve transplantasyon yönelik farklılaşma sonra floresan devamstabil floresan pluripotent kök hücreler 14. Hedeflenen koloniler elde etmek için, bir gen trap yöntemi bir ekleme-alıcı (SA), 2A kendi kapanan peptid dizisi, endojen PPP1R12C promoterinin kontrolü altında puromisin, N-asetil-transferaz (PAC) geni yerleştirir, burada kullanıldı; Böylece, AAVS1 lokustaki DNA donör dahil yalnızca iPSCs puromycin direnci dayalı seçilebilir onları render, PAC ifade; (Şekil 1, 15). Bu protokole göre iPSCs, AAVS1 GFP iPSCs TALENS ile iPSCs transfekte süreci ve AAVS1 güvenli liman lokusunun bir 4.2kb DNA fragmanı entegre etmek için bir 9.8 kb verici de dahil olmak üzere, son kağıt 14 bildirilmiştir üreten seçilmesi işlemlerini detayları puromisin-dirençli ve klonal genişleme için çekme kolonileri. Burada tarif edilen teknikler bir çok genom mühendisliği deneylere uygulanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1437">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:588px;">NAME OF MATERIAL/EQUIPMENT</td>
			<td style="width:123px;">COMPANY</td>
			<td style="width:123px;">CATALOG #</td>
			<td style="width:603px;">COMMENTS/DESCRIPTION</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Essential 8 Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>Store basal medium at 4&#176;C. Store supplement at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DR4 MEF 2M IRR - Academic</td>
			<td>GlobalStem</td>
			<td>GSC-6204G</td>
			<td>Store in liquid Nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-040</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Defined Fetal Bovine Serum, US Origin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Thaw at 4&#176;C overnight and aliquot. Store aliquots at -20&#176;C until needed.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4D-Nucleofector Core unit&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1001B</td>
			<td>part of the electroporation system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4D-Nucleofector X unit&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1001X</td>
			<td>part of the electroporation system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-3024</td>
			<td>Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Thaw overnight at 4&#176;C and warm an aliquot in a 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NutriStem XF/FF Culture Medium</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>01-0005</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Thaw overnight at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52637 and 52638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>22212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Prepare working aliquots of 1 mg/mL in ddH2O.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120V 60Hz</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-004-521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TX-750 4 &#215; 750mL Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75003607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transfection, selection, and colony-picking of human induced pluripotent stem cells talen-targeted with a gfp gene into the aavs1 safe harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.

Protokolün bir görselleştirme iPSCs NutriStem için ya E8, yeşil veya mavi tarafından vurgulanan farklı bir ortam içinde kültürlenir dönemlerin, Şekil 2&#39;de verilmiştir. Sadece yüksek kaliteli iPSCs transfekte etmek önemlidir; Rutin bakım boyunca kültür yemekleri incelemek ve iPSC kültürleri bir Arnavut kaldırımı gibi morfoloji taşıyan başta farklı koloniler (Şekil 3A) içerdiğini doğrulayın; farklılaşmış hücre kültürünün% 10&#39;dan fazla işga...

Watch this Scientific Journal Video about Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor at JoVE.com

Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

Transfeksiyon, Seçim ve İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Colony-toplama AAVS1 Safe Harbor içine GFP geninin ile TALEN-hedefli

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

transfection-selection-colony-picking-human-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

19.2K Görüntüleme.  National Institutes of Health. TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.