This research was supported by the NIH Common Fund and Intramural Research Program of the National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases.

1. Vorbereitung der Basalmembranmatrix und Beschichtung von Kunststoffartikel <ol><li> Das tiefgefrorene Basalmembranmatrix Lager von -20 ° C auf Eis aufgetaut und über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Nach dem Auftauen Pipette 2 mg Aliquots von Basalmembranmatrix in vorgekühlte Eppendorf-Röhrchen. Bewahren Sie diese bei -20 ° C, bis sie benötigt. </li><li> Um Basalmembranmatrix beschichteten Platten vorbereiten, tauen ein Aliquot auf Eis bis zum letzten Stück Eis in den Eppendorf-Röhrchen ausgeblendet wird (in der Regel innerhalb von ca. 2 h). </li><li> Nach dem Auftauen hinzuzufügen Basalmembranmatrix bis 12 ml kaltem (4 ° C) DMEM / F12, um Basalmembranmatrix Beschichtungslösung herzustellen. </li><li> Hinzufügen Basalmembranmatrix Lösung des geeigneten Kulturgefäß. Für eine Platte mit 6 Vertiefungen, zu verzichten 1 ml pro Vertiefung. Schwenken Sie die Platte, um sicherzustellen, die Basalmembran-Matrix-Lösung vollständig bedeckt jede Vertiefung. </li><li> Parafilm verschließen Basalmembranmatrix beschichteten Platte / Schale, und Inkubation bei room Temperatur 1 Stunde vor der Verwendung. Alternativ Shop Basalmembranmatrix beschichteten Platten / Geschirr bei 4 ° C lagern und innerhalb von 2 Wochen nach Beschichtung. HINWEIS: Fügen Sie Zusatz DMEM / F12 mit dem Basalmembranmatrix beschichteten Platte / Schale um ein Austrocknen zu verhindern. Vor der Verwendung 4 ° C gelagert Basalmembranmatrix beschichteten Platte / Schale, legen Sie sie in einem biologischen Sicherheitsschrank und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur für mindestens 30 Minuten zu kommen. </li><li> Aspirat Basalmembranmatrix vollständig vor der Zugabe von Medium und Zellen. </li></ol> 2. Herstellung von E8 Medium <ol><li> Bereiten E8 Kulturmedium durch Auftauen E8 Ergänzung über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Entfernen 10 ml E8 Grundmedium aus der 500 ml Lager und entsorgen. </li><li> Pipettieren Sie die gesamte 10 ml Fläschchen mit E8 Ergänzung direkt in 490 ml E8 Grundmedium. Nicht warmen komplette E8 Medium in einem 37 ° C Wasserbad, als wiederholte Temperaturschwankungen können die bFGF im comple abbauente E8 Medium. </li><li> Verwenden Sie vollständige E8 Medium innerhalb von 2 Wochen nach der Zugabe der Ergänzung. </li></ol> 3. Auftauen von iPS-Zellen <ol><li> Entfernen Sie ein Fläschchen mit gefrorenen iPS-Zellen aus flüssigem Stickstoff und auf Trockeneis. </li><li> Schnell auftauen das Fläschchen in einem 37 ° C Wasserbad; Schwenken Sie die Durchstechflasche in das Wasserbad, bis nur noch ein winziges Fragment des Eises bleibt. </li><li> Sprühen Sie die Flasche mit 70% Ethanol und Transfer zu einem biologischen Sicherheitsschrank. </li><li> 1 ml Raumtemperatur E8 Medium tropfenweise direkt in das Fläschchen. </li><li> Mit einem 2 ml Pipette die Zellsuspension unter Rühren in 9 ml E8 Medium in einem 15 ml konischen Röhrchen. Schwenken Sie den Schlauch häufig, um sicherzustellen, dass die Zellen und das Medium gut mischen schnell. </li><li> Zentrifugiere die Zellen bei 200 g für 5 min. </li><li> Saugen Sie den Überstand und Zellpellet in einem geeigneten Volumen von E8 mit 10 &amp; mgr; Y-27632 ergänzt. </li><li> Fügen Sie die Zellen, um eine entsprechende Anzahl von Keller Membrane Matrix-beschichteten Vertiefungen und in ein 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator über Nacht. Es wird empfohlen, mindestens 0,2 x 10 6 iPSC pro Vertiefung einer 6-Well-Platte Platte auf eine schnelle Wiederherstellung nach dem Auftauen zu ermöglichen. </li></ol> 4. Wartung und Routine Passagieren von iPS-Zellen <ol><li> Aktualisieren E8 Medium täglich. </li><li> Überwachen der Morphologie und der Konfluenz der Zellen mit einem inversen Mikroskop. iPS-Zellen von hoher Qualität wachsen in flache Kolonien mit deutlichen Grenzen; Einzelkolonien besitzen eine &quot;pflastersteinartigen&quot; Aussehen. </li><li> Passage die iPS-Zellen, wenn sie zu erreichen ~ 70% Konfluenz. </li><li> Bereiten Sie eine EDTA Passagieren Lösung durch Zugabe von 0,9 g NaCl und 500 ul 0,5 M EDTA zu 500 ml DPBS. Gut mischen, um NaCl und Vakuumfilter lösen, um zu sterilisieren. Erwärmen eines Aliquots der Passagierung Lösung in einem 37 ° C Wasserbad vor Passagierung. </li><li> Um den Durchgang, absaugen verbrauchten Kulturmedium und wäscht die Zellen einmal mit einem gleichen Volumen von warmem passaging Lösung. Aspirate und Pipetten genug EDTA Passagierung Lösung zur Beschichtung der Zellen (1 ml pro Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen). </li><li> Legen Sie die Zellen unter einem inversen Mikroskop und beobachten Sie die iPSC Kolonien. Das Auftreten von Löchern in Kolonien und hob Grenzen sollte deutlich werden innerhalb von 2 bis 5 Minuten. </li><li> Sorgfältig absaugen EDTA Passagieren Lösung. </li><li> Unter Verwendung einer 10 ml Pipette verzichtet 4 ml E8 Medium (bei Verwendung einer Platte mit 6 Vertiefungen) unter hohem Druck direkt in jeder Vertiefung passagiert werden. </li><li> Sammeln Sie die iPSC Klumpen und aufgeteilt in eine entsprechende Anzahl von Vertiefungen in Abhängigkeit von der Split-Verhältnis von 1: 8 bis 1:12. Nicht zu pipettieren, als Aufgliederung der Zellklumpen zu einer schlechten Rentabilität führen. </li><li> Die Platte wird in einem Brutkasten, und Rock die Platte hin und her und von Seite zu Seite mehrmals, um die Zellen zu dispergieren. </li></ol> 5. Herstellung von MEFs und iPS-Zellen für Tansfection <ol><li> 48 Stunden vor der transfection, Passage iPSCs bei ~ 1: 6 in vier oder mehr Vertiefungen einer Basalmembranmatrix beschichteten 6-Well-Platte, so dass sie zu 70% konfluent 2 Tage damit sein. </li><li> Am nächsten Tag auftauen DR4 MEFs in MEF Medium, das aus DMEM (hoher Glukose) mit 10% FBS und 1x MEM-NEAA ergänzt. </li><li> Platte DR4 MEFs in zwei 10-cm-Schalen bei ~ 2 x 10 4 Zellen / cm 2 beimpft und über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Am Tag der Transfektion ändern MEF mittlere bis E8 mit 10 &amp; mgr; Y-27632 ergänzt 30 Minuten vor der Durchführung der Transfektion auf iPS-Zellen. </li><li> Optional: Wenn durchflusszytometrische Analyse von iPS-Zellen nach der Transfektion gewünscht ist, entfernen Sie einen Basalmembranmatrix beschichteten Platte von 4 ° C und bei Raumtemperatur. </li><li> Optional: 4 h vor der Transfektion ergänzen vorge Transfektion iPSC Kultur Y-27632 in einer Endkonzentration von 10 uM. </li></ol> 6. Gentle-Zelle Dissoziation Reagenz Behandlung einnd Transfektion von iPS-Zellen mit einem Elektroporationssystem <ol><li> Entfernen P3 primären Zell Transfektionslösung von 4 ° C und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur kommen ~ 30 min. Fügen Sie die gesamte 100 ul Ergänzung zur Transfektion Lösung vor der Verwendung. </li><li> Warm sanfte-Zelldissoziation Reagenz in einem 37 ° C Wasserbad. </li><li> Erhalten AAVS1 TALENS (PZT-AAVS1-L1 und PZT-AAVS1-R1) und AAVS1-CAG-EGFP Geber von -20 ° C. </li><li> IPS-Zellen zu entfernen aus dem Inkubator und einmal mit DPBS waschen. </li><li> 1 ml der sanfte-Zelldissoziation Reagenz pro Vertiefung und inkubieren iPS-Zellen bei 37 ° C für 5 Minuten oder bis mehr als 50% der Zellen aus dem Kulturgefäß dissoziiert. </li><li> Pipettieren Sie die Zellen nach oben und unten ein paar Mal mit einer p1000-Pipette, um alle verbleibenden Zellen aus dem Kulturgefäß zu distanzieren und zu brechen iPSC Klumpen. </li><li> 2 ml E8 Medium in jede Vertiefung und Pipette auf und ab mehrmals mit einer 10 ml Pipette nach Fürther disaggregieren Zellklumpen in einzelne Zellen HINWEIS: Die Transfektionseffizienz sinkt deutlich, wenn Zellklumpen nicht ausreichend aufgeschlüsselt. </li><li> Sammeln iPSCs in einem 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifugieren bei 100 × g für 3 min. </li><li> Überstand wird abgesaugt und die Zellen in einer minimalen Menge von E8 Medium. </li><li> Zähle die Zellen mit einem Hämozytometer nach der Anwendung eines Vitalfarbstoffes wie 0,4% Trypan blau. Stellen Sie sicher, dass die Zellen ausreichend dissoziiert beim Zählen (1-3 Zellen pro &quot;Klumpen&quot;). </li><li> Verzichtet werden 3 x 10 6 Zellen in jeweils zwei 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren Sie es bei 100 × g für 3 min. HINWEIS: Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit reduziert die Zellstress und ermöglicht eine einfache Resuspension von iPS-Zellen vor der Elektroporation. </li><li> Stellen Sie die Elektroporation System auf den Zelltyp-spezifische Programm für die humane embryonale Stammzelllinie H9 (Programm CB-150). </li><li> Nach dem Zentrifugieren den Überstand aspirieren vom cell Pellets. Um ein Pellet, mit 10 ug des HR Spender als Kontrollprobe. Zu den weiteren Pellet hinzufügen 10 ug des HR Spender, zusammen mit 5 ug jedes TALEN (PZT-AAVS1-L1 und PZT-AAVS1-R1) als Versuchsprobe. </li><li> Resuspendieren jedes Zellpellet in 100 ul P3 primären Zell Transfektionslösung und übertragen in eine Küvette. </li><li> Führen Sie die Transfektion und sofort fügen 500 ul Raumtemperatur E8 Medium zu jeder Küvette. </li><li> Übertragen Sie die transfizierten iPSCs tropfenweise zu einer 10-cm-Schale mit DR4 MEFs in Schritt 5.4 vorbereitet. </li><li> Optional: Fügen Sie einige Tropfen aus jedem Experiment in eine Vertiefung einer Basalmembranmatrix beschichtete Platte mit 6 Vertiefungen, wenn Durchflusszytometrie anaylsis der Transfektionseffizienz gewünscht wird. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte von 6,15 bis 6,17, beide Proben zu beenden. Am folgenden Tag, waschen Sie die Zellen mit DPBS zweimal und schalten Kulturmedium zu NutriStem, die iPSC Kultur auf Feeder unterstützt besser als E8 erscheint. </li><li> TrAnsient EGFP-Expression Peaks bei 48 bis 72 Stunden nach der Transfektion; beurteilen Transfektionseffizienz nach Wunsch. </li></ol> 7. Puromycin Auswahl der Targeted iPSCs <ol><li> Beginnen Puromycin-Selektion 72 Stunden nach der Transfektion, wenn die iPS-Zellen zu erreichen 70% Konfluenz. </li><li> Für NCRM5 iPSCs beginnen Puromycin-Selektion bei 0,5 ug / ml Puromycin (1/2 der vollen Dosis) in NutriStem Kulturmedium verdünnt. Die optimale Puromycin Konzentration von 0,25 bis 1 &amp; mgr; g / mIL einigen iPSC Linien variieren. </li><li> Kultur iPS-Zellen in NutriStem + 0,5 ug / ml Puromycin für 3 Tage, erfrischend das Medium täglich. </li><li> Nach 3 Tagen, erhöhen die Konzentration von Puromycin bis 1 ug / ml. </li><li> Kultur iPS-Zellen unter 1 ug / ml Puromycin-Selektion für weitere 7 bis 8 Tage, oder bis deutliche Kolonien erscheinen groß genug für Kolonie Kommissionierung. </li></ol> 8. Kolonie Kommissionierung und Ausbau von gezielten iPSCs <ol><li> Verwenden BasalmembranMatrix zu beschichten, eine Platte mit 96 Vertiefungen durch Dispensieren 50 ul Basalmembranmatrix Beschichtungslösung (2 mg Basalmembranmatrix in 12 ml DMEM / F12 verdünnt) in jede Vertiefung. Bewahren Sie die Platte bei 4 ° C über Nacht vor dem Gebrauch. </li><li> Nachdem man die Basalmembranmatrix beschichteten Platte auf Raumtemperatur kommen, saugen Sie den Basalmembranmatrix zubereitet, und 100 &amp; mgr; E8 mit 10 &amp; mgr; Y-27632 in jede Vertiefung ergänzt. </li><li> Ein inverses Mikroskop in einem biologischen Sicherheitsschrank und Spray leicht mit 70% EtOH zu sterilisieren. </li><li> Ziehen Sie ein Glas Pasteur Pipette über einem Bunsenbrenner, eine ideale Kolonie-Picking-Tool, das einen kleinen &quot;Haken&quot; an der Spitze zu erhalten. Sterilisieren mit 70% EtOH, und legen Sie in der Haube, um zu trocknen. </li><li> Entfernen Sie die Schale mit gezielten iPSC Kolonien aus dem Inkubator, und legen Sie in die Haube unter dem Mikroskop. </li><li> Wählen iPSCs durch Verfolgung einen Kreis um die Kolonie Grenze der Kolonie-Picking-Tool.</li><li> Verwenden Sie den &quot;Haken&quot; der Kolonie Kommissionierung Werkzeug vorsichtig abkratzen und entfernen Sie die iPSC Kolonie von der Oberfläche der Platte. Bei größeren Kolonien, Zeichnen eines X mit dem Kolonie-Picking-Tool zu Quartal die Kolonie wird das Zellwachstum nach erneuter Beschichtung zu erleichtern. </li><li> Sobald Zellklumpen sind freistehend und frei schwebend, mit einem p200 Pipette eingestellt auf ~ 30 &amp; mgr; l, um die iPS-Zellen zu sammeln. Plattenzellen direkt in die 96-Well-Platte. </li><li> Optional: mit einem p20-Pipette, um ~ 5 &amp; mgr; l eingestellt, um die iPS-Zellen in ein Eppendorf-Röhrchen zu sammeln, dann fügen Sie 50 ul sanft-Zelldissoziation Reagenz für 5 min bei 37 ° C verdaut. Nach der Verdauung, fügen Sie 500 ul E8 Medium in die Eppendorf-Röhrchen, um die sanfte-Zelldissoziation Reagenz verdünnen und Spin-down der Zellen bei 200 xg in einer Standardtischmikrozentrifuge 5 min. Dann saugen die meisten mittel- und verlassen ~ 30 &amp; mgr; l zu resuspendieren und übertragen Sie die Zellen in 96-Well-Platte. HINWEIS: DieseAnsatz wird die Dissoziation des Zellklumpen und schnelle Expansion des abgeholt Kolonie zu erleichtern. </li><li> Weiter Kolonieaufnahme bis eine ausreichende Anzahl von iPSC Kolonien wurden gesammelt (etwa 20-30 Kolonien pro Experiment wird empfohlen). </li><li> Nach Kolonie Kommissionierung, legen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen in einem Inkubator über Nacht. Aktualisieren mit kompletter E8 Medium am nächsten Tag, und Kultur, bis ~ 70% konfluent. </li><li> Passage-Zellen aus dem 96-Loch in eine 24-Loch, dann in eine 6-Loch, wie in Schritten von 4,5 bis 4,10 beschrieben. HINWEIS: die Volumina der EDTA-Lösung und E8 Medium sollte bei der Verwendung von Brunnen kleiner als eine Platte mit 6 Vertiefungen entsprechend zu reduzieren. </li><li> Beurteilen Sie Targeting den Erfolg von Anschluss PCR und Southern-Blot-Analyse, gezielte Kassette Integration und das Fehlen von nach dem Zufallsprinzip eingefügt Vektoren 16 zu bestätigen. </li></ol>

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	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Hentze, H., Graichen, R., Colman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+and+the+safety+of+embryonic+stem+cell-derived+grafts.">Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts.</a> Trends Biotechnol. 25 (1), 24-32 (2007).</li><li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust,+persistent+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+is+achieved+with+AAVS1-targeted+integration.">Robust, persistent transgene expression in human embryonic stem cells is achieved with AAVS1-targeted integration.</a> Stem Cells. 26 (2), 496-504 (2008).</li><li>Lombardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+integration+and+tailoring+of+cassette+design+for+sustainable+gene+transfer.">Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer.</a> Nat Methods. 8 (10), 861-869 (2011).</li><li>Ogata, T., Kozuka, T., Kanda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+insulator+in+AAVS1,+a+preferred+region+for+integration+of+adeno-associated+virus+DNA.">Identification of an insulator in AAVS1, a preferred region for integration of adeno-associated virus DNA.</a> J Virol. 77 (16), 9000-9007 (2003).</li><li>Zwaka, T. P., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+in+human+embryonic+stem+cells.">Homologous recombination in human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).</li><li>Urbach, A., Schuldiner, M., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+for+Lesch-Nyhan+disease+by+gene+targeting+in+human+embryonic+stem+cells.">Modeling for Lesch-Nyhan disease by gene targeting in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 22 (4), 635-641 (2004).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+expressed+and+silent+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+using+zinc-finger+nucleases.">Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases.</a> Nature biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).</li><li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+of+a+disease-related+gene+in+human+induced+pluripotent+stem+and+embryonic+stem+cells.">Gene targeting of a disease-related gene in human induced pluripotent stem and embryonic stem cells.</a> Cell stem cell. 5 (1), 97-110 (2009).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases.">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nature. 29 (8), 731-734 (2011).</li><li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcription+activator-like+effector+toolbox+for+genome+engineering.">A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering.</a> Nature protocols. 7 (1), 171-192 (2012).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs.">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell stem cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Enhanced+Green+Fluorescent+Protein+Expression+After+Differentiation+and+Transplantation+of+Reporter+Human.">Stable Enhanced Green Fluorescent Protein Expression After Differentiation and Transplantation of Reporter Human.</a> Induced Pluripotent Stem Cells Generated by AAVS1 Transcription Activator-Like Effector Nucleases. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 821-835 (2014).</li><li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidase-deficient+neutrophils+from+X-linked+chronic+granulomatous+disease+iPS+cells:+functional+correction+by+zinc+finger+nuclease-mediated+safe+harbor+targeting.">Oxidase-deficient neutrophils from X-linked chronic granulomatous disease iPS cells: functional correction by zinc finger nuclease-mediated safe harbor targeting.</a> Blood. 117 (21), 5561-5572 (2011).</li><li>Luo, Y., Rao, M., Zou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+GFP+Reporter+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Using+AAVS1+Safe+Harbor+Transcription+Activator-Like+Effector+Nuclease.">Generation of GFP Reporter Human Induced Pluripotent Stem Cells Using AAVS1 Safe Harbor Transcription Activator-Like Effector Nuclease.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 29, 5A.7.1-5A.7.18 (2014).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Beers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passaging+and+colony+expansion+of+human+pluripotent+stem+cells+by+enzyme-free+dissociation+in+chemically+defined+culture+conditions.">Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions.</a> Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Erzeugung von AAVS1 Safe-Harbour gezielte menschlichen iPS-Zellen sind: (1) der effizienten Erbringung von TALEN und Donorplasmiden in iPS-Zellen durch Transfektion; (2) Optimierung der Dissoziation von iPS-Zellen in einzelne Zellen vor der Transfektion und Beschichtungs-Dichte nach der Transfektion; (3) Optimierung der Dosis und der Zeit der Medikamentenauswahl basierend auf dem Wachstum von iPSC Leitung; (4) sorgfältig seziert und Kommissionierung gezielte Kolonien und d...

Die Fähigkeit, menschliche Körperzellen in embryonale Stammzellen-ähnliche pluripotenten Stammzellen umprogrammieren (iPS) wurde zuerst von Takahashi et al entdeckt. 2007 1. Humane dermale Fibroblasten, die mit Retroviren exprimieren vier Transkriptionsfaktoren transduziert (die so genannt Yamanaka Faktoren Oct3 / 4, Sox2, c-Myc und Klf4) gezeigt wurden hoch ähnlich menschliche embryonale Stammzellen (hES) auf der Grundlage der Morphologie, Proliferation, Genexpression und epigenetische Zustand zu sein; entscheidend ist, sind ebenfalls iPSCs und zur Differenzierung zu Zellen von allen drei Keimschichten 1. Die Proliferationspotential und Differenzierung Kapazität von iPS-Zellen macht sie sehr attraktiv Werkzeuge; durch Umprogrammieren Zellen von Patienten mit bestimmten Krankheiten, iPSCs sowohl in vitro Krankheitsmodellsystemen und als potentielle Therapeutika verwendet werden. Zu letzterem Zweck müssen mehrere Probleme, bevor das volle Potenzial von iPS-Zellen behandelt werdenin einer klinischen Umgebung realisiert werden kann; das tumorigene Potential von in vitro kultivierten hESCs und iPSCs, die Verwendung von xenogenen Derivate während Umprogrammierung und Zellerhaltung, und die Notwendigkeit der transplantierten Zellen in vivo zu verfolgen sind entscheidende Hürden für die klinische Anwendung von pluripotenten Stammzellen (Bewertet von Hentze et al. 2). Eine ideale Lösung für den Bedarf für die Verfolgung von differenzierten Zellen nach Transplantation würde eine visuell detektierbare Markierung, Resists Silencing und Buntheit unabhängig von der Anwendung. Robust und nachhaltig Ausdruck der integrierten Transgene ist am leichtesten erreichbar sind, wenn exogene DNA in die Safe-Harbour-Loci eingeführt; das heißt, Genomorte, die ausreicht, die Transkription eines integrierten Vektor zu ermöglichen, während gleichzeitig die Minderung Perturbationen Expression benachbarter Gene in 3. Ein solcher Ort, der sehr gut charakterisiert ist seit seiner Entdeckung ist das Adeno-assoziierte Virus integration Site 1 (AAVS1), in dem ersten Intron des Proteinphosphatase 1 regulatorischen Untereinheit 12C (PPP1R12C) -Gen. Dieser Locus wurde gezeigt, nicht nur aufrechterhalten und robuste Expression von integrierten Transgenen durch ausgedehnte Zeit in der Kultur und in vitro Differenzierung 3 zu ermöglichen, sondern auch zum Schutz der umgebenden Gene von Transkriptionsstörungs 4; Beide Funktionen werden angenommen, dass aufgrund der Anwesenheit von endogenen Chromatin Isolatorelemente flankieren den AAVS1 Website 5. Fortschritte in der Genom-Engineering-Tools über nur den letzten zehn Jahren haben die Leichtigkeit und Effizienz, mit der genetischen Manipulationen in jedem Zelltyp erreicht werden erheblich erleichtert. Während frühe erfolgreiche Experimente angeführten überaus niedrige Niveaus von endogenen homologen Rekombination (HR) mit einer eingebrachten Geber für das Gen-Targeting in WSR 6,7 erreichen, wird die Verwendung von ortsspezifischen Nukleasen, wie beispielsweise Zinkfinger-Nucleasen (ZFNs), daß signinifikant induzieren homologe Rekombination durch die Erzeugung einer doppelsträngigen DNA-Bruch hat den Wirkungsgrad solcher Experimente 8,9 stark erhöht. Die Umnutzung der beiden Transkriptionsaktivator ähnlichen Effektoren (Erzählungen) von pflanzenpathogenen Xanthomonas Gattungen und die prokaryotischen Cluster regelmäßig beabstandeten kurzen palindromischen Repeats (CRISPR) / Cas9 System in effiziente ortsspezifische Designer-Nukleasen hat Gen-Targeting in pluripotente Stammzellen aus einem zugänglichen und praxisnahe Methodik 10-13. Eine kürzlich durchgeführte Papier beschrieben, ein effizientes Verfahren für die stabile Integration eines grün fluoreszierenden Reporterkassette in die AAVS1 Safe-Harbour-Locus in menschlichen iPS-Zellen unter Verwendung von TALE Nukleasen (Talens) 14. Diese gezielten iPSCs behielten ihre Fluoreszenz selbst nachdem eine gerichtete Differenzierung zu Herzmuskelzellen und die Transplantation in einem Mausmodell für Myokardinfarkt (MI), ein starker Hinweis für die Nützlichkeit solcherstabil fluoreszierende pluripotenten Stammzellen 14. Gezielt Kolonien zu erhalten, wurde ein Gen-Trap-Verfahren verwendet, wobei ein Spleiß-Akzeptor (SA), plaziert 2A selbstspaltende Peptidsequenz, die das Puromycin-N-Acetyl-Transferase (PAC) Gen unter der Kontrolle des endogenen Promotors PPP1R12C; also nur iPS, die die DNA-Donor am AAVS1 Locus integriert haben äußern PAC, wodurch sie auswählbar auf Puromycin-Resistenz beruht; (Figur 1, 15). Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur Erzeugung von AAVS1-GFP-iPS-Zellen berichtet in der jüngsten Papier 14, das den Prozess der Transfektion von iPS-Zellen mit Talens und ein 9,8 kb Spender, um ein 4,2 kb DNA-Fragment in die AAVS1 Safe-Harbour-Locus zu integrieren, die Auswahl iPS-Zellen auf Basis von Puromycin-Resistenz und Kommissionierung Kolonien klonalen Expansion. Die hierin beschriebenen Techniken können auf viele Genomtechnik-Experimente angewendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1437">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:588px;">NAME OF MATERIAL/EQUIPMENT</td>
			<td style="width:123px;">COMPANY</td>
			<td style="width:123px;">CATALOG #</td>
			<td style="width:603px;">COMMENTS/DESCRIPTION</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Essential 8 Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>Store basal medium at 4&#176;C. Store supplement at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DR4 MEF 2M IRR - Academic</td>
			<td>GlobalStem</td>
			<td>GSC-6204G</td>
			<td>Store in liquid Nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-040</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Defined Fetal Bovine Serum, US Origin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Thaw at 4&#176;C overnight and aliquot. Store aliquots at -20&#176;C until needed.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4D-Nucleofector Core unit&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1001B</td>
			<td>part of the electroporation system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4D-Nucleofector X unit&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1001X</td>
			<td>part of the electroporation system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-3024</td>
			<td>Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Thaw overnight at 4&#176;C and warm an aliquot in a 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NutriStem XF/FF Culture Medium</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>01-0005</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Thaw overnight at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52637 and 52638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>22212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Prepare working aliquots of 1 mg/mL in ddH2O.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120V 60Hz</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-004-521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TX-750 4 &#215; 750mL Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75003607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transfection, selection, and colony-picking of human induced pluripotent stem cells talen-targeted with a gfp gene into the aavs1 safe harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.

Eine Visualisierung des Protokolls ist in Abbildung 2, mit Zeiten, in denen iPS-Zellen sind in unterschiedlichen Medium entweder grün oder blau E8 für NutriStem hervorgehoben kultiviert. Es ist wichtig, nur hochwertige iPS-Zellen zu transfizieren; untersuchen Kulturschalen ganz routinemäßige Wartung und prüfen, ob iPS Kulturen enthalten hauptsächlich verschiedene Kolonien die mit einem Kopfsteinpflaster-ähnliche Morphologie (3A); differenzierten Zellen sollten nicht mehr als 10% ...

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Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

Transfektion, Selektion und Colony-Picking für Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mit einem GFP-Gen in die AAVS1 Safe Harbor TALEN ziel

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

transfection-selection-colony-picking-human-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

19.2K Aufrufe.  National Institutes of Health. TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.