עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי (1) שד משרד ההגנה תכנית לחקר סרטן (צבא ארה&quot;ב למחקר רפואי רכישת פעילות) הפרס # W81XVVH-10-1-0781 לLAL וVE, ו- (2) מענק סוזן ג &#39;קומן הקרן IR122224446 לאל וVE. תמיכת פתולוגיה וגילום רקמה סופקו באדיבות על ידי Inova Fairfax פתולוגיה מחלקה, ד&quot;ר חסן נייער, ד&quot;ר גיתה א מנזס, ודר &#39;צ&#39;ארלס בכרט. הסכמת מטופל ורכש מדגם מודרך במומחיות על ידי רכזי מחקר קליני Inova Fairfax בית החולים הולי Gallimore, הת&#39;ר Huryk, ואמיל קמר.

רקמת שד אנושית שנאספו מחולים שהשתתפו במחקר, עם סכמה בכתב הודיעה, לאחר משרד הגנה, אוניברסיטת ג&#39;ורג &#39;מייסון, והפרוטוקולים המאושרים של מערכת בריאות Inova Institutional Review Board. 1. הכנת תזונתי עשיר בינוני עם גורמי גדילה ואנטיביוטיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרונות מניות של אינסולין, גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), סולפט סטרפטומיצין סולפט גנטמיצין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש אינסולין במים מסוננים סטרילי לריכוז סופי של 10 מ&quot;ג / מיליליטר. לשאוב 10 מיליליטר של מים כיתה מגיב מסוג 1 במזרק חד פעמי 10 מיליליטר סטרילי. צרף מסנן 0.22 מיקרומטר polyethersulfone למזרק. לוותר מים המסוננים סטרילי לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מיליליטר של מים מסוננים סטרילי לבקבוקון 100 מ&quot;ג של אינסולין. מערבבים את התוכן בקצרה על מיקסר מערבולת. שמור את בקבוקון האינסולין על קרח. לוותר 450 μl של מניית אינסולין solution לכותרת, צינורות סטרילית microcentrifuge ולאחסן ב -20 ° C. פתרון מניות אינסולין הוא יציב עד לתאריך התפוגה על הבקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות של גורם הגדילה באפידרמיס (EGF): הוסף 500 μl מים סטריליים 500 מיקרוגרם EGF (1 מיקרוגרם / μl מלאי). מערבבים את התוכן בקצרה על מיקסר מערבולת. שמור את בקבוקון EGF על קרח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות חוזר של EGF: הוסף של פתרון EGF המניה 100 μl 900 בינוני מזין μl (מלאי עבודה יהיה 0.1 מיקרוגרם / μl). מערבבים את התוכן בקצרה על מיקסר מערבולת. לוותר 50 μl של פתרון EGF עובד המניות שלכותרתו צינורות microcentrifuge סטרילי, ולאחסן ב -80 ° C. הערה: פתרון מניות EGF (1 מיקרוגרם / μl) הוא יציב במשך השנה 1 ב -80 מעלות צלזיוס; עובד פתרון מניות (0.1 מיקרוגרם / μl) הוא יציב במשך 2 חודשים ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 40 מ&quot;ג של סולפט סטרפטומיצין על איזון אנליטיים. הנח את int סולפט סטרפטומיציןOA 15 מיליליטר סטרילי צינור חרוטי. הוסף 4 מיליליטר של מדיום מזין. מערבבים את התוכן בקצרה על מיקסר מערבולת. הפתרון צריך להיות ורוד במקצת. חנות ב 4 ° C מוגנת מפני אור. פתרון סולפט סטרפטומיצין יציב למשך 7 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 20 מ&quot;ג של סולפט גנטמיצין על איזון אנליטיים. הנח את סולפט גנטמיצין לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר סטרילי. הוסף 2 מיליליטר של מדיום מזין. מערבבים את התוכן בקצרה על מיקסר מערבולת. הפתרון צריך להיות צהוב. חנות ב 4 ° C מוגנת מפני אור. פתרון סולפט גנטמיצין יציב למשך 7 ימים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שני 200 מיליליטר קבוצות של מדיום מזין בתוספת EGF האנושי רקומביננטי (10 ng / קונצרט כלשהו סופי מיליליטר.), אינסולין (10 מיקרוגרם / קונצרט כלשהו סופי מיליליטר.), סולפט סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / קונצרט כלשהו סופי מיליליטר.) וסולפט גנטמיצין (20 מיקרוגרם / קונצרט כלשהו סופי מיליליטר.). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני 200 מיליליטר מזין בבקבוק מסנן אבק מצויד בבקבוק 0.2 מיקרומטר לסנן polyethersulfone ובקבוק שקיבל 250 מיליליטר. הוסף 20 &amp;181 #; המניה עובדת l EGF, 200 אינסולין μl מניות, 2 מיליליטר סולפט סטרפטומיצין המניות, ו -400 סולפט גנטמיצין מניית μl ל-200 מיליליטר של מדיום מזין. צרף את בקבוק המסנן לואקום. סינון הבינוני. מחק את המסנן ואת תווית הבקבוק כמו &quot;מדיום עשיר מזין&quot;. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 14 ימים. </li></ol></li></ol> 2. רקמות רכישה וגילום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוויטת ההפעלה, לשמור על טכניקה סטרילית אחרי רכישת רקמת השד. הנח את רקמת השד במגש סטרילי ולכסות את המגש בניילון הנצמד סטרילי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הרקמה במגש המכוסה לרדיולוגיה / פתולוגיה כנדרש במוסד שלך. אל תפתחו את המגש. פעמים תחבורה להשתנות בתוך מוסדות. רקמה יכולה להישאר קיימא במגש מכוסה זה ב RT להודעה כריתה עד 45 דקות. עם זאת, עיבוד מהיר של הרקמה לתוך מדיום עשיר מזין מספק תנאים אופטימליים לתרבות organoid שלאחר מכן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתיחת רקמות ברוטו לזהות אזורים של DCIS בתוך רקמת השד: השתמש בכפפות סטריליות, להבים, אזמלים, צבעי סימון רקמה, וחומץ בנתיחת רקמה לרקמה לשמור על סטריליות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את אזור העבודה עם אתנול 70% או אקונומיקה 1%. פתח את כפפות סטריליות ולמקם את עטיפת הכפפה על משטח העבודה. הנח את הפנים סטרילי של עטיפת כפפה עם הפנים כלפי מעלה. לשים על כפפות סטריליות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את פני השטח של מיכל הדגימה עם 70% אתנול. הסר את עטיפת הפלסטיק מיכל דגימת הרקמה ומקום הדגימה על עטיפת הכפפה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים צמר הטה שתי כותנה לצבע הרקמה לציון. החל הצבע אל פני השטח של הרקמה על ידי גלגול ספוגיות על פני הרקמה. הערה: כל מחלקה הפתולוגית יש פרוטוקול נטייה צבע לצבוע / רקמה סטנדרטית. רקמה מסומנת בצבע כדי לכוון את הרקמה ביחס לעמדתה בסבלנות. או לצבוע נמחקצייר על הרקמה. אין לשפוך הצבע על הרקמות. לשפוך הצבע יכול לגרום לצבע לרוץ / לטפטף לתוך נקיקי רקמות ובכך מבלבלים את הכיוון של שוליים ניתוחיים. נטייה רקמה מספקת למנתח ופתולוג עם ציוני אנטומיים ל) מתאר את דגימת הרקמות, ו ב) לקבוע את המיקום של השוליים הניתוחיים ביחס לגידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים חומץ לבן מזוקק (5% חומצה אצטית) על פדה גזת סטרילי. למחוק את הרקמה צבועה עם הגזה ספוגה בחומץ. מחק את הגזה. חומץ משמש כדי לתקן רקמת סימון צבעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את רקמת השד לפרוסות אנכיות כ 5 מ&quot;מ עובי. לא לחתוך את כל הדרך דרך הרקמה (איור 2). שים לב / למשש את הרקמה לאזורים של הסתיידות. לזהות נגעי DCIS על ידי משרד עורכי האופייניים שלהם, חיוור הופעה מוקפת אדמדם, גבולות גומי שמרגישים גרגירי (עקב spicules סידן). הערה: במקרים מסוימים, comedo אזורים (כמו פצעון) יכולים להיותנתפס כנקודות לבנות, המייצגות את חומר נימקי מנגעי DCIS בקוטר גדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגזור תחומי DCIS / רקמת שד מסוידת, כולל כמות קטנה של רקמה הסובבת שד. הנח את רקמת השד לתוך צינור 50 מיליליטר סטרילי המכיל 20-30 מיליליטר של מדיום עשיר מזין מוכן בשלב 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הרקמה ובינוני על ידי בעדינות את צינור היפוך מספר פעמים. מחק את בינוני ומוסיף בינוניים טרי. מניחים את הצינור המכיל את הרקמה ובינוני למכל מבודד ולהעביר את הרקמה למעבדה תרבית רקמה. </li></ol></li></ol></li></ol> תרבות 3. רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , עובד בארון בטיחות ביולוגי לשפוך הרקמה וכמות קטנה של המדיום מזין לתוך צלחת פטרי סטרילית. באמצעות אזמל סטרילי לחתוך ולסלק את הרקמה הסיבית. חותך את רקמת השד לחתיכות (organoids) כ 3 מ&quot;מ 2 (איור 1 ג-ד). נסה לחתוך את הרקמה, כך שכל איברOID מכיל קטע צינור להבחין לפחות אחד עם סטרומה שמסביב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את המכסה של הבקבוק בתרבית הרקמה. בעזרת פינצטה או מלקחיים סטריליות, למקם את organoids לתוך הבקבוק. סגור את המכסה. מחק את צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני 11 מיליליטר מזין סרום ללא עשיר (מוכן בשלב 1) לבקבוק תרבית רקמה. סגור את הבקבוק ולערבל את הבקבוק כך organoids והבינוני מפוזרים באופן שווה על פני הבקבוק (איור 1E-F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הבקבוק על 37 מעלות צלזיוס באווירת CO humidified 5.0% 2 במשך 2 ימים. אל תזיז את הבקבוק בזמן הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 2 לאחר דגירה על, להסיר את הבקבוק מן החממה כדי לבדוק זיהום פטרייתי / חיידקים פוטנציאליים. הימנע פתאומי, תנועות חדות, או מתערבל של הבקבוק. הנח את הבקבוק על במה מיקרוסקופ הפוכה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב למדיום לחיידקים, שמרים, ו / או פטרייה. אם אין זיהום יצוין, להחזיר את הבקבוק לחממה לתוספתיום itional. אם הזיהום יצוין, להשליך את הבקבוק ותכנים במכל מתאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 3 לאחר דגירה על, להחליף את המדיום המותנה עם מדיום חדש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 11 מיליליטר של מדיום בצינור סטרילי על 37 מעלות צלזיוס במשך 20-30 דקות. הסר את בקבוק תרבות רקמה מן החממה. מבלי להפריע את organoids, להסיר ולסלק הבינוני בבקבוק בעזרת פיפטה סרולוגית סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה סרולוגית סטרילי חדשה, להוסיף 11 מיליליטר של המדיום הטרי מראש חימם. מאוד בעדינות לסובב את הבקבוק כדי להפיץ את המדיום על פני הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הבקבוק על 37 מעלות צלזיוס ב5.0% אווירת CO 2 humidified. </li></ol></li></ol> 4. תחזוקה של מושבות תאי Organoid / אפיתל הוקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום טרי כל 2 שבועות ולהחליף את התקשורת בבקבוק תרבות הרקמה 3 פעמים בשבוע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 11 מיליליטר של מדיום במכל סטרילי ב 37° C במשך 20-30 דקות. הסר את הבקבוק מן החממה. בעזרת פיפטה סרולוגית סטרילי, להסיר ולסלק בינוני המותנה מהבקבוק, נזהר שלא להפריע organoids. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה סרולוגית סטרילי חדשה, להוסיף 11 מיליליטר של המדיום הטרי מראש חימם. מאוד בעדינות לסובב את הבקבוק כדי להפיץ את המדיום על פני הבקבוק. דגירה הבקבוק על 37 מעלות צלזיוס ב5.0% אווירת CO 2 humidified. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10-14 ימים בתרבות, להסיר כל חתיכות של רקמות בבקבוק התרבות שאינן חסיד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים מעת לעת קציר ו / או organoids מהבקבוק להתפשטות לתוך צלוחיות תרבות חדשות, להשתלת xenograft, או לפנוטיפי ו / או ניתוח מולקולרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את בקבוק תרבות רקמה מן החממה. תרסיס הבקבוק עם אתנול 70%. נגב את אתנול עודף על הבקבוק עם מגבת נייר נקייה שרוססה עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התפשטות Organoid: &lt;ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את המכסה של הבקבוק ולשים את המכסה כלפי מעלה בארון הבטיחות הביולוגי. תחת להדמיה מיקרוסקופית, לאתר את organoid (ים) להיות שנקטפו. להשתמש בפינצטה או מלקחיים סטריליות לאיסוף organoid. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפיץ organoid בבקבוק תרבות חדש, מקום organoid בבקבוק החדש. הוסף בינוני טרי, חם 11 מיליליטר. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, באווירת 5% CO 2 humidified כמתואר בשלבים 3.3 - 3.6.3. החלף את מדיום תרבית תאים בתרבית רקמת בקבוקון שלוש פעמים בשבוע. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת vixualization המיקרוסקופי ישיר, בעדינות לגרד ותאים לשאוב וmammospheres באמצעות פיפטה 1,000 μl עם טיפים פיפטה חד פעמי סטרילי. לשאוב את התאים ובינוניים שמסביב. לוותר תאים / בינוני לתוך צינור microcentrifuge סטרילי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין התאים לזמן קצר במיני-צנטריפוגות ב XG 12,100 במשך 5 שניות. להסיר ולסלק הבינוני. &lt;ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח ה- DNA, להקפיא באופן מיידי את התא גלולה בקרח יבש, בנפח קטן של מדיום (10 μl), עם אחסון לטווח ארוך ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח proteomic, lyse התאים 10 μl של 8 מ &#39;אוריאה לספקטרומטר מסה או חיץ טריס-גליצין 2x SDS סופגים / microarrays חלבון המערבי הפוך שלב. לחלופין, ספין תאים בcytocentrifuge לעשות מריחות תא לניתוח immunohistochemical. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קצירת תאים מבקבוק, להסיר ולסלק בינוניים שנותר. להוסיף 11 מיליליטר של מדיום עשיר חם, מזין טרי. דגירה הבקבוק על 37 מעלות צלזיוס, באווירת 5% CO 2 humidified. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Shaughnessy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+and+prevention+of+intraepithelial+neoplasia:+an+important+target+for+accelerated+new+agent+development.">Treatment and prevention of intraepithelial neoplasia: an important target for accelerated new agent development.</a> Clin Cancer Res. 8 (2), 314-346 (2002).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li><li>Behbod, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intraductal+human-in-mouse+transplantation+model+mimics+the+subtypes+of+ductal+carcinoma+in+situ.">An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ.</a> Breast Cancer Res. 11 (5), (2009).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+precursor+cells+pre-exist+in+human+breast+DCIS+and+require+autophagy+for+survival.">Malignant precursor cells pre-exist in human breast DCIS and require autophagy for survival.</a> PLoS One. 5 (4), (2010).</li><li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem/progenitor+cells.">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li><li>Farnie, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+culture+technique+for+primary+ductal+carcinoma+in+situ:+role+of+Notch+and+epidermal+growth+factor+receptor+signaling+pathways.">Novel cell culture technique for primary ductal carcinoma in situ: role of Notch and epidermal growth factor receptor signaling pathways.</a> J Natl Cancer Inst. 99 (8), 616-627 (2007).</li><li>Wicha, M. S., Liotta, L. A., Garbisa, S., Kidwell, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membrane+collagen+requirements+for+attachment+and+growth+of+mammary+epithelium.">Basement membrane collagen requirements for attachment and growth of mammary epithelium.</a> Exp Cell Res. 124 (1), 181-190 (1979).</li><li>Espina, V., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+malignant+nature+of+human+ductal+carcinoma+in+situ.">What is the malignant nature of human ductal carcinoma in situ.</a> Nat Rev Cancer. 11 (1), 68-75 (2011).</li><li>Gong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beclin+1+and+autophagy+are+required+for+the+tumorigenicity+of+breast+cancer+stem-like/progenitor+cells.">Beclin 1 and autophagy are required for the tumorigenicity of breast cancer stem-like/progenitor cells.</a> Oncogene. 32 (18), 2261-2272 (2012).</li><li>Simon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+glycoprotein+is+a+member+of+a+family+of+epithelial+cell+surface+antigens+homologous+to+nidogen,+a+matrix+adhesion+protein.">Epithelial glycoprotein is a member of a family of epithelial cell surface antigens homologous to nidogen, a matrix adhesion protein.</a> PNAS. 87 (7), 2755-2759 (1990).</li><li>Ma, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+of+human+breast+cancer+progression.">Gene expression profiles of human breast cancer progression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5974-5979 (2003).</li><li>Schnitt, S. J., Harris, J. R., Smith, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+prognostic+index+for+ductal+carcinoma+in+situ+of+the+breast.+Are+we+there+yet.">Developing a prognostic index for ductal carcinoma in situ of the breast. Are we there yet.</a> Cancer. 77 (11), 2189-2192 (1996).</li><li>Sgroi, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preinvasive+breast+cancer.">Preinvasive breast cancer.</a> Annu Rev Pathol. 5, 193-221 (2010).</li><li>Asch, H. L., Asch, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+keratin+expression+in+mouse+mammary+hyperplastic+alveolar+nodules+and+adenocarcinomas.">Heterogeneity of keratin expression in mouse mammary hyperplastic alveolar nodules and adenocarcinomas.</a> Cancer Res. 45 (6), 2760-2768 (1985).</li><li>LaBarge, M. A., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+microenvironments+and+mammary+stem+cells.">Of microenvironments and mammary stem cells.</a> Stem Cell Rev. 3 (2), 137-146 (2007).</li><li>Smart, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+breast+cancer+cell+line+tumourspheres+and+primary+human+breast+epithelia+mammospheres+demonstrates+inter-+and+intrasphere+heterogeneity.">In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity.</a> PLoS One. 8 (6), (2013).</li><li>Vaillant, F., Asselin-Labat, M. L., Shackleton, M., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+picture+of+the+mouse+mammary+stem+cell.">The emerging picture of the mouse mammary stem cell.</a> Stem Cell Rev. 3 (2), 114-123 (2007).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cap+associated+focal+adhesions+and+their+distinct+role+in+cellular+mechanosensing.">Actin cap associated focal adhesions and their distinct role in cellular mechanosensing.</a> Sci Rep. 2, 555 (2012).</li><li>Espina, V., Wysolmerski, J., Edmiston, K., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attacking+breast+cancer+at+the+preinvasion+stage+by+targeting+autophagy.">Attacking breast cancer at the preinvasion stage by targeting autophagy.</a> Women's Health. 9 (2), 1-14 (2013).</li><li>D'amonte, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+carcinoma+behavior+is+programmed+in+the+precancer+stem+cell.">Mammary carcinoma behavior is programmed in the precancer stem cell.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), (2008).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

מערכת התרבות המתוארת כאן מהווה מודל חדש ליצירת תאי גידולים קדם-פולשנית המתגוררים שד למחקרים בסיסיים וtranslational. בעבר, התקדמות סרטן השד טרום ממארת יש בדרך כלל נחקרה תוך שימוש בשלוש שיטות שונות. השיטה הראשונה היא היסטופתולוגיות וניתוח גנטי של דגימות אנושיות קפוא או קבוע...

התפשטות של תאי האפיתל בתחומי צינוריות שד וalveoli (קרצינומה ductal באתר) מוכרת כמבשר מחייב לductal פולשני וסרטן השד לובולרי. עם זאת, המנגנונים המולקולריים ודינמיקה של אוכלוסיות תאים המאפשרים התקדמות לסרטן פולשני הם הבינו היטב. הבהרת מנגנוני ההישרדות בשימוש על ידי תאים טרום-פולשנית סרטן השד, או כל גידול טרום פולשני, עשויה לחשוף אסטרטגיות טיפוליות להריגה, או אפילו מניעה, שאתות מראש פולשנית 1. עם זאת, שיטות עלות נמוכה פשוטות לנגעים טרום-פולשנית אנושיות תפקודי לומדים כבר חסרות. למרות שתרבות monolayer במבחנה של שורות תאים הפכו שיטת מעבדה הוקמה, פנוטיפ לבין הגנוטיפ של שורות תאים הונצחו אלה נכשל לשחזר את המצב המולקולרי של תאים סרטניים אנושיים ראשוניים 2. יתר על כן, אפילו שורת התאים שאינם סרטנית MCF-10A, שrecapitulates 3-D ארכיטקטורת בלוטת החלב, לא מייצגת את הפנוטיפ הפונקציונלי ומאפיינים מולקולריים של נגע השד מראש פולשנית של המטופל 3,4 כראוי. כדי לקבוע אם תאי גידולים כמו גזע מסוגלים פלישה היו קיימים בתוך קרצינומה ductal באתרו (DCIS) אוכלוסיית תאים, שפתחנו מתודולוגיה לאיסוף וculturing רקמת שד האנושי סטרילי בזמן הניתוח (איור 1) 5. ex vivo מערכת תרבות organoid השד שלנו אינה מסתמכת על הפרעה אנזימטית רקמה, מטריצת תמצית קרום במרתף, או דלדול פיברובלסטים, לבידוד ומתפשט תאי יוצרי mammosphere מרקמת קרצינומה ductal שד האנושי הטרי 6-8. המערכת החדשה שלנו מבוססת על העיקרון של הזרמה / נדידת תאי 5. הצינורות ניכרו השד, וסטרומה מסביב שקועים בהיקף מינימאלי של מדיום מזין סרום ללא (רק דוארnough כדי לכסות את שברי הצינור) על מנת למקסם את חילוף גזים, עם פני השטח החתך של הצינור נחשף לתרבות בינונית, אבל בשום כיוון מסוים בבקבוק (איור 1E-F). מערכת זו התרבות מאפשרת לתאים לנדוד אל מחוץ לצינור ול/ על בקבוק סטרומה ותרבות אוטולוגי. בינוני המזין, בתוספת רק עם עוריות Growth Factor (EGF), אינסולין, ואנטיביוטיקה, תומך בצמיחה של אוכלוסיות תאים מעורבות שנכללו בגין את organoid. יש בקבוק תרבות רקמת מכסה המאפשר organoids ו / או התאים להיות שנקטפו מבלי לשבש את organoids הבקבוק או השכן כל, תוך שמירה על סביבת humidified סטרילי נשלף, מחדש סגר.

<table><tbody><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>A405-P</td><td>prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water</td></tr><tr><td>18 M&amp;Omega;-cm water, sterile filtered</td><td></td><td></td><td>sterile filtered, Type 1 reagent grade water</td></tr><tr><td>10 cc plastic disposable syringe, sterile</td><td>BD</td><td>305482</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile</td><td>Thermo Scientific</td><td>194-2520</td><td></td></tr><tr><td>15 ml polypropylene conical tubes, sterile</td><td>Fisher</td><td>14-959-49B</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polypropylene conical tubes, sterile</td><td>Fisher</td><td>05-539-6</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml low retention microcentrifuge tubes, sterile</td><td>Fisher</td><td>02-681-331</td><td></td></tr><tr><td>nutrient medium, DMEM-F12/HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td>with L-glutamine</td></tr><tr><td>Insulin, human recombinant</td><td>Roche</td><td>11376497001</td><td>10 mg/ml stock</td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant</td><td>Millipore</td><td>GF144</td><td>100 &amp;micro;g/ml stock</td></tr><tr><td>Streptomycin sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1567</td><td>10 mg/ml stock</td></tr><tr><td>Gentamicin sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G19114</td><td>10 mg/ml stock</td></tr><tr><td>Filtration flask and filter top, sterile</td><td>Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td>0.22 &amp;micro;m PES membrane</td></tr><tr><td>25 ml sterile, disposable pipettes</td><td>Fisher</td><td>4489</td><td>paper-plastic wrapped</td></tr><tr><td>10 ml sterile, disposable pipettes</td><td>Fisher</td><td>4488</td><td>paper-plastic wrapped</td></tr><tr><td>Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange)</td><td>CDI</td><td>MD2000</td><td>after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard</td></tr><tr><td>Cotton tipped applicators, sterile</td><td>Fisher</td><td>23-400-115</td><td>single use only</td></tr><tr><td>Gauze pads, 10 x 10 cm, sterile</td><td>Fisher</td><td>2187</td><td></td></tr><tr><td>Plastic transfer pipettes, sterile, disposable</td><td>Samco</td><td>202-20S</td><td></td></tr><tr><td>Vinegar, white distilled</td><td>household use</td><td></td><td>5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes</td></tr><tr><td>#10 scalpels, sterile, disposable</td><td>Thermo Scientific</td><td>31-200-32</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish, sterile</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>TPP 115 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; flask, with removable lid</td><td>MidSci</td><td>90652</td><td>screw cap with filter</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Fisher</td><td>13-998-074</td><td>5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 37 &amp;deg;C, humidified chamber</td></tr><tr><td>inverted light microscope</td><td>Olypmus</td><td>IX51</td><td></td></tr><tr><td>8 M urea</td><td>Fisher</td><td>BP169-500</td><td>optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells</td></tr><tr><td>2X SDS tris-glycine buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LC2676</td><td>optional, for proteomic analysis of cultured cells</td></tr><tr><td>Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>optional, for preparing cell smears</td></tr></tbody></table>

non-enzymatic, serum-free tissue culture of pre-invasive breast lesions for spontaneous generation of mammospheres

קרצינומה של צינוריות שד באתרו (DCIS), בהגדרה, היא התפשטות של תאי אפיתל גידולים בתחומי צינוריות השד, מבלי לפרוץ את הקרום במרתף collagenous. בעוד DCIS הוא מבשר שאינו מחייב לסרטן שד פולשני, המנגנונים המולקולריים ואוכלוסיות תאים המאפשרים התקדמות לסרטן פולשני אינם ידועים במלואו. כדי לקבוע אם תאים מסוגלים פלישה היו קיימים בתוך אוכלוסיית תאי DCIS, שפיתחנו מתודולוגיה לאיסוף וculturing רקמת שד האנושי סטרילי בזמן הניתוח, ללא הפרעה אנזימטית של רקמה. רקמת שד סטרילי המכילה קטעי ductal שנקטפו מרקמת שד שנכרת בניתוח לאחר בדיקה פתולוגית שגרתית. רקמה המכילה DCIS ממוקמת במדיום מזין עשיר, המכיל אנטיביוטיקה, סרום חופשי, ומועברת למעבדה תרבית רקמה. רקמת השד היא dissecte נוסףד לבודד את האזורים המסוידים. חתיכות מרובות רקמת שד (organoids) ממוקמות בנפח מינימאלי של מדיום סרום ללא בבקבוק עם מכסה נשלף ותרבותי בCO 2 באינקובטור humidified. אוכלוסיות תאי אפיתל ופיברובלסטים לצאת מorganoid לאחר 10-14 ימים. באופן ספונטני Mammospheres יוצר על ומסביב monolayer תאי אפיתל. ניתן לקצור אוכלוסיות תאים ספציפיות ישירות מהבקבוק מבלי לשבש תאים שכנים. מערכת התרבות שלנו אינה אנזימטית רקמה אמינה מגלה תאי cytogenetically חריגים, חודרניים אב מנגעי DCIS אנושיים טריים.

זרימת עבודה עבור רכישה וculturing קרצינומה ductal שד סטרילי ברקמה באתר עקרות רקמת שד נשמרת מחדר הניתוח למעבדה תרבית תאים באמצעות שינויים קלים בעבודת פתולוגיה בבית החולים טיפוסית (איור 1). רקמה מועברת במכל סטרילי עם מכסה פלסט...

Watch this Scientific Journal Video about Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres at JoVE.com

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

תרבית תאים ראשונית באמצעות organoids רקמה שלמה מספקת מערכת מודל המחקה את המיקרו-הסביבה רב-התאית בגוף חי. פיתחנו מודל סרום ללא עיקרי רקמת האפיתל שד תרבות המנציח שושלות מעורבות תרבית תאים ותערוכות מובחנות מורפולוגיה, ללא הפרעה רקמה האנזימטית. organoids השד בר-קיימא ל&gt; 6 חודשים.

אינו אנזימטית, תרבות רקמות סרום ללא נגעי שד טרום פולשני לדור ספונטני של Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

non-enzymatic-serum-free-tissue-culture-pre-invasive-breast-lesions

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K Views.  George Mason University.  תרבית תאים ראשונית באמצעות organoids רקמה שלמה מספקת מערכת מודל המחקה את המיקרו-הסביבה רב-התאית בגוף חי. פיתחנו מודל סרום ללא עיקרי רקמת האפיתל שד תרבות המנציח שושלות מעורבות תרבית תאים ותערוכות מובחנות מורפולוגיה, ללא הפרעה רקמה האנזימט?...

Video: Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular through transplantation of stromal cells and epithelial cells in the mammary gland of mice. Current transplantation models often involve the use of immunocompromised mice due to the different genetic backgrounds of stromal cells and epithelial cells. Extracellular matrices are often used to embed the two different cell types for consistent cell-cell interactions, but involve the use of Matrigel or rat tail collagen, which are immunogenic substrates. The lack of functional T cells from immunocompromised mice prevents accurate assessment of stromal cells on mammary tumor progression in vivo, with important implications on drug development and efficacy. Moreover, immunocompromised mice are costly, hard to breed and require special care conditions. To overcome these obstacles, we have developed an approach to orthotopically transplant stromal cell and epithelial cells into mice from the same genetic background to induce consistent tumor formation. This system involves harvesting normal, carcinoma associated fibroblasts, PyVmT mammary carcinoma cells and collagen from donor C57BL/6J mice. The cells are then embedded in collagen and transplanted in the inguinal mammary glands of female C57BL/6J mice. Transplantation of PyVmT cells alone form palpable tumors 30-40 days post transplantation. Endpoint analysis at 60 days indicates that co-transplantation with fibroblasts enhances mammary tumor growth compared to PyVmT cells transplanted alone. While cells and matrix from C57BL/6J mice were used in these studies, the isolation of cells and matrix and transplantation approach may be applied towards mice from different genetic backgrounds demonstrating versatility. In summary, this system may be used to investigate molecular interactions between stromal cells and epithelial cells, and overcomes critical limitations in immunocompromised mouse models.

In this report, we demonstrate a system to isolate and culture donor cells from the mouse mammary gland, and orthotopically transplant these cells in recipient mice to analyze stromal: epithelial interactions during mammary tumor development.

השתלה של תאים סטרומה החלב ותאי קרצינומה של עכברים C57BL/6J

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular ...

Medicine

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

הדור ניסויית של קרצינומה-Associated Fibroblasts (CAFs) מ Fibroblasts החלב אנוש

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

עיבוד של הפחתה מאמופלסטית אדם ורקמות כריתה לתא תרבות

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

הדמית זמן לשגות של תאי אפיתל חלב Preneoplastic ראשוניים הנגזרת ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סרטן השד

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

בידוד והערכה תפקודית של תאי גזע מסרטן השד האנושי מדגימות תאים ורקמות

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Cancer Research

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

כדורי תא אפיתל ואנדותל של חלבי כמודל הפריה תפקודי פוטנציאלי לחקר סרטן השד

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

Quantification of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures

The mammary gland is characterized by extensive regeneration capacity, as it goes through massive hormonal changes throughout the life cycle of a female. The role of mammary stem cells (MaSCs) is widely studied both in the physiological/developmental context and with regards to breast carcinogenesis. In this aspect, ex vivo studies focused on MaSC properties are highly sought after. Mammosphere cultures represent a surrogate of organ formation and have become a valuable tool for both basic and translational research. Here, we present a detailed protocol for the generation of murine primary mammosphere cultures and the quantitation of MaSC growth properties. The protocol includes mammary gland collection and digestion, isolation of primary mammary epithelial cells (MECs), establishment of primary mammosphere cultures, serial passaging, quantitation of mammosphere growth parameters and interpretation of the results. As an example, we present the effect of low-level constitutive Myc expression on normal MECs leading to increased self-renewal and proliferation.

Here, we describe the implementation and interpretation of the results of an in vitro mammosphere self-renewal quantitative assay.

קוונפיקציה של התחדשות עצמית בתרבויות מורנה במוספירה

The mammary gland is characterized by extensive regeneration capacity, as it goes through massive hormonal changes throughout the life cycle of a female. ...

Developmental Biology

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine mammary gland is composed of two distinct epithelial cell compartments, serving different functions: the outer, contractile myoepithelial compartment and the inner, secretory luminal compartment. Here, we describe a method by which the cells comprising these compartments are isolated and then combined to investigate their individual lineage contributions to mammary gland morphogenesis and differentiation. The method is simple and efficient and does not require sophisticated separation technologies such as fluorescence activated cell sorting. Instead, we harvest and enzymatically digest the tissue, seed the epithelium on adherent tissue culture dishes, and then use differential trypsinization to separate myoepithelial from luminal cells with ~90% purity. The cells are then plated in an extracellular matrix where they organize into bilayered, three-dimensional (3D) organoids that can be differentiated to produce milk after 10 days in culture. To test the effects of genetic mutations, cells can be harvested from wild type or genetically engineered mouse models, or they can be genetically manipulated prior to 3D culture. This technique can be used to generate mosaic organoids that allow investigation of gene function specifically in the luminal or myoepithelial compartment.

The mammary gland is a bilayered structure, comprising outer myoepithelial and inner luminal epithelial cells. Presented is a protocol to prepare organoids using differential trypsinization. This efficient method allows researchers to separately manipulate these two cell types to explore questions concerning their roles in mammary gland form and function.

הדור של הפסיפס של חלב באמצעות טריסיזציה דיפרנציאלית

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Assay גיבוש Mammosphere משד אדם סרטן רקמות וקווים סלולריים

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

פרוטוקול לבידוד תאי אפיתל חלב מרקמה אנושית

Isolation and Culture of Primary Human Mammary Epithelial Cells

The mammary gland is a fundamental structure of the breast and plays an essential role in reproduction. Human mammary epithelial cells (HMECs), which are the origin cells of breast cancer and other breast-related inflammatory diseases, have garnered considerable attention. However, isolating and culturing primary HMECs in vitro for research purposes has been challenging due to their highly differentiated, keratinized nature and their short lifespan. Therefore, developing a simple and efficient method to isolate and culture HMECs is of great scientific value for the study of breast biology and breast-related diseases. In this study, we successfully isolated primary HMECs from small amounts of mammary tissue by digestion with a mixture of enzymes combined with an initial culture in 5% fetal bovine serum-DMEM containing the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632, followed by culture expansion in serum-free keratinocyte medium. This approach selectively promotes the growth of epithelial cells, resulting in an optimized cell yield. The simplicity and convenience of this method make it suitable for both laboratory and clinical research, which should provide valuable insights into these important areas of study.

מחבר זרקור: שילוב רפואה מזרחית ומערבית לטיפול בדלקת שד גרנולומטית

The present study reports an easier, time-saving, and economical protocol to efficiently isolate and grow primary human mammary epithelial cells (HMECs) from small amounts of mammary tissue. This protocol is suitable for quickly producing primary HMECs both for laboratory and clinical applications.

בידוד ותרבית של תאי אפיתל ראשוניים של חלב אנושי

The mammary gland is a fundamental structure of the breast and plays an essential role in reproduction. Human mammary epithelial cells (HMECs), which are ...