The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.

הערה: כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות אתיות מוסדיות מקומיות. ציור 1. דם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דרך venipucture antecubital, לאסוף 14 צינורות דם ממתנדב בריאה לראש ירוק צינורות (heparinized) ולהפוך כל צינור לפני שהתיישב על קרח. איסוף דם בתוך 10 - 15 דקות של ניסוי כדי להבטיח תשואת נויטרופילים אופטימלית. </li></ol> 2. בידוד נויטרופילים מדם מלא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף כל צינור עליון ירוק של דם עם 5 מיליליטר של PBS ללא Ca וMg כדי לדלל את הדם. בכל אחד מצינורות חרוטי 4 x 50 מיליליטר, להוסיף 15 מיליליטר של מדיה הפרדת ימפוציטים (LSM) בשעה RT. באמצעות מחט 18 G רכובה על מזרק 60 מיליליטר, שכבת הדם המדולל על LSM בזהירות, יצירת ממשק LSM-דם חד. הערה: יש להימנע מערבוב של השכבות ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 800 XG למשך 30 דקות ב 21 ° C, ללא הפסקה. הפסקות פתאומיות יכול: הערהלגרום לערבוב של השכבות השונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב למשקעי אריתרוציטים ונויטרופילים בתחתית. לשאוב ולזרוק 2 שכבות העליונה (פלזמה וLSM) והקפד להיפטר מהממשק בין שכבות אלה המכילות לימפוציטים ותאי mononuclear, עוזב את השכבה האדומה התחתונה בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על צינור אחד, להוסיף 20 מיליליטר של פוספט הצפת מלוח (PBS) ופתרון Dextran 20 מיליליטר של 6%. בעדינות להפוך כל צינור לערבב עם השכבה של אריתרוציטים ונויטרופילים ולאפשר לשבת בRT למשך 30 דקות. הערה: זה יאפשר תאי דם אדומים (RBCs) משקע בתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות, להעביר את supernatant העשיר נויטרופילים לתוך צינורות טריים וזורקים את כדורי RBC. supernatants צנטריפוגות ב 450 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לאחר צנטריפוגה, להשליך supernatant. גלולה תכיל בעיקר נויטרופילים וכמה RBCs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון lysing ידי הוספת 0.5 מיליליטר של חיץ lysing 4.5 מיליליטר של מים סטריליים. Lyse נותר RBC עם tהוא הכין 5 מיליליטר של lysing פתרון, להעביר את כל כדורים המושעים לצינור אחד. לאפשר תמוגה ב RT בחושך במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 450 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. בטל supernatant ולשטוף גלולה עם 5 מיליליטר PBS ללא Ca וMg ו צנטריפוגות שוב ב 450 XG ב 4 ° C כדי להיפטר מכל פתרון lysing שנותר. גלולה המתקבלת בשלב זה מכילה נויטרופילים. Resuspend גלולה ב 30 מיליליטר של 3% הקרים RPMI ולשים על קרח. הערה: 3% RPMI נעשית על ידי השלמת תקשורת RPMI עם 3% שור עוברי סרום (FBS) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא טוהר המדגם באמצעות מכתים מתילן כחול. &gt; 95% של תאים צריכים להיות גרנולוציטים עם גרעינים רב-אוֹנִי. השתמש בכתמי כחולי Trypan לאמת&gt; כדאיות 95% מתאים ולספור את תשואת נויטרופילים הסופית. לדלל נויטרופילים בקרח קר 3% RPMI להשיג ריכוז סופי של 5 x 10 6 מיליליטר / נויטרופילים. </li></ol> 3. רשתות דור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר נויטרופילים עם 500 nM של PMA (לכל 30 מיליליטר של תמיסת נויטרופילים) ודגירה על צלחת 150 x 25mm רקמה שטוחה תרבות עם רשת 20 מ&quot;מ ל4 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. זה יאפשר NETosis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 4 שעות של גירוי, לשאוב בעדינות וזורקים את התקשורת, עוזב את השכבה של רשתות ונויטרופילים דבקו בתחתית. לא לשבש שכבה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בסכום כולל של 15 מיליליטר של PBS הקר בלי Ca וMg לכל צלחת, לשטוף את התחתית של כל מנה על ידי pipetting 15 מיליליטר של PBS על החלק התחתון של המנה, כדי להרים את כל החומר חסיד מהתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף פתרון המתקבל משטיפה כל מנה (שלב 3.3) בצינור חרוטי 15 מיליליטר ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 450 XG ב 4 ° C. נויטרופילים וכל תאים הנותרים גלולה בתחתית, עוזבים supernatant NET-עשיר מחוץ לתא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatant Divide לתוך צינורות 1.5 מיליליטר מיקרו צנטריפוגות וספין במשך 10 דקות ב 18,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. זה יאפשר לכל DNA לגלולה. הערה: צנטריפוגה בtu הגדולBES הוא זמן קל יותר ופחות רב אם מהירויות גבוהות כאלה הן ברי-השגה בצנטריפוגה הרגילה, אחרת יצטרך לחלק supernatants בצינורות קטנים יותר על מנת להשתמש במהירות גבוהה מיקרו צנטריפוגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend כל כדורים שהושגו יחד בקרח הקר PBS לריכוז המתאים 2 x 10 7 נויטרופילים לשל PBS 100 μl. זו תניב מניית NET-התא ללא שיכול לשמש לניסויים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד ריכוז ה- DNA במדגם שהושג באמצעות spectrophotometry או כלי כימות DNA חלופי. ריכוז נאות במדגם צריך לנוע בין 140-180 ng / μl. </li></ol> 4. תא NET-סרטן סטטי הידבקות Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של מניית NET שהושג בעבר לכל גם 100 μl בצלחת תחתונה גם שטוחה 96 ולאפשר לבארות מעיל O / N ב 4 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בין 12 ל 20 שעות מאוחר יותר, לוודא היווצרות monolayer אחיד של תארשתות חופשיות בחלק התחתון של הבארות מתחת למיקרוסקופ (איור 1). בשלב זה, לשאוב בעדינות את כל החומר שאינו חסיד מתוך הבארות, כדי לוודא שלא לשבש את monolayer NET בתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של 1% בסרום שור אלבומין פתרון (BSA) חוסם 100 μl היטב כל אחד ולצאת לh 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק תאי סרטן A549 מבקבוק T-75 של שימוש 2 מיליליטר של 0.25% פתרון טריפסין. ברגע שמנותק, להוסיף 10 מיליליטר של תקשורת A549 לתאים ו צנטריפוגות trypsinized ב 450 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. בטל תאי supernatant וגלולים בתקשורת כדי להשיג ריכוז של 2 x10 4 תאי סרטן לכל 100 מדיה μl. הערה: תאי A549 גדלו בנפרד. בקצרה, תאים בתרבית ומתוחזק בתקשורת F12 DMEM המכיל 10% FBS ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין וטופחו על C 5% CO 2 37 מעלות. ברגע 70 - הושג 80% מפגש תא, הם היו מנותקים באמצעות 0.25% טריפסין- EDTA וresuspended באותה התקשורתשתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי סרטן הכתם באמצעות CFSE על ידי הוספת 1 μl של CFSE לכל מיליליטר של תקשורת ולהשאיר כתם על RT במשך 10 דקות. לאחר הצביעה, צנטריפוגות מטה ב 450 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ואז להשליך תאי supernatant וגלולים בנפח ראשוני של תקשורת כדי להשיג ריכוז של 2 x10 4 תאי סרטן לכל 100 מדיה μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1 של רשתות חסימה, בעדינות לשאוב פתרון חסימה ולהוסיף 2 x10 4 תאים סרטניים בתקשורת, שהוא שווה ערך ל -100 μl, לכל גם על monolayer NET ולאפשר לדבוק במשך 90 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לשאוב בעדינות את התאים ולהוסיף של PBS 100 μl היטב כל אחד לשטוף את כל תאים שאינם חסיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלק מהבארות, להוסיף 1000U של DNAse1 לכל גם במשך 10 דקות לפני הכביסה כדי לבזות רשתות. זה ישמש שליטה שלילית. בבארות אחרות, להוסיף מים סטריליים לכל גם 100 μl במשך 10 דקות, שישמשו כשליטה ברכב (VC). הערה: 3 משכפל לcondition מבוצע בדרך כלל כדי להגדיל את גודל מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולזרוק את כל הפתרון בבארות ומשאירות רק את רשתות ותאים סרטניים חסיד בתחתית. הוספה של 4% תמיסת פורמלדהיד לכל גם 100 μl לתקן תאי סרטן חסיד לרשתות ולקרוא assay תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1). עלילה ולנתח את התוצאות (איור 3). </li></ol>

<ol>
	<li>Saitoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+mediate+a+host+defense+response+to+human+immunodeficiency+virus-1.">Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).</li><li>Bruns, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+extracellular+traps+against+Aspergillus+fumigatus+in+vitro+and+in+infected+lung+tissue+is+dependent+on+invading+neutrophils+and+influenced+by+hydrophobin+RodA.">Production of extracellular traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin RodA.</a> PLoS Pathog. 6 (4), e1000873 (2010).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Papayannopoulos, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETs:+a+new+strategy+for+using+old+weapons.">NETs: a new strategy for using old weapons.</a> Trends Immunol. 30 (11), 513-521 (2009).</li><li>McDonald, B., Urrutia, R., Yipp, B. G., Jenne, C. N., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+neutrophil+extracellular+traps+capture+bacteria+from+the+bloodstream+during+sepsis.">Intravascular neutrophil extracellular traps capture bacteria from the bloodstream during sepsis.</a> Cell Host Microbe. 12 (3), 324-333 (2012).</li><li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus.">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> J Immunol. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li><li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage,+infiltrate+tissues,+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus.">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> J Immunol. 187 (1), 538-552 (2011).</li><li>Khandpur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETs+are+a+source+of+citrullinated+autoantigens+and+stimulate+inflammatory+responses+in+rheumatoid+arthritis.">NETs are a source of citrullinated autoantigens and stimulate inflammatory responses in rheumatoid arthritis.</a> Sci Transl Med. 5 (178), 178ra140 (2013).</li><li>Demers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancers+predispose+neutrophils+to+release+extracellular+DNA+traps+that+contribute+to+cancer-associated+thrombosis.">Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13076-13081 (2012).</li><li>Hahn, S., Giaglis, S., Hoesli, I., Hasler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+NETs+in+reproduction:+from+infertility+to+preeclampsia+and+the+possibility+of+fetal+loss.">Neutrophil NETs in reproduction: from infertility to preeclampsia and the possibility of fetal loss.</a> Front Immunol. 3, 362 (2012).</li><li>Cools-Lartigue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+and+promote+metastasis.">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis.</a> J Clin Invest. , (2013).</li><li>Cools-Lartigue, J., Spicer, J., Najmeh, S., Ferri, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+cancer+progression.">Neutrophil extracellular traps in cancer progression.</a> Cell Mol Life Sci. , (2014).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> J Vis Exp. (36), (2010).</li><li>Maqbool, M., Vidyadaran, S., George, E., Ramasamy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+laboratory+procedures+for+isolating+human+peripheral+blood+derived+neutrophils.">Optimisation of laboratory procedures for isolating human peripheral blood derived neutrophils.</a> Med J Malaysia. 66 (4), 296-299 (2011).</li><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+lymphocytes,+granulocytes+and+macrophages.">Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages.</a> Scand J Immunol. Suppl. 5, 9-15 (1976).</li><li>Calado, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+hormones,+acting+on+the+TERT+gene,+increase+telomerase+activity+in+human+primary+hematopoietic+cells.">Sex hormones, acting on the TERT gene, increase telomerase activity in human primary hematopoietic cells.</a> Blood. 114 (11), 2236-2243 (2009).</li><li>Zhong, C., Qu, X., Tan, M., Meng, Y. G., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+regulation+of+bv8+in+human+blood+cells.">Characterization and regulation of bv8 in human blood cells.</a> Clin Cancer Res. 15 (8), 2675-2684 (2009).</li><li>Wu, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+leukocyte+labeling+with+intravenous+ferumoxides/protamine+sulfate+complex+and+in+vitro+characterization+for+cellular+magnetic+resonance+imaging.">In vivo leukocyte labeling with intravenous ferumoxides/protamine sulfate complex and in vitro characterization for cellular magnetic resonance imaging.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (5), C1698-C1708 (2007).</li><li>Saffarzadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+directly+induce+epithelial+and+endothelial+cell+death:+a+predominant+role+of+histones.">Neutrophil extracellular traps directly induce epithelial and endothelial cell death: a predominant role of histones.</a> PLoS One. 7 (2), e32366 (2012).</li><li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף

פרוטוקול בידוד מלכודת נויטרופילים התאי הפגין בסרטון זה משלב טכניקות שונות המשמשות בספרות לבידוד נויטרופילים והיווצרות NET. זה מפשט את תהליך מורכב למדי ומשתנה ומציע דרך אמינה מאוד ושכפול לבודד את רשתות תא ללא מטוהרים עם פחות שלבים מאשר פרוטוקולים אחרים. יתר על כן, חומ?...

מלכודות תאי נויטרופילים (רשתות) הם שהתגלו לאחרונה אלמנטים הנגזרים נויטרופילים מורכבים מגדילי הדנ&quot;א תאי מעוצבים על ידי מאות חלבונים וההיסטונים. הם מופרשים על ידי נויטרופילים בהקשר של זיהום ודלקת בעקבות גירויים מסוימים והם הוכרו בתחילה להיות חלק ממנגנוני ההגנה של נויטרופילים מפני זיהומים. הם הוצגו לראשונה לקידום לכידה של פולשים חיידקים שונים, כוללים חיידקים, וירוסים ופטריות 1-3. לכידתו של החיידק היה אז להוביל להרס שלו הן באופן ישיר על ידי החלבונים הקשורים NET 3,4 ובעקיפין באמצעות גיוס המקומי של תאי phagocytic 5,6. התפקיד של רשתות עם זאת נראה שלא יהיה מוגבל לארח הגנה. לאחרונה, הם הוכחו לשחק תפקיד חשוב במחלות אוטואימוניות 7,8, פקקת 9, הפרעות הקשורות להריון 10 ואפילו התקדמות הסרטן11,12. בהתאם לכך, נראה כי רשתות לשחק תפקיד חשוב במספר רב של תהליכים פיסיולוגיים שונים. עם זאת, בהתחשב באופי החדשני של מחקר כזה, הרבה עדיין לא הובהר לגבי המנגנונים שבאמצעותם רשתות להפעיל את השפעתם. במסמך זה, אנו מציגים שיטה פשוטה לבידוד של רשתות בהעדר של נויטרופילים. בסרטון הבא, אנחנו מדגימים טכניקה פשוטה וקלה לבודד את רשתות מכל דם אנושי. רשתות תא ללא לאחר מכן ניתן להשתמש במספר הניסויים במבחנה הכולל צביעה, imuunofluorescence, סופגות, כמו גם מספר מבחני כגון הידבקות, הפצה והגירה. פרוטוקולים אחרים קיימים 13, 19, אולם הם בדרך כלל ארוכים, מורכבים, יקרים, ולעתים קרובות, תשואה נמוכה 13. פרוטוקול זה משתמש בחומרים כימיים פשוט בסיסיים ומפחית את מספר הצעדים הנדרשים כדי לבודד נויטרופילים, ולכן צמצום האורך של proceduמחדש תוך מיקסום תשואה. השיטה הבאה משלבת טכניקות שונות לבידוד נויטרופילים שתוארו קודם לכן בספרות להשיג פרוטוקול פשוט מניב מדגם טהור מאוד של נויטרופילים חיים. כפי שהוצע בספרות, דם ורידים נאסף בצינורות EDTA בשימוש בתוך 10 דקות, כדי למנוע הפעלת נויטרופילים 14. אנו משתמשים בצנטריפוגה מדיה הפרדת השיפוע (LSM) צפיפות ימפוציטים לבודד גרנולוציטים ותאי דם אדומים מהדם כל heparinized, שיטה המותאמת מטכניקת צנטריפוגה צפיפות Ficoll תחילה שתוארה על ידי Boyum et al 15. LSM הוא שינוי של ניסוח Boyum שמחליף diatrizoate נתרן לmetrizoate נתרן ושמש בהצלחה במחקרים רבים לבודד נויטרופילים 16-18. בעקבות צנטריפוגה צפיפות ההפרש, מונוציטים ולימפוציטים מבוטלים; לאחר מכן תאי דם אדומים משקעיםבאמצעות 6% פתרון Dextran 14 וRBCs הנותרים lysed להשיג אוכלוסייה של נויטרופילים הטהורים, אשר מאומת עם Trypan כחול וכתמי כחולים מתילן. סוכנים רבים שנעשו שימוש כדי לגרום NETosis הן במבחנה in vivo, כוללים lipopolysaccharide (LPS), ותצטט myristate phorbol (PMA) וinterleukins (IL-8) 3,5,6. בפרוטוקול הבא, נויטרופילים המבודדים מומרצים עם 500 ננומטר PMA במשך 4 שעות, אשר הוכח להיות ריכוז נאות כדי לאפשר היווצרות NET עקבית ואמינה ללא קידום אפופטוזיס 19,20. לאחר בידוד, אנו מדגימים כיצד רשתות תא ללא שהתקבלו מפרוטוקול זה יכול לשמש בassay הידבקות. DNAse1 משמש לעיכול ולבזות רשתות כפי שתואר לעיל ובכך משמש כשליטה 2,3,11. אפשרויות אחרות כוללות את השימוש במעכבי elastase נויטרופילים (ניי) לעכב formati NETב, אשר מהווה חלופה מקובלת כאשר המטרה היא לעכב את היווצרות NET ולא תשפיע שפלתם 11. למרות שניי יש מספר הפונקציות מגוונות, זה כבר הראה בעבר כי בתצהיר NET יכול להיות מעוכב על ידי ניי באמצעות חסימה של decondensation הכרומטין, degranulation הגרעיני ומות נויטרופילים 12

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="983">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:75px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:573px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lymphocyte Separation Medium (LSM)</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">305-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dextran hydrochloride (powder)</td>
			<td style="width:75px;">Spectrum</td>
			<td style="width:119px;">DE130</td>
			<td>6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RPMI-1640 Medium with L-glutamine</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">350-000-CL</td>
			<td>3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">BD Pharm Lyse Lysing buffer</td>
			<td style="width:75px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td style="width:75px;">Sigma-Alrdrich</td>
			<td style="width:119px;">P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse1</td>
			<td>Roche</td>
			<td style="width:119px;">11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F12 DMEM</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">319-075-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:75px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CFSE</td>
			<td style="width:75px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:75px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Integrid tissue culture dish with 20mm grid (150 x 25mm)</td>
			<td style="width:75px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simplified human neutrophil extracellular traps (nets) isolation and handling

מלכודות נויטרופילים התאיות (רשתות) זוהו לאחרונה כחלק מארסנל מיקרוביאלית של נויטרופילים. מלבד תפקידם במלחמה בזיהומים, מחקר שנעשה לאחרונה הראה כי הם עשויים להיות מעורבים בתהליכים רבים מחלה אחרות, ובכלל זה התקדמות הסרטן. בידוד רשתות מטוהרים הוא אלמנט חיוני כדי לאפשר המחקר של פונקציות אלה. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים שיטה פשוטה של ​​בידוד NET תא מתוך כל דם אנושי באמצעות ריאגנטים זמינים. רשתות מבודדות לאחר מכן ניתן להשתמש עבור מכתים immunofluorescence, סופג או מבחני תפקודיים שונים. זה מאפשר הערכה של הנכסים הביולוגיים שלהם בהעדר תופעות של בלבול הפוטנציאליות של נויטרופילים עצמם. טכניקת הפרדת שיפוע צפיפות מועסקת לבודד נויטרופילים מכל דם תורם בריא. אז נויטרופילים מבודדים מומרצים ע&quot;י phorbol 12 myr13-אצטט istate (PMA) כדי לגרום לNETosis. אז נויטרופילים הופעל מבוטלים, ומניית NET-תא ללא מתקבלת. לאחר מכן, אנו מדגימים כיצד מבודדים רשתות ניתן להשתמש בassay הידבקות עם תאי סרטן הריאות אנושיים A549. מניית NET משמשת למעייל הבארות של 96 O צלחת תרבית תאים היטב / תאי A549 N, ולאחר הבטחת היווצרות monolayer NET נאותה בחלק התחתון של הבארות, שכותרתו CFSE מתווספות. תאים חסיד הם לכמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי Nikon TE300. בחלק מהבארות, 1000U DNAse1 מתווסף 10 דקות לפני הספירה להשפיל רשתות

הישג מוצלח של assay הידבקות סטטית עם רשתות דורש ציפוי נאות של הבארות עם monolayer של רשתות לפני התוספת של תאים סרטניים (איור 1). כל הצעדים הבאים חייבים להיעשות בזהירות שלא לפגוע בשכבה ש. כאשר שכבה נאותה של רשתות נוצר, הוא צפוי לראות הידבקות תאים סרטניים משמעותית לרשת?...

Watch this Scientific Journal Video about Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling at JoVE.com

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

בפרוטוקול הבא, אנו מתארים דרך פשוטה מאוד לבודד את מלכודות נויטרופילים תאיות (רשתות) מכל דם אנושי באמצעות ריאגנטים זמינים. לאחר מכן, אנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש ברשתות המבודדות בassay הידבקות במבחנה עם תאים סרטניים.

פשוטה מלכודות תאיות נויטרופילים אדם בידוד (רשתות) וטיפול

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

simplified-human-neutrophil-extracellular-traps-nets-isolation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

29.5K Views.  McGill University.  בפרוטוקול הבא, אנו מתארים דרך פשוטה מאוד לבודד את מלכודות נויטרופילים תאיות (רשתות) מכל דם אנושי באמצעות ריאגנטים זמינים. לאחר מכן, אנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש ברשתות המבודדות בassay הידבקות במבחנה עם תאים סרטניים. 

Video: Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

מלכודות תאי נויטרופילים: כיצד ליצור מדמיינים אותם

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of lipids. The function of lipids (e.g., in host-pathogen interactions or host entry) has been reported to play a crucial role in cellular processes. Here, we show a method to determine lipid composition, with a focus on the cholesterol level of primary blood-derived neutrophils, by HPTLC in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC). The aim was to investigate the role of lipid/cholesterol alterations in the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NET release is known as a host defense mechanism to prevent pathogens from spreading within the host. Therefore, blood-derived human neutrophils were treated with methyl-&#946;-cyclodextrin (M&#946;CD) to induce lipid alterations in the cells. Using HPTLC and HPLC, we have shown that M&#946;CD treatment of the cells leads to lipid alterations associated with a significant reduction in the cholesterol content of the cell. At the same time, M&#946;CD treatment of the neutrophils led to the formation of NETs, as shown by immunofluorescence microscopy. In summary, here we present a detailed method to study lipid alterations in neutrophils and the formation of NETs.

Lipids are known to play an important role in cellular functions. Here, we describe a method to determine the lipid composition of neutrophils, with emphasis on the cholesterol level, by using both HPTLC and HPLC to gain a better understanding of the underlying mechanisms of neutrophil extracellular trap formation.

שיטות לחקר ליפידים שינויים נויטרופילים ואת הגיבוש העוקב של נויטרופילים תאיים מלכוד

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

להמחיש מלכודות חוץ-תאי מקרופאג באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. Immunofluorescence microscopy and image-based quantification methods remain important tools to quantitate neutrophil extracellular trap formation. However, there are key limitations to the immunofluorescence-based methods that are currently available for quantifying NETs. Manual methods of image-based NET quantification are often subjective, prone to error and tedious for users, especially non-experienced users. Also, presently available software options for quantification are either semi-automatic or require training prior to operation. Here, we demonstrate the implementation of an automated immunofluorescence-based image quantification method to evaluate NET formation called NETQUANT. The software is easy to use and has a user-friendly graphical user interface (GUI). It considers biologically relevant parameters such as an increase in the surface area and DNA:NET marker protein ratio, and nuclear deformation to define NET formation. Furthermore, this tool is built as a freely available app, and allows for single-cell resolution quantification and analysis.

Here, we present a protocol for generating neutrophil extracellular traps (NETs) and operating NETQUANT, a fully automatic software option for quantification of NETs in immunofluorescence images.

הדמית מבוססת תמונה אוטומטית של מלכודות נויטרופילים באמצעות NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by neutrophils in response to systemic inflammation or pathogens. Although NETs have previously been shown to augment clot formation and inhibit fibrinolysis in humans and dogs, the role of NETs in cats with cardiogenic arterial thromboembolism (CATE), a life-threatening complication secondary to hypertrophic cardiomyopathy, is unknown. A standardized method to identify and quantify NETs in cardiogenic arterial thrombi in cats will advance our understanding of their pathological role in CATE. Here, we describe a technique to identify NETs in formaldehyde-fixed and paraffin-embedded thrombi within the aortic bifurcation, extracted during necropsy. Following deparaffinization with xylene, aortic sections underwent indirect heat-induced antigen retrieval. Sections were then blocked, permeabilized, and ex vivo NETs were identified by colocalization of cell-free DNA (cfDNA), citrullinated histone H3 (citH3), and neutrophil elastase (NE) using immunofluorescence microscopy. To optimize the immunodetection of NETs in thrombi, autofluorescence of tissue elements was limited by using an autofluorescence quenching process prior to microscopy. This technique could be a useful tool to study NETs and thrombosis in other species and offers new insights into the pathophysiology of this complex condition.

We describe a method to identify neutrophil extracellular traps (NETs) in formaldehyde-fixed and paraffin-embedded feline cardiogenic arterial thrombi using heat-induced antigen retrieval and a double immunolabeling protocol.

זיהוי של המלכודות נויטרופילים מסחטות ב פרפין-מוטבע בעורקים בעורק החתולים באמצעות מיקרוסקופ אימונולומוטורנציה

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). This study analyzes the morphological and compositional changes in NETs induced by microbial and chemical stimuli using standardized in vitro methodologies for NET induction and characterization with human cells. The procedures described here allow the analysis of NET morphology (lytic or non-lytic) and composition (DNA-protein structures and enzymatic activity), and the effect of soluble factors or cellular contact on such characteristics. Additionally, the techniques described here could be modified to evaluate the effect of exogenous soluble factors or cellular contact on NET composition.
The applied techniques include the purification of polymorphonuclear cells from human peripheral blood using a double density gradient (1.079-1.098 g/mL), guaranteeing optimal purity and viability (&#8805; 95%) as demonstrated by Wright's staining, trypan blue exclusion, and flow cytometry, including FSC versus SSC analysis and 7AAD staining. NET formation is induced with microbial (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, and Candida albicans) and chemical (phorbol myristate acetate, HOCl) stimuli, and the NETs are characterized by DNA-DAPI staining, immunostaining for the antimicrobial peptide cathelicidin (LL37), and quantification of enzymatic activity (neutrophil elastase, cathepsin G, and myeloperoxidase). The images are acquired through fluorescence microscopy and analyzed with ImageJ.

Presented here is a protocol for the induction and analysis of in vitro neutrophil extracellular traps (NETs). Quantification of DNA, cathelicidin (LL37), and enzyme activity yielded data that show the variability in the composition and morphology of NETs induced by microbial and chemical stimuli under similar controlled conditions.

ניתוח מורפולוגי וקומפוזיציוני של מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות המושרות על ידי גירויים מיקרוביאליים וכימיים

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures composed of DNA with granule proteins, such as myeloperoxidase (MPO) and neutrophil elastase (NE), and cytoplasmic and cytoskeletal proteins. Although interest in NETs has increased recently, no sensitive, reliable assay method is available for measuring NETs in clinical settings. This article describes a modified sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to quantitatively measure two components of circulating NETs, MPO-DNA and NE-DNA complexes, which are specific components of NETs and are released into the extracellular space as breakdown products of NETs. The assay uses specific monoclonal antibodies for MPO or NE as the capture antibodies and a DNA-specific detection antibody. MPO or NE binds to one site of the capture antibody during the initial incubation of samples containing MPO-DNA or NE-DNA complexes. This assay shows good linearity and high inter-assay and intra-assay precision. We used it in 16 patients with COVID-19 with accompanying acute respiratory distress syndrome and found that the plasma concentrations of MPO-DNA and NE-DNA were significantly higher than in the plasma obtained from healthy controls. This detection assay is a reliable, highly sensitive, and useful method for investigating the characteristics of NETs in human plasma and culture supernatants.

We present a protocol for a modified sandwich enzyme-linked immunosorbent assay technique to quantitatively measure two components of neutrophil extracellular trap remnants, myeloperoxidase conjugated-DNA and neutrophil elastase conjugated-DNA complexes,derived from activated neutrophils.

כימות קומפלקסים של Myeloperoxidase-DNA ו-Neutrophil Elastase-DNA ממלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים באמצעות כריך ELISA שעבר שינוי

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

צביעה והדמיה כדי להמחיש מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in autoimmune diseases and sterile inflammation. They are web-like structures composed of double-stranded DNA filaments, histones, and antimicrobial proteins. Once released, NETs can trap and kill extracellular pathogens in blood and tissue. Furthermore, NETs participate in homeostatic regulation by stimulating platelet adhesion and coagulation. However, the dysregulated production of NETs has also been associated with various diseases, including sepsis or autoimmune disorders, which makes them a promising target for therapeutic intervention. Apart from electron microscopy, visualizing NETs using immunofluorescence imaging is currently one of the only known methods to demonstrate NET interactions in tissue. Therefore, various staining methods to visualize NETs have been utilized. In the literature, different staining protocols are described, and we identified four key components showing high variability between protocols: (1) the types of antibodies used, (2) the usage of autofluorescence-reducing agents, (3) antigen retrieval methods, and (4) permeabilization. Therefore, in vitro immunofluorescence staining protocols were systemically adapted and improved in this work to make them applicable for different species (mouse, human) and tissues (skin, intestine, lung, liver, heart, spinal disc). After fixation and paraffin-embedding, 3 &#181;m thick sections were mounted onto slides. These samples were stained with primary antibodies for myeloperoxidase (MPO), citrullinated histone H3 (H3cit), and neutrophil elastase (NE) according to a modified staining protocol. The slides were stained with secondary antibodies and examined using a widefield fluorescence microscope. The results were analyzed according to an evaluation sheet, and differences were recorded semi-quantitatively.
Here, we present an optimized NET staining protocol suitable for different tissues. We used a novel primary antibody to stain for H3cit and reduced non-specific staining with an autofluorescence-reducing agent. Furthermore, we demonstrated that NET staining requires a constant high temperature and careful handling of samples.

מחבר זרקור: דימות מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים ברקמות אדם ועכבר 

Neutrophil extracellular traps (NETs) are associated with various diseases, and immunofluorescence is often used for their visualization. However, there are various staining protocols, and, in many cases, only one type of tissue is examined. Here, we establish a generally applicable protocol for staining NETs in mouse and human tissue.

הדמיה אימונופלואורסצנטית של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים ברקמות אדם ועכבר

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...