The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.

HINWEIS: Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den lokalen institutionellen ethischen Richtlinien durchgeführt. 1. Blut Zeichnung <ol><li> Durch Ellen venipucture, sammeln 14 Röhrchen Blut von einem gesunden Freiwilligen in grüne Spitze (Heparin) Röhrchen und Invertzucker jedes Rohr, bevor sie sich auf dem Eis. Sammeln Blut innerhalb von 10 bis 15 min von Experiment, um eine optimale Neutrophilen Ausbeute zu gewährleisten. </li></ol> 2. Neutrophile Isolierung aus Vollblut <ol><li> Waschen Sie jedes grüne Spitze Blutröhrchen mit 5 ml PBS ohne Ca und Mg, um das Blut zu verdünnen. In jeder der 4 x 50 ml konische Röhrchen werden 15 ml der Lymphozytentrennmedien (LSM) bei RT. Mit einer 18 G-Nadel auf einem 60-ml-Spritze montiert, sorgfältig Schicht des verdünnten Blut auf den LSM, die Schaffung einer starken LSM-Blut-Schnittstelle. HINWEIS: Verwechseln der Schichten so weit wie möglich. </li><li> Zentrifuge bei 800 xg für 30 Minuten bei 21 ° C, ohne Pause. HINWEIS: Sudden Pausen könnenein Mischen der verschiedenen Schichten. </li><li> Beachten Sie die Erythrozyten und Neutrophilen Sediment am Boden. Absaugen und entsorgen Sie die oberen zwei Schichten (Plasma und LSM) und achten Sie auf der Grenzfläche zwischen diesen Schichten, die Lymphozyten und mononukleären Zellen enthält loszuwerden, so dass nur die untere rote Schicht. </li><li> In jedes Röhrchen werden 20 ml Phosphatpuffer-Saline (PBS) und 20 ml 6% iger Dextranlösung. Vorsichtig umdrehen jedes Rohr mit der Schicht aus Erythrozyten und Neutrophilen vermischen und bei Raumtemperatur 30 min stehen. HINWEIS: Dies ermöglicht es den roten Blutkörperchen (Erythrozyten), um am Ende zu sedimentieren. </li><li> Nach 30 Minuten überweisen Sie den Neutrophilen reiche Überstand in frische Röhrchen und entsorgen Sie die RBC-Pellets. Zentrifugenüberstände bei 450 × g bei 4 ° C für 5 min. Nach dem Zentrifugieren Überstand verwerfen. Das Pellet wird zumeist Neutrophilen und einigen roten Blutkörperchen enthalten. </li><li> Vorbereiten einer lysierenden Lösung durch Zugabe von 0,5 ml Lyse-Puffer und 4,5 ml steriles Wasser. Lyse verbleibenden RBC mit ter bereit 5 ml Lyse-Lösung, Übertragung aller resuspendierten Pellets in ein Rohr. Zulassen Lyse bei RT im Dunkeln für 10 min. </li><li> Zentrifuge bei 450 × g bei 4 ° C für 5 min. Überstand verwerfen und Pellet Waschen mit 5 ml PBS ohne Ca und Mg und erneut zentrifugieren bei 450 × g bei 4 ° C zu einer restlichen Lyselösung loszuwerden. Die an dieser Stelle erhaltene Pellet enthält die Neutrophilen. Das Pellet in 30 ml kalter 3% RPMI und setzen auf Eis. HINWEIS: 3% RPMI wird durch Hinzu RPMI Medium mit gemacht 3% fötales Rinderserum (FBS) </li><li> Verifizieren Reinheit der Probe unter Verwendung von Methylenblau-Färbung. &gt; 95% der Zellen sollten Granulozyten mit mehr lobar Kerne sein. Verwenden Trypanblaufärbung um zu überprüfen,&gt; 95% Lebensfähigkeit der Zellen und zählen Sie die letzte Neutrophilen Ausbeute. Verdünne Neutrophilen in eiskalter 3% RPMI bis zu einer Endkonzentration von 5 x 10 6 Neutrophile / ml zu erhalten. </li></ol> 3. NETs-Generation <ol><li> Stimulieren Neutrophilen mit 500 nM PMA (pro 30 ml der Neutrophilen-Lösung) und Inkubieren auf einem 150 x 25 mm flachen Gewebekulturschale mit 20 mm-Raster für 4 h bei 37 ° C 5% CO 2. Dies wird NETosis ermöglichen. </li><li> Nach 4 Stunden der Stimulation vorsichtig absaugen und entsorgen Sie die Medien, so dass die Schicht von NETs und Neutrophilen an der Unterseite befestigt. Stören Sie nicht diese Schicht. </li><li> Mit insgesamt 15 ml kaltem PBS ohne Ca und Mg pro Schale, waschen Sie den unteren Rand jeder Schale durch Pipettieren von 15 ml PBS auf dem Boden der Schale, um vom Boden abzuheben alle haftenden Material. </li><li> Sammeln von Waschen jedes Gericht (Schritt 3.3) in einem 15 ml konischen Rohr und Zentrifuge für 10 Minuten bei 450 × g bei 4 ° C erhaltenen Lösung. Neutrophile und die verbleibenden Zellen werden am unteren Rand zu pelletieren, so dass eine zellfreie NET-reiche Überstand. </li><li> Dividieren Überstand in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Spinn für 10 min bei 18.000 × g bei 4 ° C. Auf diese Weise können alle DNA zu pelletieren. HINWEIS: Die Zentrifugation in größeren tubes ist einfacher und weniger zeitaufwendig, wenn eine solche hohe Geschwindigkeiten erreichbar sind auf den regulären Zentrifuge, sonst müssen die Überstände in kleinere Rohre, um Hochgeschwindigkeitsmikrozentrifuge verwenden teilen. </li><li> Überstand verwerfen und Resuspendieren alle in eiskaltem PBS auf eine Konzentration, die 2 x 10 7 Neutrophilen je 100 ul PBS zusammen erhaltenen Pellets. Dies wird die zellfreie NET Lager, die für nachfolgende Experimente verwendet werden können erhalten. </li><li> Messen DNA-Konzentration in der Verwendung von Spektrophotometrie oder alternative DNA Quantifizierungswerkzeug erhaltenen Probe. 180 ng / ul - Eine ausreichende Konzentration in der Probe sollte zwischen 140 reichen. </li></ol> 4. NET-Krebszelle Static Adhäsionsassay <ol><li> 100 l des zuvor erhaltenen NET Lager pro Vertiefung einer 96-Well-Flachbodenplatte und ermöglichen die Beschichtung Brunnen O / N bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Zwischen 12 und 20 Stunden später überprüfen Bildung einer einheitlichen Monolage von Zellenfreie NETs am Boden der Vertiefungen unter dem Mikroskop (Figur 1). An dieser Stelle vorsichtig aspirieren alle nicht haftenden Materials aus den Brunnen, um sicherzustellen, nicht auf die NET-Monoschicht an der Unterseite zu stören. </li><li> Füge 100 ul 1% Rinderserumalbumin (BSA) Blockierungslösung in jede Vertiefung und lassen für 1 h bei RT. </li><li> Nehmen A549 Krebszellen von einem T-75-Kolben verwenden 2 ml 0,25% Trypsin-Lösung. Einmal gelöst, 10 ml A549 Medien trypsiniert Zellen und Zentrifuge bei 450 × g bei 4 ° C für 5 min. Überstand verwerfen und die Zellen in Medien, um eine Konzentration von 2 x 10 4 Tumorzellen pro 100 &amp; mgr; l Medium zu erhalten. HINWEIS: A549-Zellen wurden getrennt gezüchtet. Kurz gesagt, wurden Zellen kultiviert und in DMEM F12-Medium, das 10% FBS und 1% Penicillin Streptomycin und bei 37 ° C 5% CO 2 inkubiert gehalten. Nachdem 70 bis 80% Zellkonfluenz erreicht worden war, unter Verwendung von 0,25% Trypsin-EDTA abgelöst und sie in dem gleichen Medium resuspendiertoben beschrieben. </li><li> Stain Krebszellen mit CFSE durch Zugabe von 1 ul CFSE pro ml Medium und lassen bei RT für 10 Minuten zu färben. Nach dem Färben Zentrifuge nach unten bei 450 × g bei 4 ° C für 5 min, dann Überstand verwerfen und die Zellen in anfänglichen Volumens von Medien, um eine Konzentration von 2 x 10 4 Tumorzellen pro 100 &amp; mgr; l Medium zu erhalten. </li><li> Nach 1 h NETs Blockierung leicht absaugen Blockierungslösung und mit 2 x 10 4 Tumorzellen in Medium, die äquivalent zu 100 &amp; mgr; l ist, pro Vertiefung über das Netz Monoschicht und lassen für 90 min bei 37 ° C 5% CO 2 anhaften. Vorsichtig aspirieren die Zellen und mit 100 ul PBS in jede Vertiefung, alle nicht-adhärenten Zellen zu waschen. </li><li> In einigen Brunnen, fügen 1000U der DNAse1 pro Vertiefung für 10 Minuten vor dem Waschen zu NETs beeinträchtigen. Dies wird als negative Kontrolle dienen. Mit anderen Brunnen, fügen 100 ul sterilem Wasser pro Vertiefung für 10 Minuten, die als die Fahrzeugsteuerung (VC) dienen wird. HINWEIS: 3 Wiederholungen pro condition sind in der Regel durchgeführt, um Stichprobengröße zu erhöhen. </li><li> Absaugen und entsorgen Sie alle Lösung in die Vertiefungen so dass nur NETs und haftende Krebszellen an der Unterseite. 100 l 4% Formaldehydlösung pro Vertiefung zu adhärenten Krebszellen zu reparieren und NETS Ableseassay unter dem Fluoreszenzmikroskop (Bild 1). Plot und Analyse der Ergebnisse (Abbildung 3). </li></ol>

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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren

Das Neutrophil Extracellular-Falle Isolierungsprotokoll in diesem Video gezeigt, kombiniert verschiedene Techniken, die in der Literatur für neutrophile Isolation und NET Bildung verwendet. Es vereinfacht eine ziemlich komplexe und variable Prozess und bietet eine sehr zuverlässige und reproduzierbare Weise gereinigt zellfreien NETs mit weniger Schritte als andere Protokolle zu isolieren. Außerdem werden leicht erhältliche Reagenzien Zugabe verwendet, um die Protokolle der Einfachheit und die Kosten deutlich reduzie...

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) sind neu entdeckte Neutrophilen stammenden Elemente der Stränge der extrazelluläre DNA von Hunderten von Proteinen und Histone dekoriert zusammen. Sie werden von Neutrophilen im Rahmen von Infektionen und Entzündungen folgende spezifische Reize sezerniert und Erstverbuchung galt, einen Teil der neutrophilen Abwehrmechanismen gegen Infektionen. Sie wurden erstmals gezeigt, dass das Einfangen von verschiedenen mikrobiellen Eindringlinge wie Bakterien, Viren und Pilze 1-3 fördern. Überfüllung der Mikrobe würde dann führen zu seiner Zerstörung sowohl direkt durch NET-assoziierten Proteinen 3,4 und indirekt über lokale Rekrutierung von Phagozyten 5,6. Die Rolle der NETs jedoch scheint nicht beschränkt auf die Verteidigung zu hosten. In jüngerer Zeit haben sie gezeigt, eine wichtige Rolle bei Autoimmunerkrankungen spielen 7,8, Thrombose 9, schwangerschaftsbedingten Störungen 10 und sogar Krebsprogression11,12. Dementsprechend scheint es, daß NETs spielen eine wichtige Rolle in einer großen Anzahl von verschiedenen physiologischen Prozessen. Angesichts der Neuartigkeit dieser Forschung, bleibt noch viel zu in Bezug auf die Mechanismen, durch die NETs ihre Wirkungen ausüben aufgeklärt werden. Hier berichten wir über ein vereinfachtes Verfahren für die Isolierung von NETs in der Abwesenheit von Neutrophilen. Im folgenden Video zeigen wir, eine vereinfachte und einfache Technik, um NETs aus humanem Vollblut zu isolieren. Zellfreie NETs kann dann in einer Reihe von in vitro-Versuche, einschließlich der Färbung imuunofluorescence verwendet werden, Blotting sowie eine Anzahl von Tests, wie Adhäsion, Proliferation und Migration. Andere Protokolle existieren 13, 19, sie sind jedoch in der Regel langwierig, komplex, teuer und oft geringe Ausbeute 13. Diese vereinfachte Protokoll verwendet basischen Reagenzien, und verringert die Anzahl der erforderlichen Schritte, um Neutrophile zu isolieren, damit die Minimierung der Länge des procedure bei gleichzeitiger Maximierung Ausbeute. Das folgende Verfahren kombiniert verschiedene Techniken zur Isolation neutrophiler zuvor in der Literatur beschrieben, um ein einfaches Protokoll, wodurch eine sehr reine Probe lebender Neutrophilen erhalten. Wie in der Literatur vorgeschlagen wird venöses Blut in EDTA-Röhrchen gesammelt und innerhalb von 10 min verwendet, um die Aktivierung von Neutrophilen 14 zu vermeiden. Wir verwenden Lymphocyte Separation Medien (LSM) Dichtegradientenzentrifugation Granulozyten und Erythrozyten aus heparinisiertem Vollblut, ein Verfahren von der Ficoll-Dichtezentrifugation Technik zunächst Boyum et al 15 beschrieben angepasst isolieren. LSM ist eine Modifikation des Boyum Formulierung, Natriumdiatrizoat substituiert den Natrium Metrizoat und erfolgreich in vielen Studien verwendet worden, um Neutrophile 16-18 zu isolieren. Folgende Differential Dichtezentrifugation, Monozyten und Lymphozyten werden verworfen; roten Blutzellen werden dann sedimentiertVerwendung einer 6% Dextran-Lösung 14 und die verbleibenden RBCs lysiert, um eine Population von reinem Neutrophile, die mit Trypanblau und Methylenblau-Färbung verifiziert erhalten. Zahlreiche Mittel wurden zur NETosis sowohl in vitro und in vivo zu induzieren, einschließlich Lipopolysacchariden (LPS) und Phorbolmyristatacetat (PMA) und Interleukine (IL-8) 3,5,6. In dem folgenden Protokoll werden isolierte Neutrophilen mit 500 nM PMA für 4 h, was gezeigt wurde, dass eine ausreichende Konzentration, um konsistente und zuverlässige NET Bildung ohne die Förderung der Apoptose 19,20 ermöglichen stimuliert. Nach Isolierung, zeigen wir, wie zellfreien NETs diesem Protokoll erhalten wird, kann in einem Adhäsionstest verwendet werden. DNAse1 verwendet zu verdauen und zu zersetzen NETs, ​​wie zuvor beschrieben, und dient als Kontrolle 2,3,11 somit. Weitere Optionen sind die Verwendung von Neutrophilen-Elastase-Inhibitor (NEI), um NET formati hemmenauf, die eine akzeptable Alternative, wenn das Ziel ist, die NET Bildung anstatt hemmen bewirken deren Abbau 11 ist. Obwohl NEi hat eine Reihe von unterschiedlichen Funktionen hat sich bereits gezeigt, dass NET Abscheidung kann durch NEi durch Blockade der Chromatindekondensation, Kern Degranulation von Neutrophilen und Tod 12 gehemmt werden

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="983">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:75px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:573px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lymphocyte Separation Medium (LSM)</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">305-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dextran hydrochloride (powder)</td>
			<td style="width:75px;">Spectrum</td>
			<td style="width:119px;">DE130</td>
			<td>6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RPMI-1640 Medium with L-glutamine</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">350-000-CL</td>
			<td>3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">BD Pharm Lyse Lysing buffer</td>
			<td style="width:75px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td style="width:75px;">Sigma-Alrdrich</td>
			<td style="width:119px;">P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse1</td>
			<td>Roche</td>
			<td style="width:119px;">11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F12 DMEM</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">319-075-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:75px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CFSE</td>
			<td style="width:75px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:75px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Integrid tissue culture dish with 20mm grid (150 x 25mm)</td>
			<td style="width:75px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simplified human neutrophil extracellular traps (nets) isolation and handling

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) sind vor kurzem im Rahmen der antimikrobiellen Rüstzeug der Neutrophilen zu hinterlassen. Neben ihrer Rolle bei der Bekämpfung von Infektionen haben jüngere Untersuchungen gezeigt, dass sie in vielen anderen Krankheitsprozessen, einschließlich Tumorprogression beteiligt sind. Isolieren von gereinigtem NETs ist ein wesentliches Element, um das Studium dieser Funktionen zu ermöglichen. In diesem Video zeigen wir, ein vereinfachtes Verfahren zur zellfreien NET Isolierung aus humanem Vollblut unter Verwendung leicht verfügbarer Reagenzien. Isolierte NETs kann dann für die Immunfluoreszenzfärbung Blotting oder verschiedenen funktionellen Assays verwendet werden. Dies ermöglicht eine Bewertung ihrer biologischen Eigenschaften in Abwesenheit des potenziellen confounding Wirkungen Neutrophile selbst. Ein Dichtegradient-Trenntechnik verwendet wird, um Neutrophile von gesunden Spender Vollblut zu isolieren. Isolierte Neutrophile werden dann von Phorbol-12-myr stimuliertistate 13-Acetat (PMA) zu NETosis induzieren. Aktivierten Neutrophilen werden dann verworfen, und eine zellfreie NET Lager erhalten wird. Dann zeigt, wie isolierte Netze können in einem Adhäsionstest mit menschlichen A549-Lungenkrebszellen verwendet werden. Die NET-Aktie zur Beschichtung die Vertiefungen einer 96-Well-Zellkulturplatte O / N, und nach Gewährleistung eines angemessenen NET Monoschichtbildung auf dem Boden der Vertiefungen, beschriftet CFSE A549-Zellen zugegeben. Adhärente Zellen werden quantifiziert unter Verwendung eines Nikon TE300 Fluoreszenzmikroskop. In einigen Brunnen, wird 1000U DNAse1 10 Minuten vor dem Zählen zu NETs abbauen hinzugefügt

Erfolgreiches Erreichen eines statischen Adhäsionsassay mit Netzen erfordert eine adäquate Beschichtung der Vertiefungen mit einer Monoschicht von NETs vor der Zugabe von Krebszellen (Abbildung 1). Alle weiteren Schritte müssen mit Vorsicht durchgeführt, um diese Schicht nicht stören werden. Wenn eine ausreichende Schicht NETs gebildet ist, wird erwartet, dass signifikante Krebszellen Haftung an NETs, ​​wie in 2A und 2C gesehen zu werden. Dieser Effekt wird dur...

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Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Im folgenden Protokoll beschreiben wir eine sehr einfache Möglichkeit, Neutrophil Extracellular Traps (NETs) aus humanem Vollblut unter Verwendung leicht verfügbarer Reagenzien zu isolieren. Dann zeigt, wie die isolierten Netze können in einem in vitro-Adhäsionstest mit Krebszellen verwendet werden.

Vereinfachte Menschen Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolierung und Handhabung

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

29.6K Aufrufe.  McGill University.  Im folgenden Protokoll beschreiben wir eine sehr einfache Möglichkeit, Neutrophil Extracellular Traps (NETs) aus humanem Vollblut unter Verwendung leicht verfügbarer Reagenzien zu isolieren. Dann zeigt, wie die isolierten Netze können in einem in vitro-Adhäsionstest mit Krebszellen verwendet werden. 

Serie: Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps: So erzeugen und zu visualisieren

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of lipids. The function of lipids (e.g., in host-pathogen interactions or host entry) has been reported to play a crucial role in cellular processes. Here, we show a method to determine lipid composition, with a focus on the cholesterol level of primary blood-derived neutrophils, by HPTLC in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC). The aim was to investigate the role of lipid/cholesterol alterations in the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NET release is known as a host defense mechanism to prevent pathogens from spreading within the host. Therefore, blood-derived human neutrophils were treated with methyl-&#946;-cyclodextrin (M&#946;CD) to induce lipid alterations in the cells. Using HPTLC and HPLC, we have shown that M&#946;CD treatment of the cells leads to lipid alterations associated with a significant reduction in the cholesterol content of the cell. At the same time, M&#946;CD treatment of the neutrophils led to the formation of NETs, as shown by immunofluorescence microscopy. In summary, here we present a detailed method to study lipid alterations in neutrophils and the formation of NETs.

Lipids are known to play an important role in cellular functions. Here, we describe a method to determine the lipid composition of neutrophils, with emphasis on the cholesterol level, by using both HPTLC and HPLC to gain a better understanding of the underlying mechanisms of neutrophil extracellular trap formation.

Methoden Lipidveränderungen in Neutrophilen und die anschließende Bildung von Neutrophilen Extracellular Traps zu studieren

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

Visualisierung von Makrophagen extrazelluläre fallen mit der konfokalen Mikroskopie

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. Immunofluorescence microscopy and image-based quantification methods remain important tools to quantitate neutrophil extracellular trap formation. However, there are key limitations to the immunofluorescence-based methods that are currently available for quantifying NETs. Manual methods of image-based NET quantification are often subjective, prone to error and tedious for users, especially non-experienced users. Also, presently available software options for quantification are either semi-automatic or require training prior to operation. Here, we demonstrate the implementation of an automated immunofluorescence-based image quantification method to evaluate NET formation called NETQUANT. The software is easy to use and has a user-friendly graphical user interface (GUI). It considers biologically relevant parameters such as an increase in the surface area and DNA:NET marker protein ratio, and nuclear deformation to define NET formation. Furthermore, this tool is built as a freely available app, and allows for single-cell resolution quantification and analysis.

Here, we present a protocol for generating neutrophil extracellular traps (NETs) and operating NETQUANT, a fully automatic software option for quantification of NETs in immunofluorescence images.

Automatisierte bildbasierte Quantifizierung von neutrophilen extrazellulären Fallen mit NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by neutrophils in response to systemic inflammation or pathogens. Although NETs have previously been shown to augment clot formation and inhibit fibrinolysis in humans and dogs, the role of NETs in cats with cardiogenic arterial thromboembolism (CATE), a life-threatening complication secondary to hypertrophic cardiomyopathy, is unknown. A standardized method to identify and quantify NETs in cardiogenic arterial thrombi in cats will advance our understanding of their pathological role in CATE. Here, we describe a technique to identify NETs in formaldehyde-fixed and paraffin-embedded thrombi within the aortic bifurcation, extracted during necropsy. Following deparaffinization with xylene, aortic sections underwent indirect heat-induced antigen retrieval. Sections were then blocked, permeabilized, and ex vivo NETs were identified by colocalization of cell-free DNA (cfDNA), citrullinated histone H3 (citH3), and neutrophil elastase (NE) using immunofluorescence microscopy. To optimize the immunodetection of NETs in thrombi, autofluorescence of tissue elements was limited by using an autofluorescence quenching process prior to microscopy. This technique could be a useful tool to study NETs and thrombosis in other species and offers new insights into the pathophysiology of this complex condition.

We describe a method to identify neutrophil extracellular traps (NETs) in formaldehyde-fixed and paraffin-embedded feline cardiogenic arterial thrombi using heat-induced antigen retrieval and a double immunolabeling protocol.

Identifizierung von Neutrophilen extrazellulären Fallen in Paraffin-Embedded Feline Arteriellen Thrombi mittels Immunfluoreszenzmikroskopie

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). This study analyzes the morphological and compositional changes in NETs induced by microbial and chemical stimuli using standardized in vitro methodologies for NET induction and characterization with human cells. The procedures described here allow the analysis of NET morphology (lytic or non-lytic) and composition (DNA-protein structures and enzymatic activity), and the effect of soluble factors or cellular contact on such characteristics. Additionally, the techniques described here could be modified to evaluate the effect of exogenous soluble factors or cellular contact on NET composition.
The applied techniques include the purification of polymorphonuclear cells from human peripheral blood using a double density gradient (1.079-1.098 g/mL), guaranteeing optimal purity and viability (&#8805; 95%) as demonstrated by Wright's staining, trypan blue exclusion, and flow cytometry, including FSC versus SSC analysis and 7AAD staining. NET formation is induced with microbial (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, and Candida albicans) and chemical (phorbol myristate acetate, HOCl) stimuli, and the NETs are characterized by DNA-DAPI staining, immunostaining for the antimicrobial peptide cathelicidin (LL37), and quantification of enzymatic activity (neutrophil elastase, cathepsin G, and myeloperoxidase). The images are acquired through fluorescence microscopy and analyzed with ImageJ.

Presented here is a protocol for the induction and analysis of in vitro neutrophil extracellular traps (NETs). Quantification of DNA, cathelicidin (LL37), and enzyme activity yielded data that show the variability in the composition and morphology of NETs induced by microbial and chemical stimuli under similar controlled conditions.

Morphologische und kompositorische Analyse von neutrophilen extrazellulären Fallen, die durch mikrobielle und chemische Reize induziert werden

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures composed of DNA with granule proteins, such as myeloperoxidase (MPO) and neutrophil elastase (NE), and cytoplasmic and cytoskeletal proteins. Although interest in NETs has increased recently, no sensitive, reliable assay method is available for measuring NETs in clinical settings. This article describes a modified sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to quantitatively measure two components of circulating NETs, MPO-DNA and NE-DNA complexes, which are specific components of NETs and are released into the extracellular space as breakdown products of NETs. The assay uses specific monoclonal antibodies for MPO or NE as the capture antibodies and a DNA-specific detection antibody. MPO or NE binds to one site of the capture antibody during the initial incubation of samples containing MPO-DNA or NE-DNA complexes. This assay shows good linearity and high inter-assay and intra-assay precision. We used it in 16 patients with COVID-19 with accompanying acute respiratory distress syndrome and found that the plasma concentrations of MPO-DNA and NE-DNA were significantly higher than in the plasma obtained from healthy controls. This detection assay is a reliable, highly sensitive, and useful method for investigating the characteristics of NETs in human plasma and culture supernatants.

We present a protocol for a modified sandwich enzyme-linked immunosorbent assay technique to quantitatively measure two components of neutrophil extracellular trap remnants, myeloperoxidase conjugated-DNA and neutrophil elastase conjugated-DNA complexes,derived from activated neutrophils.

Quantifizierung von Myeloperoxidase-DNA- und neutrophilen Elastase-DNA-Komplexen aus extrazellulären Neutrophilenfallen unter Verwendung eines modifizierten Sandwich-ELISA

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Färbung und Bildgebung zur Visualisierung extrazellulärer Fallen von Neutrophilen

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in autoimmune diseases and sterile inflammation. They are web-like structures composed of double-stranded DNA filaments, histones, and antimicrobial proteins. Once released, NETs can trap and kill extracellular pathogens in blood and tissue. Furthermore, NETs participate in homeostatic regulation by stimulating platelet adhesion and coagulation. However, the dysregulated production of NETs has also been associated with various diseases, including sepsis or autoimmune disorders, which makes them a promising target for therapeutic intervention. Apart from electron microscopy, visualizing NETs using immunofluorescence imaging is currently one of the only known methods to demonstrate NET interactions in tissue. Therefore, various staining methods to visualize NETs have been utilized. In the literature, different staining protocols are described, and we identified four key components showing high variability between protocols: (1) the types of antibodies used, (2) the usage of autofluorescence-reducing agents, (3) antigen retrieval methods, and (4) permeabilization. Therefore, in vitro immunofluorescence staining protocols were systemically adapted and improved in this work to make them applicable for different species (mouse, human) and tissues (skin, intestine, lung, liver, heart, spinal disc). After fixation and paraffin-embedding, 3 &#181;m thick sections were mounted onto slides. These samples were stained with primary antibodies for myeloperoxidase (MPO), citrullinated histone H3 (H3cit), and neutrophil elastase (NE) according to a modified staining protocol. The slides were stained with secondary antibodies and examined using a widefield fluorescence microscope. The results were analyzed according to an evaluation sheet, and differences were recorded semi-quantitatively.
Here, we present an optimized NET staining protocol suitable for different tissues. We used a novel primary antibody to stain for H3cit and reduced non-specific staining with an autofluorescence-reducing agent. Furthermore, we demonstrated that NET staining requires a constant high temperature and careful handling of samples.

Autor im Rampenlicht: Bildgebung extrazellulärer Neutrophilenfallen in Geweben von Mensch und Maus 

Neutrophil extracellular traps (NETs) are associated with various diseases, and immunofluorescence is often used for their visualization. However, there are various staining protocols, and, in many cases, only one type of tissue is examined. Here, we establish a generally applicable protocol for staining NETs in mouse and human tissue.

Immunfluoreszenz-Bildgebung von neutrophilen extrazellulären Fallen in menschlichen und Mausgeweben

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...

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Vereinfachte Menschen Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolierung und Handhabung