The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.

NOTA: Todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con las directrices éticas institucionales locales. Dibujo 1. Sangre <ol><li> A través venipucture antecubital, recoger 14 tubos de sangre de un voluntario sano en top verde tubos heparinizados () e invertir cada tubo antes de decidirse por el hielo. Recoger la sangre dentro de 10 - 15 minutos de experimento para garantizar un rendimiento óptimo de los neutrófilos. </li></ol> 2. Aislamiento de neutrófilos de sangre entera <ol><li> Lave cada tubo superior verde de la sangre con 5 ml de PBS sin Ca y Mg para diluir la sangre. En cada uno de 4 x 50 ml tubos cónicos, añadir 15 ml de medios de separación de linfocitos (LSM) a TA. Usando una aguja 18 G montado en una jeringa de 60 ml, la capa cuidadosamente la sangre diluida sobre el LSM, la creación de una interfaz de LSM-arterial agudo. NOTA: Evitar la mezcla de las capas tanto como sea posible. </li><li> Centrifugar a 800 xg durante 30 minutos a 21 ° C sin descanso. NOTA: Sudden descansos puedecausar la mezcla de las diferentes capas. </li><li> Observe la eritrocitos y neutrófilos sedimento en el fondo. Aspirar y desechar las 2 capas superiores (plasma y LSM), asegurándose de deshacerse de la interfaz entre estas capas que contiene linfocitos y células mononucleares, dejando sólo la capa roja de fondo. </li><li> A cada tubo, añadir 20 ml de tampón fosfato salino (PBS) y solución de dextrano 20 ml de 6%. Invertir suavemente cada tubo para mezclar con la capa de eritrocitos y neutrófilos y dejar reposar a temperatura ambiente durante 30 min. NOTA: Esto permitirá que los glóbulos rojos (GR) para sedimentar en el fondo. </li><li> Después de 30 min, transferir el sobrenadante rico en neutrófilos en tubos nuevos y desechar los pellets de RBC. Sobrenadantes centrifugar a 450 xg a 4 ° C durante 5 min. Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante. El sedimento se contienen principalmente neutrófilos y pocos glóbulos rojos. </li><li> Preparar una solución de lisis mediante la adición de 0,5 ml de tampón de lisis a 4,5 ml de agua estéril. De Lyse restante RBC con tse preparaba 5 ml de solución de lisis, la transferencia de todos los precipitados resuspendidos en un solo tubo. Permitir la lisis a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 min. </li><li> Centrifugar a 450 xg a 4 ° C durante 5 min. Desechar el sobrenadante y lavar pellet con 5 ml de PBS sin Ca y Mg y centrifugar de nuevo a 450 xg a 4 ° C para deshacerse de cualquier solución de lisis restante. El sedimento obtenido en este punto contiene los neutrófilos. Resuspender el precipitado en 30 ml de frío 3% RPMI y poner en hielo. NOTA: 3% RPMI se realiza complementando medio RPMI con 3% de suero bovino fetal (FBS) </li><li> Verificar la pureza de la muestra usando tinción con azul de metileno. &gt; 95% de las células debería ser granulocitos con núcleos múltiples lobulares. Utilice tinción con azul tripán para verificar&gt; 95% de viabilidad de las células y contar el rendimiento de neutrófilos final. Diluir neutrófilos en frío de hielo 3% RPMI para obtener una concentración final de 5 x 10 6 neutrófilos / ml. </li></ol> 3. TNE Generación <ol><li> Estimular neutrófilos con 500 nM de PMA (por 30 ml de solución de neutrófilos) y se incuba en un tejido plano plato 150 x 25 mm de cultivo con 20 mm rejilla durante 4 horas a 37 ° C 5% de CO 2. Esto permitirá NETosis. </li><li> Después de 4 h de estimulación, aspirar suavemente y descartar los medios de comunicación, dejando la capa de los TNE y neutrófilos adheridos en la parte inferior. No interrumpir esta capa. </li><li> Usando un total de 15 ml de PBS frío sin Ca y Mg por placa, lavar la parte inferior de cada plato con la pipeta 15 ml de PBS en la parte inferior del plato con el fin de levantar todo el material adherente de la parte inferior. </li><li> Recoger solución obtenida a partir de lavar cada plato (paso 3,3) en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar durante 10 min a 450 xg a 4 ° C. Los neutrófilos y las células restantes se sedimenten en la parte inferior, dejando un NET-rica sobrenadante libre de células. </li><li> Divide sobrenadante en tubos de 1,5 ml de microcentrífuga y centrifugado durante 10 minutos a 18.000 xga 4 ° C. Esto permitirá que todo el ADN para sedimentar. NOTA: La centrifugación en grande tubes es más fácil y menos tiempo si tan altas velocidades son alcanzables en la centrífuga regular, de lo contrario tendrá que dividir sobrenadantes en tubos más pequeños con el fin de utilizar de alta velocidad micro-centrífuga. </li><li> Desechar el sobrenadante y resuspender todos los pellets obtenidos juntos en hielo frío PBS a una concentración correspondiente a 2 x 10 7 neutrófilos por 100 l de PBS. Esto dará lugar a la población de NET libre de células que puede ser utilizado para los experimentos posteriores. </li><li> Medir la concentración de ADN en la muestra obtenida mediante espectrofotometría o herramienta cuantificación de ADN alternativo. Una concentración adecuada en la muestra debería oscilar entre 140 a 180 ng / l. </li></ol> 4. Cell NET-estática cáncer de ensayo de adhesión <ol><li> Añadir 100 l de stock neto obtenido previamente por pocillo en una placa de fondo plano de 96 pocillos y permitir a los pozos de la capa O / N a 4 ° C en la oscuridad. </li><li> Entre 12 y 20 horas más tarde, verificar formación de una monocapa uniforme de célulasTNE gratis en el fondo de los pocillos bajo el microscopio (Figura 1). En este punto, aspirar con cuidado todo el material no adherente de las fuentes, asegurándose de no perturbar la monocapa NET en la parte inferior. </li><li> Añadir 100 l de 1% albúmina de suero bovino solución de bloqueo (BSA) a cada pocillo y se deja durante 1 h a TA. </li><li> Separar las células cancerosas A549 a partir de un matraz T-75 de la utilización de 2 ml de solución de tripsina 0,25%. Una vez extraído, añadir 10 ml de medio de A549 a las células tratadas con tripsina y centrifugar a 450 xg a 4 ° C durante 5 min. Descartar sobrenadante y resuspender las células en medios de comunicación para obtener una concentración de 2 x 10 4 células cancerosas por los medios de comunicación 100 microlitros. NOTA: Las células A549 se cultivaron por separado. Brevemente, las células se cultivaron y mantuvieron en medio F12 DMEM que contiene 10% de FBS y 1% de penicilina estreptomicina y se incubaron a 37 ° C 5% de CO 2. Una vez que 70 - se alcanzó 80% de confluencia celular, que se separaron usando 0,25% de tripsina-EDTA y se resuspendieron en el mismo mediodescrito arriba. </li><li> Células de cáncer de manchas utilizando CFSE mediante la adición de 1 l de CFSE por ml de los medios de comunicación y dejar manchar a TA durante 10 min. Después de la tinción, centrífuga hacia abajo a 450 xga 4 ° C durante 5 min y luego desechar sobrenadante y resuspender las células en el volumen inicial de los medios de comunicación para obtener una concentración de 2 x 10 4 células cancerosas por los medios de comunicación 100 microlitros. </li><li> Después de 1 hr de los TNE de bloqueo, suavemente aspirado de solución de bloqueo y añadir 2 x10 4 células de cáncer en los medios de comunicación, que es equivalente a 100 l, por pocillo sobre la monocapa de NET y permitir que se adhieran durante 90 min a 37 ° C 5% de CO 2. Se aspira suavemente las células y añadir 100 l de PBS a cada pocillo para lavar las células no adherentes. </li><li> En algunos pozos, añadir 1000U de Dnase1 por pocillo durante 10 min antes de lavar para degradar los TNE. Esto servirá como control negativo. En otros pocillos, añadir 100 l de agua estéril por pocillo durante 10 min, que servirá como el control de vehículo (VC). NOTA: 3 repeticiones por condition usualmente se realizan para aumentar el tamaño de la muestra. </li><li> Aspirar y desechar toda la solución en los pozos dejando sólo los TNE y las células cancerosas adheridas en la parte inferior. Añadir 100 l de solución de formaldehído al 4% por pocillo para fijar las células cancerosas adherentes a NETS y leer ensayo bajo el microscopio de fluorescencia (Figura 1). Parcela y analizar los resultados (Figura 3). </li></ol>

<ol>
	<li>Saitoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+mediate+a+host+defense+response+to+human+immunodeficiency+virus-1.">Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).</li><li>Bruns, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+extracellular+traps+against+Aspergillus+fumigatus+in+vitro+and+in+infected+lung+tissue+is+dependent+on+invading+neutrophils+and+influenced+by+hydrophobin+RodA.">Production of extracellular traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin RodA.</a> PLoS Pathog. 6 (4), e1000873 (2010).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Papayannopoulos, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETs:+a+new+strategy+for+using+old+weapons.">NETs: a new strategy for using old weapons.</a> Trends Immunol. 30 (11), 513-521 (2009).</li><li>McDonald, B., Urrutia, R., Yipp, B. G., Jenne, C. N., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+neutrophil+extracellular+traps+capture+bacteria+from+the+bloodstream+during+sepsis.">Intravascular neutrophil extracellular traps capture bacteria from the bloodstream during sepsis.</a> Cell Host Microbe. 12 (3), 324-333 (2012).</li><li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus.">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> J Immunol. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li><li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage,+infiltrate+tissues,+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus.">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> J Immunol. 187 (1), 538-552 (2011).</li><li>Khandpur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETs+are+a+source+of+citrullinated+autoantigens+and+stimulate+inflammatory+responses+in+rheumatoid+arthritis.">NETs are a source of citrullinated autoantigens and stimulate inflammatory responses in rheumatoid arthritis.</a> Sci Transl Med. 5 (178), 178ra140 (2013).</li><li>Demers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancers+predispose+neutrophils+to+release+extracellular+DNA+traps+that+contribute+to+cancer-associated+thrombosis.">Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13076-13081 (2012).</li><li>Hahn, S., Giaglis, S., Hoesli, I., Hasler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+NETs+in+reproduction:+from+infertility+to+preeclampsia+and+the+possibility+of+fetal+loss.">Neutrophil NETs in reproduction: from infertility to preeclampsia and the possibility of fetal loss.</a> Front Immunol. 3, 362 (2012).</li><li>Cools-Lartigue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+and+promote+metastasis.">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis.</a> J Clin Invest. , (2013).</li><li>Cools-Lartigue, J., Spicer, J., Najmeh, S., Ferri, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+cancer+progression.">Neutrophil extracellular traps in cancer progression.</a> Cell Mol Life Sci. , (2014).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> J Vis Exp. (36), (2010).</li><li>Maqbool, M., Vidyadaran, S., George, E., Ramasamy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+laboratory+procedures+for+isolating+human+peripheral+blood+derived+neutrophils.">Optimisation of laboratory procedures for isolating human peripheral blood derived neutrophils.</a> Med J Malaysia. 66 (4), 296-299 (2011).</li><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+lymphocytes,+granulocytes+and+macrophages.">Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages.</a> Scand J Immunol. Suppl. 5, 9-15 (1976).</li><li>Calado, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+hormones,+acting+on+the+TERT+gene,+increase+telomerase+activity+in+human+primary+hematopoietic+cells.">Sex hormones, acting on the TERT gene, increase telomerase activity in human primary hematopoietic cells.</a> Blood. 114 (11), 2236-2243 (2009).</li><li>Zhong, C., Qu, X., Tan, M., Meng, Y. G., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+regulation+of+bv8+in+human+blood+cells.">Characterization and regulation of bv8 in human blood cells.</a> Clin Cancer Res. 15 (8), 2675-2684 (2009).</li><li>Wu, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+leukocyte+labeling+with+intravenous+ferumoxides/protamine+sulfate+complex+and+in+vitro+characterization+for+cellular+magnetic+resonance+imaging.">In vivo leukocyte labeling with intravenous ferumoxides/protamine sulfate complex and in vitro characterization for cellular magnetic resonance imaging.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (5), C1698-C1708 (2007).</li><li>Saffarzadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+directly+induce+epithelial+and+endothelial+cell+death:+a+predominant+role+of+histones.">Neutrophil extracellular traps directly induce epithelial and endothelial cell death: a predominant role of histones.</a> PLoS One. 7 (2), e32366 (2012).</li><li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar

El protocolo de aislamiento de Trampa neutrófilos extracelular se demuestra en este vídeo combina diferentes técnicas utilizadas en la literatura para el aislamiento de neutrófilos y la formación de NET. Simplifica un proceso bastante complejo y variable y ofrece una forma muy fiable y reproducible para aislar los TNE libres de células purificadas con menos pasos que otros protocolos. Por otra parte, los reactivos fácilmente disponibles se emplean agregando a la simplicidad protocolos y reducir significativamente...

Trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) han sido recientemente descubiertos elementos derivadas de neutrófilos compuestas de cadenas de ADN extracelular decorados por cientos de proteínas y las histonas. Ellos son secretadas por los neutrófilos en el contexto de la infección y la inflamación siguientes estímulos específicos y se registran inicialmente a formar parte de los mecanismos de defensa de los neutrófilos frente a las infecciones. Se les mostró primero en promover la captura de varios invasores microbianos incluyendo bacterias, virus y hongos 1-3. Atrapar del microbio entonces conducir a su destrucción, tanto directamente por las proteínas NET asociada 3,4 e indirectamente a través de la contratación local de las células fagocíticas 5,6. El papel de las redes sin embargo no parece limitarse a la defensa del huésped. Más recientemente, se ha demostrado jugar un papel importante en las enfermedades autoinmunes 7,8, trombosis 9, trastornos relacionados con el embarazo 10 y hasta la progresión del cáncer11,12. En consecuencia, parece que las redes juegan un papel importante en un gran número de diversos procesos fisiológicos. Sin embargo, dado el carácter novedoso de esta investigación, aún queda mucho por aclarar con respecto a los mecanismos por los cuales los TNE ejercen sus efectos. Aquí, presentamos un método simplificado para el aislamiento de los TNE en ausencia de neutrófilos. En el siguiente vídeo, se demuestra una técnica simplificada y fácil de aislar los TNE de sangre humana. TNE libres de células se pueden utilizar en una serie de experimentos in vitro que incluyen la tinción, imuunofluorescence, borrando así como un número de ensayos tales como la adhesión, la proliferación y la migración. Existen 13, 19 Otros protocolos, sin embargo, son generalmente largo, complejo, costoso, y, a menudo, bajo rendimiento 13. Este protocolo simplificado utiliza reactivos básicos y disminuye el número de pasos necesarios para aislar los neutrófilos, por lo tanto, minimizar la longitud de la procedire al tiempo que maximiza el rendimiento. El siguiente método combina diferentes técnicas para el aislamiento de neutrófilos se han descrito previamente en la literatura para obtener un protocolo simple dando una muestra muy pura de neutrófilos vivos. Como se sugiere en la literatura, la sangre venosa se ​​recoge en tubos con EDTA y usado dentro de 10 minutos para evitar la activación de neutrófilos 14. Utilizamos medios de separación de linfocitos (LSM) centrifugación en gradiente de densidad para aislar los granulocitos y las células rojas de la sangre a partir de sangre entera heparinizada, un método adaptado de la técnica de centrifugación de densidad Ficoll descrito inicialmente por Boyum et al 15. LSM es una modificación de la formulación Boyum que sustituye diatrizoato de sodio para la metrizoato de sodio y se ha utilizado con éxito en muchos estudios para aislar los neutrófilos 16-18. Después de la centrifugación de densidad diferencial, monocitos y linfocitos se descartan; los glóbulos rojos se sedimentaronutilizando una solución de dextrano 6% 14 y los glóbulos rojos restantes se lisan para obtener una población de neutrófilos puros, que se verifica con azul Trypan y tinción con azul de metileno. Numerosos agentes se han utilizado para inducir NETosis tanto in vitro como in vivo, incluyendo lipopolisacárido (LPS), y acetato de forbol miristato (PMA) y las interleucinas (IL-8) 3,5,6. En el siguiente protocolo, los neutrófilos aislados se estimularon con 500 nM PMA durante 4 h, que se ha demostrado que es una concentración adecuada para permitir la formación NET consistente y fiable sin promover apoptosis 19,20. Después del aislamiento, nos demuestran cómo los TNE libres de células obtenidas a partir de este protocolo se puede utilizar en un ensayo de adhesión. Dnase1 se utiliza para digerir y degradar TNE como se describió anteriormente y por lo tanto sirve como un control 2,3,11. Otras opciones incluyen el uso de inhibidor de la elastasa de los neutrófilos (NE) para inhibir NET formati, lo cual es una alternativa aceptable cuando el objetivo es inhibir la formación NET en lugar de efectuar su degradación 11. Aunque NE _ tiene un número de funciones variadas, se ha demostrado previamente que NET deposición puede ser inhibida por NEi a través del bloqueo de descondensación de la cromatina, la desgranulación nuclear y la muerte de neutrófilos 12

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="983">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:75px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:573px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lymphocyte Separation Medium (LSM)</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">305-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dextran hydrochloride (powder)</td>
			<td style="width:75px;">Spectrum</td>
			<td style="width:119px;">DE130</td>
			<td>6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RPMI-1640 Medium with L-glutamine</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">350-000-CL</td>
			<td>3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">BD Pharm Lyse Lysing buffer</td>
			<td style="width:75px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td style="width:75px;">Sigma-Alrdrich</td>
			<td style="width:119px;">P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse1</td>
			<td>Roche</td>
			<td style="width:119px;">11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F12 DMEM</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">319-075-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:75px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CFSE</td>
			<td style="width:75px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:75px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Integrid tissue culture dish with 20mm grid (150 x 25mm)</td>
			<td style="width:75px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simplified human neutrophil extracellular traps (nets) isolation and handling

Neutrófilos extracelular Trampas (TNE) se han identificado recientemente como parte del arsenal antimicrobiano de los neutrófilos. Aparte de su papel en la lucha contra las infecciones, la investigación reciente ha demostrado que pueden estar implicados en muchos otros procesos de enfermedad, incluyendo la progresión del cáncer. El aislamiento de los TNE purificadas es un elemento crucial para permitir el estudio de estas funciones. En este vídeo, se demuestra un método simplificado de celda de aislamiento NET libre de sangre humana utilizando reactivos fácilmente disponibles. TNE aisladas se pueden utilizar para la tinción de inmunofluorescencia, secante o varios ensayos funcionales. Esto permite una evaluación de sus propiedades biológicas en ausencia de los posibles efectos de confusión de los propios neutrófilos. Una técnica de separación por gradiente de densidad se emplea para aislar los neutrófilos de donante sano de sangre entera. Neutrófilos aislados se estimularon por forbol 12-myriState 13-acetato (PMA) para inducir NETosis. Los neutrófilos activados se descartan, y se obtiene una acción NET libre de células. A continuación, demostramos cómo TNE aislado se puede utilizar en un ensayo de adhesión con células de cáncer de pulmón humano A549. El stock de NET se utiliza para recubrir los pocillos de una de 96 pocillos de cultivo celular placa de O / células A549 N, y después de asegurar la formación de una monocapa NET adecuada sobre el fondo de los pocillos, CFSE marcadas se añadidas. Las células adherentes se cuantificaron utilizando un microscopio de fluorescencia Nikon TE300. En algunos pozos, 1000U Dnase1 se añade 10 min antes de contar para degradar los TNE

Logro de un ensayo de adhesión estática con redes requiere recubrimiento adecuado de los pocillos con una monocapa de TNE antes de la adición de las células cancerosas (Figura 1). Todos los pasos posteriores deben hacerse con cuidado para no perturbar la capa. Cuando se forma una capa adecuada de los TNE, se espera para ver significativa la adhesión a las redes de células cancerosas como se ve en la Figura 2A y 2C. Este efecto es abrogada por la adición de Dnase1...

Watch this Scientific Journal Video about Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling at JoVE.com

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

En el siguiente protocolo, se describe una manera muy simple para aislar las trampas de neutrófilos extracelular (TNE) a partir de sangre humana entera utilizando reactivos fácilmente disponibles. A continuación, demostramos cómo las redes aisladas se pueden utilizar en un ensayo de adhesión in vitro con células cancerosas.

Simplificado Humanos neutrófilos extracelular Trampas (TNE) Aislamiento y manipulación

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

simplified-human-neutrophil-extracellular-traps-nets-isolation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

29.5K vistas.  McGill University.  En el siguiente protocolo, se describe una manera muy simple para aislar las trampas de neutrófilos extracelular (TNE) a partir de sangre humana entera utilizando reactivos fácilmente disponibles. A continuación, demostramos cómo las redes aisladas se pueden utilizar en un ensayo de adhesión in vitro con células cancerosas. 

Video: Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

Las trampas de neutrófilos extracelular: Cómo generar y visualizarlas

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Investigación

Inmunología e Infección

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of lipids. The function of lipids (e.g., in host-pathogen interactions or host entry) has been reported to play a crucial role in cellular processes. Here, we show a method to determine lipid composition, with a focus on the cholesterol level of primary blood-derived neutrophils, by HPTLC in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC). The aim was to investigate the role of lipid/cholesterol alterations in the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NET release is known as a host defense mechanism to prevent pathogens from spreading within the host. Therefore, blood-derived human neutrophils were treated with methyl-&#946;-cyclodextrin (M&#946;CD) to induce lipid alterations in the cells. Using HPTLC and HPLC, we have shown that M&#946;CD treatment of the cells leads to lipid alterations associated with a significant reduction in the cholesterol content of the cell. At the same time, M&#946;CD treatment of the neutrophils led to the formation of NETs, as shown by immunofluorescence microscopy. In summary, here we present a detailed method to study lipid alterations in neutrophils and the formation of NETs.

Lipids are known to play an important role in cellular functions. Here, we describe a method to determine the lipid composition of neutrophils, with emphasis on the cholesterol level, by using both HPTLC and HPLC to gain a better understanding of the underlying mechanisms of neutrophil extracellular trap formation.

Métodos para el estudio de lípidos Las alteraciones en neutrófilos y la posterior formación de los neutrófilos extracelular Trampas

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

Visualización de macrófagos trampas extracelular mediante Microscopía Confocal

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. Immunofluorescence microscopy and image-based quantification methods remain important tools to quantitate neutrophil extracellular trap formation. However, there are key limitations to the immunofluorescence-based methods that are currently available for quantifying NETs. Manual methods of image-based NET quantification are often subjective, prone to error and tedious for users, especially non-experienced users. Also, presently available software options for quantification are either semi-automatic or require training prior to operation. Here, we demonstrate the implementation of an automated immunofluorescence-based image quantification method to evaluate NET formation called NETQUANT. The software is easy to use and has a user-friendly graphical user interface (GUI). It considers biologically relevant parameters such as an increase in the surface area and DNA:NET marker protein ratio, and nuclear deformation to define NET formation. Furthermore, this tool is built as a freely available app, and allows for single-cell resolution quantification and analysis.

Here, we present a protocol for generating neutrophil extracellular traps (NETs) and operating NETQUANT, a fully automatic software option for quantification of NETs in immunofluorescence images.

Cuantificación automatizada basada en imágenes de trampas extracelulares de neutrófilos mediante NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by neutrophils in response to systemic inflammation or pathogens. Although NETs have previously been shown to augment clot formation and inhibit fibrinolysis in humans and dogs, the role of NETs in cats with cardiogenic arterial thromboembolism (CATE), a life-threatening complication secondary to hypertrophic cardiomyopathy, is unknown. A standardized method to identify and quantify NETs in cardiogenic arterial thrombi in cats will advance our understanding of their pathological role in CATE. Here, we describe a technique to identify NETs in formaldehyde-fixed and paraffin-embedded thrombi within the aortic bifurcation, extracted during necropsy. Following deparaffinization with xylene, aortic sections underwent indirect heat-induced antigen retrieval. Sections were then blocked, permeabilized, and ex vivo NETs were identified by colocalization of cell-free DNA (cfDNA), citrullinated histone H3 (citH3), and neutrophil elastase (NE) using immunofluorescence microscopy. To optimize the immunodetection of NETs in thrombi, autofluorescence of tissue elements was limited by using an autofluorescence quenching process prior to microscopy. This technique could be a useful tool to study NETs and thrombosis in other species and offers new insights into the pathophysiology of this complex condition.

We describe a method to identify neutrophil extracellular traps (NETs) in formaldehyde-fixed and paraffin-embedded feline cardiogenic arterial thrombi using heat-induced antigen retrieval and a double immunolabeling protocol.

Identificación de trampas extracelulares de neutrófilos en tromba arterial felino incrustada en parafina mediante microscopía de inmunofluorescencia

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). This study analyzes the morphological and compositional changes in NETs induced by microbial and chemical stimuli using standardized in vitro methodologies for NET induction and characterization with human cells. The procedures described here allow the analysis of NET morphology (lytic or non-lytic) and composition (DNA-protein structures and enzymatic activity), and the effect of soluble factors or cellular contact on such characteristics. Additionally, the techniques described here could be modified to evaluate the effect of exogenous soluble factors or cellular contact on NET composition.
The applied techniques include the purification of polymorphonuclear cells from human peripheral blood using a double density gradient (1.079-1.098 g/mL), guaranteeing optimal purity and viability (&#8805; 95%) as demonstrated by Wright's staining, trypan blue exclusion, and flow cytometry, including FSC versus SSC analysis and 7AAD staining. NET formation is induced with microbial (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, and Candida albicans) and chemical (phorbol myristate acetate, HOCl) stimuli, and the NETs are characterized by DNA-DAPI staining, immunostaining for the antimicrobial peptide cathelicidin (LL37), and quantification of enzymatic activity (neutrophil elastase, cathepsin G, and myeloperoxidase). The images are acquired through fluorescence microscopy and analyzed with ImageJ.

Presented here is a protocol for the induction and analysis of in vitro neutrophil extracellular traps (NETs). Quantification of DNA, cathelicidin (LL37), and enzyme activity yielded data that show the variability in the composition and morphology of NETs induced by microbial and chemical stimuli under similar controlled conditions.

Análisis morfológico y composicional de trampas extracelulares de neutrófilos inducidas por estímulos microbianos y químicos

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures composed of DNA with granule proteins, such as myeloperoxidase (MPO) and neutrophil elastase (NE), and cytoplasmic and cytoskeletal proteins. Although interest in NETs has increased recently, no sensitive, reliable assay method is available for measuring NETs in clinical settings. This article describes a modified sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to quantitatively measure two components of circulating NETs, MPO-DNA and NE-DNA complexes, which are specific components of NETs and are released into the extracellular space as breakdown products of NETs. The assay uses specific monoclonal antibodies for MPO or NE as the capture antibodies and a DNA-specific detection antibody. MPO or NE binds to one site of the capture antibody during the initial incubation of samples containing MPO-DNA or NE-DNA complexes. This assay shows good linearity and high inter-assay and intra-assay precision. We used it in 16 patients with COVID-19 with accompanying acute respiratory distress syndrome and found that the plasma concentrations of MPO-DNA and NE-DNA were significantly higher than in the plasma obtained from healthy controls. This detection assay is a reliable, highly sensitive, and useful method for investigating the characteristics of NETs in human plasma and culture supernatants.

We present a protocol for a modified sandwich enzyme-linked immunosorbent assay technique to quantitatively measure two components of neutrophil extracellular trap remnants, myeloperoxidase conjugated-DNA and neutrophil elastase conjugated-DNA complexes,derived from activated neutrophils.

Cuantificación de complejos mieloperoxidasa-ADN y neutrófilos elastasa-ADN a partir de trampas extracelulares de neutrófilos mediante el uso de un ELISA sándwich modificado

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Tinción e imágenes para visualizar trampas extracelulares de neutrófilos

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in autoimmune diseases and sterile inflammation. They are web-like structures composed of double-stranded DNA filaments, histones, and antimicrobial proteins. Once released, NETs can trap and kill extracellular pathogens in blood and tissue. Furthermore, NETs participate in homeostatic regulation by stimulating platelet adhesion and coagulation. However, the dysregulated production of NETs has also been associated with various diseases, including sepsis or autoimmune disorders, which makes them a promising target for therapeutic intervention. Apart from electron microscopy, visualizing NETs using immunofluorescence imaging is currently one of the only known methods to demonstrate NET interactions in tissue. Therefore, various staining methods to visualize NETs have been utilized. In the literature, different staining protocols are described, and we identified four key components showing high variability between protocols: (1) the types of antibodies used, (2) the usage of autofluorescence-reducing agents, (3) antigen retrieval methods, and (4) permeabilization. Therefore, in vitro immunofluorescence staining protocols were systemically adapted and improved in this work to make them applicable for different species (mouse, human) and tissues (skin, intestine, lung, liver, heart, spinal disc). After fixation and paraffin-embedding, 3 &#181;m thick sections were mounted onto slides. These samples were stained with primary antibodies for myeloperoxidase (MPO), citrullinated histone H3 (H3cit), and neutrophil elastase (NE) according to a modified staining protocol. The slides were stained with secondary antibodies and examined using a widefield fluorescence microscope. The results were analyzed according to an evaluation sheet, and differences were recorded semi-quantitatively.
Here, we present an optimized NET staining protocol suitable for different tissues. We used a novel primary antibody to stain for H3cit and reduced non-specific staining with an autofluorescence-reducing agent. Furthermore, we demonstrated that NET staining requires a constant high temperature and careful handling of samples.

Autor destacado: Imágenes de trampas extracelulares de neutrófilos en tejidos humanos y de ratón 

Neutrophil extracellular traps (NETs) are associated with various diseases, and immunofluorescence is often used for their visualization. However, there are various staining protocols, and, in many cases, only one type of tissue is examined. Here, we establish a generally applicable protocol for staining NETs in mouse and human tissue.

Imágenes de inmunofluorescencia de trampas extracelulares de neutrófilos en tejidos humanos y de ratón

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...