עבודה זו נתמכה על איגוד כירורגי ילדים אמריקאי פרס קרן (AG) והמכון הלאומי לבריאות K08DK098271 (AG) bythe.

אוניברסיטת ויסקונסין טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה אישרה את כל הנהלים. 1. הכנה של פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פוספט 1x שנאגרו (PBS) כחיץ לנתיחה ופתרון שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סוכרוז 30% על ידי במשקל 30 גרם של סוכרוז ומקום לבקבוק. להוסיף 99 מיליליטר של 1x PBS ולהוסיף 1 מיליליטר 10% אזיד הנתרן. מערבבים היטב עד שכל סוכרוז הוא נמס. עד נדרשת חנות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חסימת פתרון על ידי ערבוב 1x PBS, 3% אלבומין בסרום שור (BSA) ושל 0.1% Triton-X-100. מערבבים היטב ולאחסן במקרר עד צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 8% paraformaldehyde פתרון (PFA) ב1x PBS על ידי שקילת הכמות המתאימה של PFA לPBS 1x ולאחר מכן לדגור על 65 מעלות צלזיוס עד שהוא נמס לגמרי. חנות ב -25 aliquots מיליליטר ב-20 ° C במקפיא עד צורך. לדלל את PFA 4% ב- ​​PBS 1x ביום שימוש. </li></ol> 2. העובר וגוט לנתחיון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם למוסדי טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה אישר פרוטוקולים, להרדים עכבר בהריון בעיתוי ולהעביר את הרחם לקרח קר המכיל 60 מ&quot;מ צלחת פטרי 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתיחה באמצעות מספריים חדים, לחתוך את דופן הרחם הפתוחה לחשוף את העוברים. הסר את העוברים מן הרחם והמקום ל-60 מ&quot;מ צלחת פטרי המכילה נקייה קר כקרח 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים כל עובר על ידי עריפת הראש ב1x קר כקרח PBS. אם אתה משתמש בעכברים מהונדסים המכילים חלבוני ניאון, תחת תאורת הקרינה, לזהות את העוברים מהונדסים החיוביים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את מערכת עיכול מכל עובר באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה. בעזרת מלקחיים בסדר, לכוון את העובר כך שצד השמאל פונה כלפי מעלה וצד ימין הוא נגד החלק התחתון של צלחת פטרי. הסר את קיר הגוף העליון מהעובר כדי לחשוף את האיברים הפנימיים. הכנס מלקחיים עדינים בין קיר גוף גב והאיברים הפנימיים. CrOSS מלקחיים אחד נגד השני בפעולת חיתוך כמו מספריים כדי להסיר את האיברים הפנימיים של העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהמשך תת-לנתח את מערכת העיכול מהאיברים שמסביב ואז למקם את כל מערכת עיכול לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר המכיל קר כקרח 1x PBS. </li></ol> 3. קיבוע של קטעי GI <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את כל מערכת עיכול 3 פעמים עם 1x קר כקרח PBS ולאחר מכן להחליף עם PFA 4%. תקן את שטחי GI בצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge על פלטפורמת נדנדה ב RT תמורת 1.5 שעות. יש לשטוף את שטחי GI 3 פעמים במשך 5 דקות ב RT ולאחר מכן במשך שעה 1 על פלטפורמת הנדנדה. בשלב זה, לאחסן קטעי GI על 4 מעלות צלזיוס בסוכרוז 30% ב 1x PBS המכיל 0.1% אזיד הנתרן עד צורך. הערה: לחלופין, לאחסן את העוברים בסוכרוז 30% לשנה עד אחת ללא כל השפעה על שלמות הרקמות. אחסון של הדגימות בסוכרוז 30% מאפשר עיבוד מאוחר יותר של הדגימות או לimmunostaining או לאוקטובר לcryo-מדור שng. לחלופין, להמשיך בפרוטוקול immunostaining מפורט להלן. </li></ol> 4. Immunostaining פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם דגימות אוחסנו ב -30% סוכרוז, לשטוף אותם 3 פעמים במשך 20 דקות ב1x PBS על פלטפורמת נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שטחי GI לפתרון חסימה על פלטפורמת נדנדה 1h ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון חסימת דגירה שטחי GI עם הכמות המתאימה של נוגדנים עיקריים מדולל חסימת פתרון גם עבור 4 שעות ב RT או O / N ב 4 ° C על פלטפורמת נדנדה. השתמש 1: 1,000 דילול של נוגדן אנושי אנטי-הו (סרום המתקבל ממטופל), 1: 1,000 דילול של נוגדן עוף אנטי-ירוק חלבון פלואורסצנטי (GFP) ו -1: של נוגדן אנטי צ&#39;אט עז 100 דילול. הערה: אנו מנצלים נוגדן אנטי-הו אנושי שהושג באופן מקומי ממטופל, לעומת זאת, נוגדנים נגד הו זמינים מסחרי, למשל, עכבר אנטי-הו, (שימוש ב1: 500 דילול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את שטחי GI ב1x PBS3 פעמים במשך 5 דקות ולאחר מכן עבור שעה 1 ב RT על פלטפורמת נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את PBS 1x עם נוגדנים משני בדילול 1: 500 בחסימת פתרון על פלטפורמת נדנדה לאו 4 שעות על RT או O / N ב 4 מעלות צלזיוס. השתמש צבע אמין-reactive אנטי אנושי חמור כגון DyLight, Cy2 אנטי-עוף חמור וCy5 אנטי-העז החמור. אם נוגדן אנטי-הו העכבר באמצעות לאחר מכן להשתמש דילול 1: 500 של צבע אמין-reactive החמור אנטי עכבר 405. הערה: עוצמת GFP אנדוגני וביטוי tdTomato והבהירות של immunostaining עלייה עם גיל התפתחותי. אנחנו בדרך כלל immunostain אומץ עוברי בנפרד ב0.2 מיליליטר צינורות עם 150 μl של פתרון מכתים במטרה לצמצם את הנפח של נוגדן המשמש וגם כדי להבטיח צביעה יעילה של הרקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את שטחי GI בPBS 3 פעמים 1x למשך 5 דקות ולאחר מכן עבור שעה 1 ב RT על פלטפורמת נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כמה טיפות של מדיום הרכבה הקרינה עם DAPI על גבי זכוכית. לטבול את tra GICT להרכבה בינוני הקרינה ולהוסיף מכסה זכוכית ישירות על גבי הרקמה. הקרינה ההרכבה -G הבינוני היא תרכובת מסיס במים המספקת חותם חצי קבוע. הערה: הרכבה בינונית הקרינה השימוש כגון Vectashield שהוא גליצרול מבוסס הרכבה בינונית שמונע דהייה וphotobleaching של נוגדנים. שני מוצרים אלה מאפשרים רקמות להיות מאוחסנות במשך תקופות ארוכות של זמן על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלם תמונות של כל אחד מfluorophore באמצעות מיקרוסקופ confocal. השתמש באורכי גל עירור לfluorophores ומסננים המועסקים מוצגת בלוח 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח תמונה בעזרת מחשב באמצעות תוכנה מתאימה, בהתאם לסוג של confocal משמש ללכידת תמונות. </li></ol>

<ol>
	<li>Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+determinants+of+the+independence+and+complexity+of+the+enteric+nervous+system.">Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system.</a> Trends Neurosci. 33 (10), 446-456 (2010).</li><li>Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirschsprung+disease,+associated+syndromes+and+genetics:+a+review.">Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review.</a> J Med Genet. 45 (1), 1-14 (2008).</li><li>Erickson, C. S., Barlow, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonic+enteric+nervous+system+analysis+during+parenteral+nutrition.">Colonic enteric nervous system analysis during parenteral nutrition.</a> J Surg Res. 184 (1), 132-137 (2013).</li><li>Erickson, C. S., Zaitoun, I., Haberman, K. M., Gosain, A., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sacral+neural+crest-derived+cells+enter+the+aganglionic+colon+of+Ednrb(-/-)+mice+along+extrinsic+nerve+fibers.">Sacral neural crest-derived cells enter the aganglionic colon of Ednrb(-/-) mice along extrinsic nerve fibers.</a> J Comp Neurol. 20 (3), 620-632 (2011).</li><li>Zaitoun, I., Erickson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+neuronal+density+and+neurotransmitter+expression+in+the+ganglionated+region+of+Ednrb+null+mice:+implications+for+Hirschsprung's+disease.">Altered neuronal density and neurotransmitter expression in the ganglionated region of Ednrb null mice: implications for Hirschsprung's disease.</a> Neurogastroenterol Motil. , (2013).</li><li>Margolis, K. G., Stevanovic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+neuronal+density+contributes+to+the+severity+of+intestinal+inflammation.">Enteric neuronal density contributes to the severity of intestinal inflammation.</a> Gastroenterology. 141 (2), 588-598 (2011).</li><li>Qu, Z. -. D., Thacker, M., Castelucci, P., Bagy&#225;nszki, M., Epstein, M. L., Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+analysis+of+neuron+types+in+the+mouse+small+intestine.">Immunohistochemical analysis of neuron types in the mouse small intestine.</a> Cell Tissue Res. 334 (2), 147-161 (2008).</li><li>Bian, X. -. C., Bornstein, J. C., Bertrand, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+transmission+at+functionally+distinct+synapses+in+descending+reflex+pathways+of+the+rat+colon.">Nicotinic transmission at functionally distinct synapses in descending reflex pathways of the rat colon.</a> Neurogastroenterol Motil. 15 (2), 161-171 (2003).</li><li>Johnson, C. D., Epstein, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+and+polyvalent+antiserum+to+chicken+choline+acetyltransferase.">Monoclonal antibodies and polyvalent antiserum to chicken choline acetyltransferase.</a> J Neurochem. 46 (3), 968-976 (1986).</li><li>Tooyama, I., Kimura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+encoded+by+an+alternative+splice+variant+of+choline+acetyltransferase+mRNA+is+localized+preferentially+in+peripheral+nerve+cells+and+fibers.">A protein encoded by an alternative splice variant of choline acetyltransferase mRNA is localized preferentially in peripheral nerve cells and fibers.</a> J Chem Neuroanat. 17 (4), 217-226 (2000).</li><li>Koga, T., Bellier, J. -. P., Kimura, H., Tooyama, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoreactivity+for+Choline+Acetyltransferase+of+Peripheral-Type+(pChAT)+in+the+Trigeminal+Ganglion+Neurons+of+the+Non-Human+Primate+Macaca+fascicularis.">Immunoreactivity for Choline Acetyltransferase of Peripheral-Type (pChAT) in the Trigeminal Ganglion Neurons of the Non-Human Primate Macaca fascicularis.</a> Acta histochemica et cytochemica. 46 (2), 59-64 (2013).</li><li>Sang, Q., Young, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+and+chemical+coding+of+cholinergic+neurons+in+the+small+and+large+intestine+of+the+mouse.">The identification and chemical coding of cholinergic neurons in the small and large intestine of the mouse.</a> Anat Rec. 251 (2), 185-199 (1998).</li><li>Lei, J., Howard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+deletion+of+Hand2+in+enteric+neural+precursor+cells+affects+its+functions+in+neurogenesis,+neurotransmitter+specification+and+gangliogenesis,+causing+functional+aganglionosis.">Targeted deletion of Hand2 in enteric neural precursor cells affects its functions in neurogenesis, neurotransmitter specification and gangliogenesis, causing functional aganglionosis.</a> Development (Cambridge, England). 138 (21), 4789-4800 (2011).</li><li>Erickson, C. S., Lee, S. J., Barlow-Anacker, A. J., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L., Gosain, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+of+cholinergic+myenteric+neurons+during+enteric+nervous+system+development:+comparison+of+different+ChAT+fluorescent+mouse+reporter+lines.">Appearance of cholinergic myenteric neurons during enteric nervous system development: comparison of different ChAT fluorescent mouse reporter lines.</a> Neurogastroenterol Motil. 26 (6), 874-884 (2014).</li><li>Teitelbaum, D. H., Caniano, D. A., Qualman, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology+of+Hirschsprung's-associated+enterocolitis:+importance+of+histologic+correlates.">The pathophysiology of Hirschsprung's-associated enterocolitis: importance of histologic correlates.</a> J Pediatr Surg. 24 (12), 1271-1277 (1989).</li><li>Aslam, A., Spicer, R. D., Corfield, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Children+with+Hirschsprung's+disease+have+an+abnormal+colonic+mucus+defensive+barrier+independent+of+the+bowel+innervation+status.">Children with Hirschsprung's disease have an abnormal colonic mucus defensive barrier independent of the bowel innervation status.</a> J Pediatr Surg. 32 (8), 1206-1210 (1997).</li><li>Puig, I., Champeval, D., De Santa Barbara, P., Jaubert, F., Lyonnet, S., Larue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+Pten+in+the+mouse+enteric+nervous+system+induces+ganglioneuromatosis+and+mimics+intestinal+pseudoobstruction.">Deletion of Pten in the mouse enteric nervous system induces ganglioneuromatosis and mimics intestinal pseudoobstruction.</a> J Clin Invest. 119 (12), 3586-3596 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

המעבדה ואחרים שלנו הראו כי ליקויים במערכת העיכול בHSCR אינם מוגבלים למעי גס aganglionic אבל הרחיבו proximally, אפילו למעי הדק ganglionated 5,15,16. שינויים אלה כוללים שינויים בפנוטיפ צפיפות והעצבי העצבי ENS ועשויים להסביר dysmotility שנצפה בחולים עם HSCR. יש לנו מנוצלים הטכניקות לעיל במאמצי...

מערכת תפקוד מעי עצבים (ENS), השולטת בתנועתיות, מזין קליטה, וזרימת דם מקומית, היא חיונית לחיים 1. ENS נוצר על ידי תאים עצביים פסגה (NCC) שמתרבים, להעביר וליישב את הבטן, שבו הם להתמיין הנוירונים הגרעינים המכילים ותאי גלייה. מחלת הירשפרונג (תורשה של מנדל HSCR, באינטרנט באיש), הפרעה מולדת multigeneic עם שכיחות של 1 ב4,000 לידה חי, יכולה להיחשב המחלה אבטיפוס ללימוד היווצרות ENS שיבש. בHSCR, NCC לא מצליח להעביר ולליישב אורכים משתנה של המעי האחורי דיסטלי 2. בנוסף, במערכת העיכול נפוצה אחרת (GI) פגמים התפתחותיים באוכלוסיית הילדים, כגון מומים אנו-רקטליות, atresias מעיים, והפרעות תנועתיות קשורות עם הפרעות בתפקודים בסיסיים ENS, וצפויה הקשורים בשינויים קלים, אינם מוערכים, אנטומיים ושינויים תפקודיים ב3-6 ENS. לכן, טכניקות שתאפשרנה לנו להבין את הגורמים התפתחותיים של היווצרות ENS עשויות לשפוך אור על הפתוגנזה וטיפול פוטנציאלי של הפרעות בדרכי עיכול בילדים. בעקבות הגירה והתישבות, NCC מבדיל לתוך הנוירונים עם סמנים ספציפיים לפנוטיפ העצבי שלהם. נוירונים כולינרגית מהווים כ 60% מתאי עצב מעיים 7, ויכולים להיות מזוהים על ידי מכתים לacetyltransferase כולין (צ&#39;אט), אנזים הסינתזה להנוירוטרנסמיטר אצטילכולין מעורר. מבחינה הסטורית, מנסה לדמיין נוירונים כולינרגית היו מבולבל על ידי שונה סגוליות אנטיגן של נוגדנים המכוונים נגד מערכת עצבים מרכזית (CNS) צ&#39;אט לעומת מערכת עצבים היקפית (PNS) צ&#39;אט 8-10. עם זאת, נוגדנים המכוונים נגד צ&#39;אט שליה להכיר שני צ&#39;אט המרכזי והיקפי 11-13, ויש לנו טכניקות מתוארות לאחרונה המאפשרות לvisualization של נוירונים כולינרגית ENS עם רגישות גבוהה מוקדם יותר בפיתוח מאשר הושג עם קווי כתב צ&#39;אט 14. כאן, אנו מציגים טכניקה לנתח, לתקן וimmunostaining של מערכת העיכול עוברי עכברית לדמיין ביטוי עצבי ENS בתאי עצב. למחקרים אלה, שנוצלנו עכברי הצ&#39;אט-Cre הזדווגו עם R26R: בעלי חיים tdTomato לייצר צ&#39;אט-Cre; R26R: floxSTOP עכברי tdTomato (המוגדרים כצ&#39;אט-Cre tdTomato ברחבי כתב היד): floxSTOP. בעלי חיים אלה ולאחר מכן היו הזדווגו עם עכברי כתב צ&#39;אט-GFP הומוזיגוטים, להשיג עכברים להביע שני כתבי ניאון המזהים ביטוי צ&#39;אט 14. שני בעלי חיים אלה הם כתב על רקע C57BL / 6J והם זמינים מסחריים (ג&#39;קסון מעבדות, בר הרבור, ME).

<table><tbody><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Oxoid</td><td>BR0014G</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher</td><td>S2</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Fisher</td><td>BP9221</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Fisher</td><td>BP1605</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petri dishes</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ-18 stereoscope</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ-18 stereoscope</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Fine science tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf tubes</td><td>VWR</td><td>20170-038</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech, Birmingham, AL</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>VWR</td><td>16004-330</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Nikon</td><td>Nikon A1</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

immunostaining to visualize murine enteric nervous system development

The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must then differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. Cholinergic neurons, a major neurotransmitter phenotype in the enteric nervous system, are identified by staining for choline acetyltransferase (ChAT), the synthesizing enzyme for acetylcholine. Historical efforts to visualize cholinergic neurons have been hampered by antibodies with differing specificities to central nervous system versus peripheral nervous system ChAT. We and others have overcome this limitation by using an antibody against placental ChAT, which recognizes both central and peripheral ChAT, to successfully visualize embryonic enteric cholinergic neurons. Additionally, we have compared this antibody to genetic reporters for ChAT and shown that the antibody is more reliable during embryogenesis. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.

שתארנו בעבר את הדור של עכברים המבטאים את שני כתבי ניאון GFP וtdTomato המזהים ביטוי צ&#39;אט 14. בקצרה, עכברי צ&#39;אט-Cre זווגו עם R26R: floxSTOP: בעלי חיים tdTomato לייצר צ&#39;אט-Cre; R26R: עכברי tdTomato (נקראים צ&#39;אט-Cre tdTomato): floxSTOP. בעלי חיים אלה ולאחר מכן היו הזדוו?...

Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining to Visualize Murine Enteric Nervous System Development at JoVE.com

צביעה חיסונית כדי להמחיש את התפתחות מערכת העצבים האנטרית של ה- Murine | ביולוגיה התפתחותית | וִידֵאוֹ

Immunostaining to Visualize Murine Enteric Nervous System Development

The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Neural crest cells differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.

Immunostaining לדמיין פיתוח מערכת עצבים Murine מעיים

The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must ...

immunostaining-to-visualize-murine-enteric-nervous-system-development

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Developmental Biology

Human Biology

Nervous System

SCIENTISTS IN ACTION

11.3K Views.  University of Wisconsin School of Medicine and Public Health. The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Neural crest cells differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.

Video: Immunostaining to Visualize Murine Enteric Nervous System Development

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Multimodal הדמיה של השתלת תא גזע במערכת העצבים המרכזית של עכברים

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Neuroscience

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

מכתים Immunofluorescent הר שלם של רשתית עכבר ילודים לחקר אנגיוגנזה<em&gt; בvivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls gastrointestinal motility. A procedure for the isolation and culture of a mixed population of neurons and glia from the myenteric plexus is described. The primary cultures can be maintained for over 7 days, with connections developing among the neurons and glia. The longitudinal muscle strip with the attached myenteric plexus is stripped from the underlying circular muscle of the mouse ileum or colon and subjected to enzymatic digestion. In sterile conditions, the isolated neuronal and glia population are preserved within the pellet following centrifugation and plated on coverslips. Within 24-48 hr, neurite outgrowth occurs and neurons can be identified by pan-neuronal markers. After two days in culture, isolated neurons fire action potentials as observed by patch clamp studies. Furthermore, enteric glia can also be identified by GFAP staining. A network of neurons and glia in close apposition forms within 5 - 7 days. Enteric neurons can be individually and directly studied using methods such as immunohistochemistry, electrophysiology, calcium imaging, and single-cell PCR. Furthermore, this procedure can be performed in genetically modified animals. This methodology is simple to perform and inexpensive. Overall, this protocol exposes the components of the enteric nervous system in an easily manipulated manner so that we may better discover the functionality of the ENS in normal and disease states.

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

<em&gt; חוץ גופייה</em&gt; הכנה של נוירונים enteric המבודדים וגליה ממקלעת Myenteric של העכבר הבוגר

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout the developing vertebrate embryo. In addition to providing peripheral glia and neurons, NCC generate melanocytes as well as most of the cranio-facial skeleton. NCC migration and differentiation is controlled by a combination of their axial origin along the neural tube and their exposure to regionally distinct extracellular cues. Such contribution of extracellular ligands is especially evident during the formation of the enteric nervous system (ENS), a complex interconnected network of neural ganglia that locally controls (among other things) gut muscle movement and intestinal motility. Most of the ENS is derived from a small initial pool of NCC that undertake a long journey in order to colonize - in a rostral to caudal fashion - the entire length of the prospective gut. Among several signaling pathways known to influence enteric NCC colonization, GDNF/RET signaling is recognized as the most important. Indeed, spatiotemporally controlled secretion of the RET ligand GDNF by the gut mesenchyme is chiefly responsible for the attraction and guidance of RET-expressing enteric NCC to and within the embryonic gut. Here, we describe an ex vivo cell migration assay, making use of a transgenic mouse line possessing fluorescently labeled NCC, which allows precise quantification of enteric NCC migration potential in the presence of various growth factors, including GDNF.

We present an ex vivo cell migration assay that allows precise quantification of enteric neural crest cell migration potential in the presence of various growth factors.

Assay נדידת תאים כמותיות לMurine אבות עצביים enteric

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

בהדמיה 2 + Ca Situ של מערכת העצבים המעיים

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

מוח עכבר עוברי מעורב תרביות תאים כדי לחקור זיהום וחסינות מולדת

Establishing Mixed Neuronal and Glial Cell Cultures from Embryonic Mouse Brains to Study Infection and Innate Immunity

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of neurons, astrocytes, oligodendrocytes, and microglia. Due to increasing efforts to replace and reduce animal use, a variety of in vitro cell culture systems have been developed to explore innate cell properties, which allow the development of therapeutics for CNS infections and pathologies. Whilst certain research questions can be addressed by human-based cell culture systems, such as (induced) pluripotent stem cells, working with human cells has its own limitations with regard to availability, costs, and ethics. Here, we describe a unique protocol for isolating and culturing cells from embryonic mouse brains. The resulting mixed neural cell cultures mimic several cell populations and interactions found in the brain in vivo. Compared to current equivalent methods, this protocol more closely mimics the characteristics of the brain and also garners more cells, thus allowing for more experimental conditions to be investigated from one pregnant mouse. Further, the protocol is relatively easy and highly reproducible. These cultures have been optimized for use at various scales, including 96-well based high throughput screens, 24-well microscopy analysis, and 6-well cultures for flow cytometry and reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) analysis. This culture method is a powerful tool to investigate infection and immunity within the context of some of the complexity of the CNS with the convenience of in vitro methods.

מחבר זרקור: ביסוס תרביות תאי עצב וגליה מעורבים ממוחות עכברים עובריים לחקר זיהום וחסינות מולדת  

This protocol presents a unique way of generating central nervous system cell cultures from embryonic day 17 mouse brains for neuro(immuno)logy research. This model can be analyzed using various experimental techniques, including RT-qPCR, microscopy, ELISA, and flow cytometry.

ביסוס תרביות תאי עצב וגליה מעורבים ממוחות עכברים עובריים לחקר זיהומים וחסינות מולדת

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of ...

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the biliary tract in Suncus murinus (S. murinus&#160;). First, the specimen was dissected from S. murinus and fixed in 4% paraformaldehyde (PFA). Second, an enzymatic treatment and potential endogenous peroxidase inactivation were performed. The specimen was then exposed to the primary antibody, anti-neurofilament protein antibody, for 3-6 days. It was then incubated with the secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase. The color reaction was revealed by reacting the specimen with a 3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) substrate. This method can be applied to analyze the innervation of all visceral organs. Furthermore, this protocol can also be adapted to test other neuronal antibodies, but optimization of the antibodies should be done first. This method was originally introduced by Kuratani and Tanaka1,2,3.

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

A whole-mount immunohistochemical approach, to visualize neurofilament protein expression in the extrahepatic biliary tract in Suncus murinus. is presented here. This protocol can be used to analyze the innervation of all visceral organs in S. murinus or other species.

באמצעות שיטת הר שלמה Immunohistochemical ללמוד את שימור של דרכי המרה<em&gt; סונקוס מורן</em

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the ...

Immunofluorescence Staining for Visualizing Proliferated Neural Stem Cells in Mouse Brain Sections

Source: Quintanilla, L. J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59237">Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates the procedure for staining newly proliferated neural stem cells in brain tissue sections using EdU incorporation, followed by immunofluorescence to visualize specific proteins, enhancing the understanding of cell dynamics and proliferation.

צביעת אימונופלואורסצנטיות להדמיית תאי גזע עצביים מתרבים באזורי מוח עכבר

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Immunohistochemistry

	...

Immunostaining לדמיין פיתוח מערכת עצבים Murine מעיים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Multimodal הדמיה של השתלת תא גזע במערכת העצבים המרכזית של עכברים

מכתים Immunofluorescent הר שלם של רשתית עכבר ילודים לחקר אנגיוגנזה

Assay נדידת תאים כמותיות לMurine אבות עצביים enteric

בהדמיה ^{2 +} Ca Situ של מערכת העצבים המעיים

ביסוס תרביות תאי עצב וגליה מעורבים ממוחות עכברים עובריים לחקר זיהומים וחסינות מולדת

ביסוס תרביות תאי עצב וגליה מעורבים ממוחות עכברים עובריים לחקר זיהומים וחסינות מולדת

ביסוס תרביות תאי עצב וגליה מעורבים ממוחות עכברים עובריים לחקר זיהומים וחסינות מולדת

באמצעות שיטת הר שלמה Immunohistochemical ללמוד את שימור של דרכי המרה

צביעת אימונופלואורסצנטיות להדמיית תאי גזע עצביים מתרבים באזורי מוח עכבר