אנו מודים דניס Flipo עצה עיבוד תמונה וניתוח, ודוד וו Silversides במעבדה שלו היה נוצר קו עכבר Gata4p [5KB]-GFP. מחקר במעבדה פילון ממומן על ידי CIHR, NSERC, FRQS וFRQNT.

שמירה על האתיקה ניסויים מעורבים עכברים בוצעו בעקבות המועצה קנדית להנחיות טיפול בבעלי חיים לטיפול ולמניפולציה של בעלי חיים המשמשים במחקר רפואי. פרוטוקולים הנוגעים למניפולציה של בעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של המוסד הרפואי מאוניברסיטת קוויבק במונטריאול (Comité Institutionnel דה ההגנה des ANIMAUX; מספר התייחסות 0512-R3-650-0513). 1. הכנת ג&#39;לי קולגן לעבוד בצורה סטרילית, מתחת למכסת מנוע בתרבית רקמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מלא 5x DMEM (המדיום החיוני שונה של הנשר) כולל אנטיביוטיקה סטנדרטית. ממיסים 3.37 גרם של אבקת DMEM ו0.925 גרם של NaHCO 3 ב20 מיליליטר מים. לעקר על ידי עובר דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. הוסף 2.5 מיליליטר של פניצילין 100x / סטרפטומיצין סטרילי ו25 מיליליטר של סרום שור עוברי חום מומת סטרילי. חנות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על קרח, לערבב 800 μlשל קולגן פתרון (3.77 מ&quot;ג / מיליליטר ב0.02 N חומצה אצטית, פילטר מעוקר), 600 μl של 5x DMEM המלא ו17 μl של 1 N NaOH. לדלל עם מים סטריליים כדי נפח סופי של 3 מיליליטר. כוללים גורמי גדילה רלוונטיים בתמהיל. אנו משתמשים בדרך כלל בGDNF 10 מיליליטר / ng כדי לעורר הגירת NCC enteric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקדה על 480 μl בכל טוב של שורה אחת בצלחת 24 גם. למנוע בועות. השורות שנותרו ניתן להשתמש כדי לבחון את השפעתם של גורמי גדילה אחרים על נדידת תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו קולגן פלמר שעה לפחות 1 בחממה סטרילית ב 37 ° C. </li></ol> 2. דיסקציה של בעלי חיים 16 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת הזדווגויות ולבדוק תקעי נרתיק למחרת בבוקר. E0.5 היום להיות בצהריים ביום תוסף הנרתיק נמצא, לבודד את הנקבה ולחכות 12 ימים עד E12.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברים בהריון עם isoflurane ולהרדים על ידי CO 2 שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסס את העכבר עם 70% אתנול. הרם את של הבטןקרובי משפחה ולפתוח את חלל הבטן עם מספריים לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרחם לתוך צלחת פטרי זכוכית מלאה קר כקרח PBS (פוספט שנאגרו מלוח). חותכים את הרחם באופן רוחבי בין נפיחויות deciduum פרט לבודד כל אתר השרשת עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה על כל אתר השתלה בנפרד בצלחת פטרי עוד כוס מלאה PBS קר כקרח. תחת מיקרוסקופ לנתח, להשתמש במלקחי קנס כדי להסיר את שכבת השריר של הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את שק החלמון הקרביים וamnion כדי לחשוף את העובר. היזהר בעת ניתוק כלי הדם שהצטרף לעובר שק חלמון השליה / קרביים, כפי שהם שזורים במעיים מתפתחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את ראשו של העובר בצוואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מלקחיים סגורים בחלל הבטן של עובר, בדיוק מעל הכבד בצבע אדום הכהה ולתת את המלקחיים פתוחים של עצמו (להפסיק הפעלת לחץ) כדי להפוך את הפתיחה רוחבית בחלל הבטן. משוך כלפי מטה את המלקחיים נפתחו לעברהקצה האחורי של העובר כדי לפתוח את הבטן לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את רקמת חיבור מאחורי הכבד ולמשוך את האומץ לצאת מהבטן, נזהר שלא לשבור את המעיים (המעי הגס מחובר אל פי הטבעת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את המעי הגס כדי לשחרר את האומץ משאר העובר. החתך יכול להיעשות בכל מקום לאורך המעי הגס. שומר לעצמנו את חלק הזנב למועד מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקניט את רקמת החיבור של cecum, ולאחר מכן את שאר קרבים. היזהר שלא לפצוע את המעיים תוך כדי כך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את הכבד וקיבה (בסוף מקורי של המעי הדק), כמו גם את הכליה בינים ורכסים באיברי המין, אם חלקם בהווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את המעי הדק. שוב, להיזהר שלא לקטוע את המעי. מעתה והלאה, את כיוון rosrrocaudal של רקמת המעי ניתן לעקוב באמצעות העקמומיות החדה ההווה בסוף מקורי. השאר את המעי הדק בPBS בטמפרטורת חדר למשך זמן קצר ביותר ככל האפשר לפניהםמצעים (ראה שלב 3.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, רשום את המספר של somites זנב לכל עובר כדי לקבוע את השלב של התפתחות עוברית באופן מדויק. </li></ol> 3. חתך של מעיים עובריים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שאמשיך עם ניתוחי עובר, להמס 1.5 agarose גרם ב100 מיליליטר PBS (פוספט שנאגרו מלוח) ולשמור ב50 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים נמס agarose לתוך עובש הטבעה (למשל סגר 2 צינור microcentrifuge מיליליטר שנחתך לאורכו לבלו על 1/4 מהצינור בקיר). בואו agarose להתקרר כ 42-45 מעלות צלזיוס, זה צריך להיות חם מעט רק למגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את המעי העוברי ממש לפני agarose מתמצק (זה יכול להיות מוערך עם טיפים מלקחיים ויתרחש סביב 36-38 מעלות צלזיוס). מחזיק את המעי עם מלקחיים עד הסוף מקורי המקופל, למשוך אותו באיטיות רבה דרך agarose לאורכו של העובש. זה עוזר לשמור על הבטן ישר ואילו ערכות agarose. שחרר את tלהנפיק ברגע שהיא מתחילה להתנגד מועברת. עקוב אחר הנטייה מקורי, הזנב של המעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את התבנית במקרר 2-3 דקות, כדי להבטיח את agarose יש להגדיר לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את agarose מהתבנית (על ידי הזזה מצינור Eppendorf פתח אותו). עם להב, להוציא את agarose העודף בשני הקצוות, ביצוע חתכים בניצב למעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדביקים את הסוף מקורי של המעי / agarose לחסום למטה על הבמה המתכת של microtome עם להב רוטט. חתוך את agarose העודף על הצדדים של בלוק המעי / agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עולה לבמת המתכת על חדר microtome הרוטט. במידת צורך, להתאים את הזווית של השלב כל כך המעי הוא אנכי ככל האפשר (ומכאן בניצב ללהב). כסה את הדגימה עם PBS קר כקרח. להביא את להב microtome עד כמה מילימטרים מתחת לפני שטח החיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 200 מיקרומטר vibratome רוחבי קיצוצים של מעי הזנב הכי קטן, על מנת להבטיח שדוארפרוסת agarose ach מכילה סעיף מעיים מלא. </li></ol> 4. תרבות של המעיים Explants <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להפקיד את פרוסות מעי / agarose טרי חתוך שטוחות על גבי ג&#39;ל קולגן עם מלקחיים, מניח פרוסה אחת לקראת אמצע היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 3 ימים על 37 מעלות צלזיוס, ב5% CO 2 אווירה לחה, כדי לאפשר הגירה של NCC מתוך explant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את פרוסות המעי / agarose את ג&#39;ל קולגן מאוד בעדינות עם מלקחיים. יש להיזהר שלא לגרום נזק לג&#39;ל בהמשך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנע מלגעת בג&#39;ל קולגן ישירות במהלך שלבי דגירה ולשטוף לאחר מכן על מנת להבטיח כי דפוס נדידת תאים אינו מופרע. לתקן עם 500 μl של PFA 4% (paraformaldehyde) (PBS) לכל שעה גם 1 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את מקבע עם 500 μl של DAPI (4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole) פתרון (5 מיקרוגרם / מיליליטר PBS) לכל היטב דגירה 10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף היטב כל אחד 3xעם 500 μl של PBS במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלם את תאי הניאון (ערוצי ה-GFP וDAPI) משובצים בג&#39;ל קולגן בתוך היטב כל אחד. </li></ol> 5. ניתוח תמונה אנחנו עשינו שימוש נרחב בImageJ 17 לעבד ולכמת את התמונות שנוצרו אחרי תרבות explant. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל על ידי ההדמיה שקופית מיקרומטר בהגדלה זהה כמו תמונות תא ניאון. מדוד את אורכו של מיקרון אחד בפיקסלים (באמצעות כלי קו ישר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את קנה המידה (ניתוח / סט קנה מידה; קלט מספר הפיקסלים / מיקרון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל תצלום הקרינה ה-GFP, לשנות את פורמט תמונה לגוונים אפור 8 סיביות (Image/Type/8-bit). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם עוצמת האות (תמונה / התאם / בהירות / ניגודיות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחת את רעשי רקע במידת צורך (תהליך / חיסור רקע; להתאים את רדיוס הכדור המתגלגל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת סף כדי להדגיש תאים וגושי תא (תמונה / התאם / סף),n להחיל קו פרשת מים לחלק את הגושים (תהליך / בינארי / פרשת מים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח חלקיקים כדי לציין אזורים של עניין (ROI) וליצור סטטיסטיקות מספר התא (ניתוח / ניתוח חלקיקים; מינימום גודל קבוצה שלא לכלול פיקסלים שנותרו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר אפשרויות מדידה לכלול בקוטר של Feret (ניתוח / מדידות סט). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבוצת ROIs ולמדוד בכללותה כדי לקבוע בקוטר של Feret, אינדיקציה של תא התפשטות (ניתוח / כלים / מנהל ROI / מנהל ROI / למדוד יותר / או, אז מנהל ROI / הוסף ו). </li></ol>

<ol>
	<li>Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evolution+of+the+neural+crest:+An+overview.">Development and evolution of the neural crest: An overview.</a> Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).</li><li>Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+genetics+of+Hirschsprung's+disease.">The developmental genetics of Hirschsprung's disease.</a> Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).</li><li>Obermayr, F., Hotta, R., Enomoto, H., Young, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+developmental+disorders+of+the+enteric+nervous+system.">Development and developmental disorders of the enteric nervous system.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 10 (1), 43-57 (2012).</li><li>Sasselli, V., Pachnis, V., Bursn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enteric+nervous+system.">The enteric nervous system.</a> Dev. Biol. 366 (1), 64-73 (2012).</li><li>Sanchez, M. P., Silos-Santiago, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+agenesis+and+the+absence+of+enteric+neurons+in+mice+lacking+GDNF.">Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF.</a> Nature. 382 (6586), 70-73 (1996).</li><li>Baynash, A. G., Hosoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+endothelin-3+with+endothelin-B+receptor+is+essential+for+development+of+epidermal+melanocytes+and+enteric+neurons.">Interaction of endothelin-3 with endothelin-B receptor is essential for development of epidermal melanocytes and enteric neurons.</a> Cell. 79 (7), 1277-1285 (1994).</li><li>Chalazonitis, A., Pham, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin-3+is+required+for+the+survival-differentiation+of+subsets+of+developing+enteric+neurons.">Neurotrophin-3 is required for the survival-differentiation of subsets of developing enteric neurons.</a> J. Neurosci. 21 (15), 5620-5636 (2001).</li><li>Goldstein, A. M., Brewer, K. C., Doyle, A. M., Nagy, N., Roberts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+is+necessary+for+neural+crest+cell+migration+and+ganglion+formation+in+the+enteric+nervous+system.">BMP signaling is necessary for neural crest cell migration and ganglion formation in the enteric nervous system.</a> Mech. Dev. 122 (6), 821-833 (2005).</li><li>Jiang, Y., Liu, M. T., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrins+and+DCC+in+the+guidance+of+migrating+neural+crest-derived+cells+in+the+developing+bowel+and+pancreas.">Netrins and DCC in the guidance of migrating neural crest-derived cells in the developing bowel and pancreas.</a> Dev. Biol. 258 (2), 364-384 (2003).</li><li>Ramalho-Santos, M., Melton, D. A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signals+regulate+multiple+aspects+of+gastrointestinal+development.">Hedgehog signals regulate multiple aspects of gastrointestinal development.</a> Development. 127 (12), 2763-2772 (2000).</li><li>Natarajan, D., Marcos-Gutierrez, C., Pachnis, V., de Graaf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+signaling+by+receptor+tyrosine+kinase+RET+for+the+directed+migration+of+enteric+nervous+system+progenitor+cells+during+mammalian+embryogenesis.">Requirement of signaling by receptor tyrosine kinase RET for the directed migration of enteric nervous system progenitor cells during mammalian embryogenesis.</a> Development. 129 (22), 5151-5160 (2002).</li><li>Young, H. M., Hearn, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDNF+Is+a+chemoattractant+for+enteric+neural+cells.">GDNF Is a chemoattractant for enteric neural cells.</a> Dev. Biol. 229 (2), 503-516 (2001).</li><li>Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirschsprung+disease,+associated+syndromes+and+genetics:+a+review.">Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review.</a> J. Med. Genet. 45 (1), 1-14 (2008).</li><li>Pilon, N., Raiwet, D., Viger, R. S., Silversides, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+pre-+and+post-gastrulation+expression+of+Gata4+within+cells+of+the+inner+cell+mass+and+migratory+neural+crest+cells.">Novel pre- and post-gastrulation expression of Gata4 within cells of the inner cell mass and migratory neural crest cells.</a> Dev. Dyn. 237 (4), 1133-1143 (2008).</li><li>Nagy, N., Goldstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-3+regulates+neural+crest+cell+proliferation+and+differentiation+in+the+hindgut+enteric+nervous+system.">Endothelin-3 regulates neural crest cell proliferation and differentiation in the hindgut enteric nervous system.</a> Dev. Biol. 293 (1), 203-217 (2006).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersen, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , 209-250 (2003).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Byth, K. F., Thomas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AZD5438,+a+potent+oral+inhibitor+of+cyclin-dependent+kinases+1,+2,+and+9,+leads+to+pharmacodynamic+changes+and+potent+antitumor+effects+in+human+tumor+xenografts.">AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts.</a> Mol. Cancer Ther. 8 (7), 1856-1866 (2009).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

אנו מראים כיצד vivo לשעבר טכניקת תרבות explant שלנו יכולה לשמש כדי לכמת באופן מדויק את פוטנציאל הגירת NCC enteric בנוכחות GDNF. כימות מדויק כזה הוא הקל מאוד על ידי שימוש 200 חלקי מעיים vibratome מיקרומטר עבים במקום חתיכות גדולות של גודל משוער, כפי שתואר 11,12,15 בעבר. ואכן, זה מאפ?...

תאי רכס עצביים (NCC) הם סוג תא חולף ייחודי לבעלי חוליות שמהווה נגזרים רבים במהלך ההתפתחות העובר. אוכלוסיית תא זו מתעוררת בגבול של הצלחת העצבית, סמוך להאאקטודרם אינו עצבי 1. במהלך neurulation, כיפוף של מקומות צלחת העצביים NCC לאורך קצה הגב של הצינור העצבי ויוצרים. NCC אז לעבור מעבר אפיתל-mesenchymal, הפרדה ונודדות הרחק בצינור העצבי. NCC ליישב מבנים עובריים שונים, כולל מערכת העיכול שבו הם יוצרים את כל מערכת העצבים enteric (ENS), רשת מקושרת ביניהם של הגרעינים עצביים מוטבעת בדופן המעי. כפי שנסקר 2,3 לאחרונה, גנים רבים היו מעורבים בפיתוח של המבנה המורכב הזה. רוב ENS נגזר מברכה קטנה של מקור NCC מצינור מחנק העצבי (כלומר סביב הגבול למוח האחורי / חוט השדרה הפוטנציאלי) 4.אבות עצביים אלה מגיעים למעי הקדמי סביב היום העוברי (ה) 9.0 בעכברים ולאחר מכן להעביר caudally בתוך mesenchyme הבטן עד כ e15.0 ליישב את המעיים העובריים כולה. קבוצת משנה של קטין אבות עצביים במעי הגס הוא גם סיפקה ידי NCC עצם העצה, שיפלוש הבטן האחורית בכיוון ההפוך עד cecum 4. NCC שני מחנק ועצם העצה דורש מספר רב של הגירה, שגשוג, הישרדות ורמזי קידום בידול כדי להבטיח היווצרות של ENS מלא. בהקשר זה, מודלים של בעלי חיים - עכברים מהונדסים גנטי במיוחד - כבר סייעו בזיהוי של מספר ligands תאי החיוני: GDNF (גורם נוירוטרופי שמקורן בתאים גליה),,, (חלבוני morphogenic עצם) BMPs אנדותלין-3 neurotrophin-3, Netrin , כמו גם סוניק וההודי קיפוד (ששש וIHH) 5-10. מתוכם, GDNF איתות דרך RET טירוזין קינאז רצפטור הטרנסממברני (Rearranged במהלך transfection) מוכר כהדואר נתיב הקריטי ביותר לאטרקציה והדרכתו של NCC ולבתוך הבטן העוברית. GDNF מופרש על ידי mesenchyme המעיים ויוצר שיפוע rosrrocaudal spatiotemporally מבוקר שהוא ישירות chemoattractive לNCC enteric, המבטא RET 11,12. בין פונקציות אחרות, ENS מסדיר תנועה בתוך מערכת העיכול דרך האינטראקציה שלו עם שריר חלק שבדופן המעי. היעדרם של הגרעינים עצביים באזור הטרמינל של תוצאות המעי במחלת הירשפרונג: התכווצות טוניק של המגזר המושפע מוביל לחסימה, הצטברות במעלה הזרם של חומר מתעכל והתנפחות מסיבית של המעי והבטן. מחלת הירשפרונג מתרחשת כ אחד 5,000 לידה חי. דפוס הגירת rostro-הזנב של NCC enteric הוא האמין להיות הגורם העיקרי התורמים לאטיולוגיה של מחלת הירשפרונג. המעי הגס, הרחוק ביותר מהמקור הנודד NCC והחלק האחרון של bowel שאפשר לכבוש, הוא רגיש ביותר לפגמים בהיווצרות ENS. בהתאם לתפקיד המכריע שלה בהגירה NCC enteric, שיבוש איתות GDNF / RET הוא הגורם הגנטי הידוע העיקרי של מחלת הירשפרונג 13. כדי ללמוד טוב יותר NCC ופיתוח ENS, אנחנו שנוצרנו קו מהונדס עכבר - בשם Gata4p [5KB]-GFP 14 - בי NCC נדידה מסומנים עם חלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP). בשלב הבא אנו שיכללתי לשעבר assay vivo נדידת תאים, מותאם מעבודה שפורסמה על ידי קבוצות אחרות 11,12,15, שכעת מאפשר כימות מדויק של פוטנציאל הגירת NCC enteric בנוכחות של גורמי גדילה שונים, כגון GDNF.

<table><tbody><tr><td>DMEM powder</td><td>Wisent</td><td>219-010-XK</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Bioshop</td><td>SOB999</td><td>Biotechnology grade</td></tr><tr><td>Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron)</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomycin solution, 100x</td><td>Wisent</td><td>450-201-EL</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Wisent</td><td>095-150</td><td>High quality grade</td></tr><tr><td>Collagen I</td><td>BD biosciences</td><td>354236</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Bioshop</td><td>SHY700</td><td>Diluted from 10 N stock then sterile-filtered</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Cedarlane</td><td>CLCYT305</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Falcon 24-well Plate</td><td>BD biosciences</td><td>353047</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dissecting scissors</td><td>Fisher Scientific</td><td>089515</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glass Petri dish</td><td>VWR</td><td>89000-306</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td>Cell culture grade</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>M125</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA001</td><td>Biotechnology grade</td></tr><tr><td>Surgical blade</td><td>Feather</td><td>21</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>All Purpose Instant Krazy Glue Pen</td><td>Krazy Glue</td><td>KG824</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HM 650V Vibrating-Blade Microtome</td><td>Thermo Scientific</td><td>920110</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;Table of specific reagents and equipment.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

a quantitative cell migration assay for murine enteric neural progenitors

תאי רכס עצביים (NCC) הם אוכלוסיית תאים חולפת וmultipotent שמקורו בצינור העצבי הגבי ונודדת בהרחבה לאורך כל עובר חוליות המתפתחת. בנוסף לאספקת גליה ותאי עצב היקפיים, NCC ליצור מלנוציטים כמו גם רוב שלד קרניו-פנים. הגירת NCC והבידול נשלט על ידי שילוב של מוצא הצירי שלהם יחד בצינור העצבי ואת החשיפה שלהם לאותות תאיים אזורי שונים. תרומה כזו של ligands תאי באה לידי ביטוי במיוחד בתקופת היווצרותה של מערכת העצבים enteric (ENS), רשת מורכבת ביניהם של הגרעינים עצביים השולטת באופן מקומי (בין השאר) תנועת שרירים בטן ואת תנועתיות מעיים. רוב ENS נגזר מברכה ראשונית קטנה של NCC שמתחייב למסע ארוך על מנת ליישב - במקורי לאופנה הזנב - לכל אורכו של המעי הפוטנציאלי. בין כמה מסלולי איתות ידועיםלהשפיע קולוניזציה NCC enteric, GDNF / איתות RET מוכרת כחשוב ביותר. ואכן, הפרשת spatiotemporally המבוקר של ליגנד RET GDNF ידי mesenchyme הבטן היא בעיקר אחראית למשיכה והדרכתו של NCC enteric-להביע RET ולבתוך הבטן העוברית. כאן, אנו מתארים vivo לשעבר assay נדידת תאים, מה שהופך את שימוש בקו עכבר מהונדס בעלי NCC שכותרתו fluorescently, המאפשר כימות מדויק של פוטנציאל הגירת NCC enteric בנוכחות של גורמי גדילה שונים, כולל GDNF.

התוצאות הבאות הן נציג של מה שניתן להשיג עם הטכניקה שתוארה כאן (איור 1). השימוש בגורמי גדילה (כלומר GDNF) מגרה הגירה של NCC enteric מתוך explant המעיים ולג&#39;ל קולגן-GFP-לבטא (איור 2). למרות שחלק מהתאים לצאת מexplant בהעדר גורמי גדילה, אלה הם בעיקר לא-GFP שכותרתו ויצי?...

Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors at JoVE.com

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

אנו מציגים vivo לשעבר assay נדידת תאים המאפשר כימות מדויק של פוטנציאל נדידת תאי רכס העצבי enteric בנוכחות של גורמי גדילה שונים.

Assay נדידת תאים כמותיות לMurine אבות עצביים enteric

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

a-quantitative-cell-migration-assay-for-murine-enteric-neural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.2K Views.  UQAM.  אנו מציגים vivo לשעבר assay נדידת תאים המאפשר כימות מדויק של פוטנציאל נדידת תאי רכס העצבי enteric בנוכחות של גורמי גדילה שונים. 

Video: A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

שדה חשמלי מבוקר בימוי הגירה של ובתאים עצביות בסביבות 2 ד ו 3D

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Bioengineering

An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) describes the process of epithelium transdifferentiating into mesenchyme. EMT is a fundamental process during embryonic development that also commonly occurs in glioblastoma, the most frequent malignant brain tumor. EMT has also been observed in multiple carcinomas outside the brain including breast cancer, lung cancer, colon cancer, gastric cancer. EMT is centrally linked to malignancy by promoting migration, invasion and metastasis formation. The mechanisms of EMT induction are not fully understood. Here we describe an in vitro system for standardized isolation of cortical neural stem cells (NSCs) and subsequent EMT-induction. This system provides the flexibility to use either single cells or explant culture. In this system, rat or mouse embryonic forebrain NSCs are cultured in a defined medium, devoid of serum and enzymes. The NSCs expressed Olig2 and Sox10, two transcription factors observed in oligodendrocyte precursor cells (OPCs). Using this system, interactions between FGF-, BMP- and TGF&#946;-signaling involving Zeb1, Zeb2, and Twist2 were observed where TGF&#946;-activation significantly enhanced cell migration, suggesting a synergistic BMP-/TGF&#946;-interaction. The results point to a network of FGF-, BMP- and TGF&#946;-signaling to be involved in EMT induction and maintenance. This model system is relevant to investigate EMT in vitro. It is cost-efficient and shows high reproducibility. It also allows for the comparison of different compounds with respect to their migration responses (quantitative distance measurement), and high-throughput screening of compounds to inhibit or enhance EMT (qualitative measurement). The model is therefore well suited to test drug libraries for substances affecting EMT.

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.

Enzyme- ואת הסרום ללא דגם תרבית תאי גזע עצבי לחקירות EMT המתאימים גילוי תרופות

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) describes the process of epithelium transdifferentiating into mesenchyme. EMT is a fundamental process during ...

Developmental Biology

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is largely due to the difficulty with which one can create a cell-compatible and steady microenvironment using conventional microfabrication techniques and materials. We address this problem via the introduction of a novel microfabrication material, agarose gel, as the base material for the microfluidic device. Agarose gel is highly malleable, and permeable to gas and nutrients necessary for cell survival, and thus an ideal material for cell-based assays. We have shown previously that agarose gel based devices have been successful in studying bacterial and neutrophil cell migration2. In this report, three parallel microfluidic channels are patterned in an agarose gel membrane of about 1mm thickness. Constant flows with media/buffer are maintained in the two side channels using a peristaltic pump. Cells are maintained in the center channel for observation. Since the nutrients and chemicals in the side channels are constantly diffusing from the side to center channel, the chemical environment of the center channel is easily controlled via the flow along the side channels. Using this device, we demonstrate that the movement of neural stem cells can be monitored optically with ease under various chemical conditions, and the experimental results show that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells. Motility of neural stem cells is an important biomarker for assessing cells aggressiveness, thus tumorigenic factor3. Deciphering the mechanism underlying NSC motility will yield insight into both disorders of neural development and into brain cancer stem cell invasion.

We demonstrate that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells(NSCs) using a novel agarose gel based microfluidic device. This technology can be readily adaptable to other mammalian cell systems where cell sources are scarce, such as human neural stem cells, and the turn around time is critical.

הערכת תנועתיות עצבי לתאי גזע באמצעות התקן הג&#39;ל מבוסס agarose Microfluidic

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Biology

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

The discovery of neural stem and progenitor cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult mammalian brain has led to a body of research aimed at utilizing the multipotent and proliferative properties of these cells for the development of neuroregenerative strategies. A critical step for the success of such strategies is the mobilization of NPCs toward a lesion site following exogenous transplantation or to enhance the response of the endogenous precursors that are found in the periventricular region of the CNS. Accordingly, it is essential to understand the mechanisms that promote, guide, and enhance NPC migration. Our work focuses on the utilization of direct current electric fields (dcEFs) to promote and direct NPC migration - a phenomenon known as galvanotaxis. Endogenous physiological electric fields function as critical cues for cell migration during normal development and wound repair. Pharmacological disruption of the trans-neural tube potential in axolotl embryos causes severe developmental malformations1. In the context of wound healing, the rate of repair of wounded cornea is directly correlated with the magnitude of the epithelial wound potential that arises after injury, as shown by pharmacological enhancement or disruption of this dcEF2-3. We have demonstrated that adult subependymal NPCs undergo rapid and directed cathodal migration in vitro when exposed to an externally applied dcEF. In this protocol we describe our lab's techniques for creating a simple and effective galvanotaxis assay for high-resolution, long-term observation of directed cell body translocation (migration) on a single-cell level. This assay would be suitable for investigating the mechanisms that regulate dcEF transduction into cellular motility through the use of transgenic or knockout mice, short interfering RNA, or specific receptor agonists/antagonists.

In this protocol we demonstrate how to construct custom chambers that permit the application of a direct current electric field to enable time-lapse imaging of adult brain derived neural precursor cell translocation during galvanotaxis.

Assay Galvanotaxis לניתוח של קינטיקס נדידת תאים העצביים המבשר בשדה חשמלי נוכחי לשימוש חיצוני ישיר

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and neurite outgrowth; and later stages characterized by axon/dendrite outgrowth and synapse formation. In neurodevelopmental disorders, often one or more of these processes are disrupted, leading to abnormalities in brain formation and function. With the advent of human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology, researchers now have an abundant supply of human cells that can be differentiated into virtually any cell type, including neurons. These cells can be used to study both normal brain development and disease pathogenesis. A number of protocols using hiPSCs to model neuropsychiatric disease use terminally differentiated neurons or use 3D culture systems termed organoids. While these methods have proven invaluable in studying human disease pathogenesis, there are some drawbacks. Differentiation of hiPSCs into neurons and generation of organoids are lengthy and costly processes that can impact the number of experiments and variables that can be assessed. In addition, while post-mitotic neurons and organoids allow the study of disease-related processes, including dendrite outgrowth and synaptogenesis, they preclude the study of earlier processes like proliferation and migration. In neurodevelopmental disorders, such as autism, abundant genetic and post-mortem evidence indicates defects in early developmental processes. Neural precursor cells (NPCs), a highly proliferative cell population, may be a suitable model in which to ask questions about ontogenetic processes and disease initiation. We now extend methodologies learned from studying development in mouse and rat cortical cultures to human NPCs. The use of NPCs allows us to investigate disease-related phenotypes and define how different variables (e.g., growth factors, drugs) impact developmental processes including proliferation, migration, and differentiation in only a few days. Ultimately, this toolset can be used in a reproducible and high-throughput manner to identify disease-specific mechanisms and phenotypes in neurodevelopmental disorders.

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

Neurodevelopmental processes such as proliferation, migration, and neurite outgrowth are often perturbed in neuropsychiatric diseases. Thus, we present protocols to rapidly and reproducibly assess these neurodevelopmental processes in human iPSC-derived NPCs. These protocols also allow the assessment of the effects of relevant growth factors and therapeutics on NPC development.

זיהוי מהיר של פנוטיפים התפתחותיות בתאי האדם קודמן עצבית (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative neurology. This directive has arisen from the extensive evidence that brain repair is achieved after focal or systemic NPC transplantation in several preclinical models of neurological diseases.
These experimental data have identified the cell delivery route as one of the main hurdles of restorative stem cell therapies for brain diseases that requires urgent assessment. Intraparenchymal stem cell grafting represents a logical approach to those pathologies characterized by isolated and accessible brain lesions such as spinal cord injuries and Parkinson's disease. Unfortunately, this principle is poorly applicable to conditions characterized by a multifocal, inflammatory and disseminated (both in time and space) nature, including multiple sclerosis (MS). As such, brain targeting by systemic NPC delivery has become a low invasive and therapeutically efficacious protocol to deliver cells to the brain and spinal cord of rodents and nonhuman primates affected by experimental chronic inflammatory damage of the central nervous system (CNS).
This alternative method of cell delivery relies on the NPC pathotropism, specifically their innate capacity to (i) sense the environment via functional cell adhesion molecules and inflammatory cytokine and chemokine receptors; (ii) cross the leaking anatomical barriers after intravenous (i.v.) or intracerebroventricular (i.c.v.) injection; (iii) accumulate at the level of multiple perivascular site(s) of inflammatory brain and spinal cord damage; and (i.v.) exert remarkable tissue trophic and immune regulatory effects onto different host target cells in vivo.
Here we describe the methods that we have developed for the i.v. and i.c.v. delivery of syngeneic NPCs in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), as model of chronic CNS inflammatory demyelination, and envisage the systemic stem cell delivery as a valuable technique for the selective targeting of the inflamed brain in regenerative neurology.

The transplantation of neural stem/progenitor cells (NPCs) holds great promises in regenerative neurology. The systemic delivery of NPCs has turned into effective, low invasive, and therapeutically very efficacious protocol to deliver stem cells in the brain and spinal cord of rodents and nonhuman primates affected by experimental chronic inflammatory damage of the central nervous system.

הזרקה מערכתית של תאי גזע / אב עצביים בעכברים עם EAE כרוני

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

Immunology and Infection

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted area of the brain, neural stem cells proliferate and constantly generate neuroblasts that migrate tangentially in chains along the rostral migratory stream (RMS) to reach the olfactory bulb (OB). Once in the OB, neuroblasts switch to radial migration and then differentiate into mature neurons able to incorporate into the preexisting neuronal network. Proper neuroblast migration is a fundamental step in neurogenesis, ensuring the correct functional maturation of newborn neurons. Given the ability of SVZ-derived neuroblasts to target injured areas in the brain, investigating the intracellular mechanisms underlying their motility will not only enhance the understanding of neurogenesis but may also promote the development of neuroregenerative strategies.
This manuscript describes a detailed protocol for the transfection of primary rodent RMS postnatal neuroblasts and the analysis of their motility using a 3D in vitro migration assay recapitulating their mode of migration observed in vivo. Both rat and mouse neuroblasts can be quickly and efficiently transfected via nucleofection with either plasmid DNA, small hairpin (sh)RNA or short interfering (si)RNA oligos targeting genes of interest. To analyze migration, nucleofected cells are reaggregated in &#39;hanging drops&#39; and subsequently embedded in a three-dimensional matrix. Nucleofection per se does not significantly impair the migration of neuroblasts. Pharmacological treatment of nucleofected and reaggregated neuroblasts can also be performed to study the role of signaling pathways involved in neuroblast migration.

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Neuroblast migration is a crucial step in postnatal neurogenesis. The protocol described here can be used to investigate the role of candidate regulators of neuroblast migration by employing DNA/small hairpin RNA (shRNA) nucleofection and a 3D migration assay with neuroblasts isolated from the rodent postnatal rostral migratory stream.

Nucleofection של neuroblasts מכרסמים לחקר הגירת neuroblast<em&gt; במבחנה</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

הגירה, כימותרפיה-אטרקציה, ושיתוף התרבות Assays בשביל הגזע האנושי תאים הנגזרת האנדותל והנוירונים

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

הדמיה של דינמיקה של תאי עצב ותאי גלייה במוח עכבר מתפתח

Time-Lapse Imaging of Migrating Neurons and Glial Progenitors in Embryonic Mouse Brain Slices

During the development of the cerebral cortex, neurons and glial cells originate in the ventricular zone lining the ventricle and migrate toward the brain surface. This process is crucial for proper brain function, and its dysregulation can result in neurodevelopmental and psychiatric disorders after birth. In fact, many genes responsible for these diseases have been found to be involved in this process, and therefore, revealing how these mutations affect cellular dynamics is important for understanding the pathogenesis of these diseases. This protocol introduces a technique for time-lapse imaging of migrating neurons and glial progenitors in brain slices obtained from mouse embryos. Cells are labeled with fluorescent proteins using in utero electroporation, which visualizes individual cells migrating from the ventricular zone with a high signal-to-noise ratio. Moreover, this in vivo gene transfer system enables us to easily perform gain-of-function or loss-of-function experiments on the given genes by co-electroporation of their expression or knockdown/knockout vectors. Using this protocol, the migratory behavior and migration speed of individual cells, information that is never obtained from fixed brains, can be analyzed.

מחבר זרקור: חקר נדידת תאים ותפקידי גנים במוח המתפתח

During the development of the cerebral cortex, neurons and glial cells originate in the ventricular zone lining the ventricle and migrate toward the brain surface. Many genes are involved in this process. This protocol introduces the technique for the time-lapse imaging of migrating neurons and glial progenitors.

דימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה בפרוסות מוח עובריות של עכבר

During the development of the cerebral cortex, neurons and glial cells originate in the ventricular zone lining the ventricle and migrate toward the brain ...

Assay נדידת תאים כמותיות לMurine אבות עצביים enteric

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video