אנו מודים דניס Flipo עצה עיבוד תמונה וניתוח, ודוד וו Silversides במעבדה שלו היה נוצר קו עכבר Gata4p [5KB]-GFP. מחקר במעבדה פילון ממומן על ידי CIHR, NSERC, FRQS וFRQNT.

שמירה על האתיקה ניסויים מעורבים עכברים בוצעו בעקבות המועצה קנדית להנחיות טיפול בבעלי חיים לטיפול ולמניפולציה של בעלי חיים המשמשים במחקר רפואי. פרוטוקולים הנוגעים למניפולציה של בעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של המוסד הרפואי מאוניברסיטת קוויבק במונטריאול (Comité Institutionnel דה ההגנה des ANIMAUX; מספר התייחסות 0512-R3-650-0513). 1. הכנת ג&#39;לי קולגן לעבוד בצורה סטרילית, מתחת למכסת מנוע בתרבית רקמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מלא 5x DMEM (המדיום החיוני שונה של הנשר) כולל אנטיביוטיקה סטנדרטית. ממיסים 3.37 גרם של אבקת DMEM ו0.925 גרם של NaHCO 3 ב20 מיליליטר מים. לעקר על ידי עובר דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. הוסף 2.5 מיליליטר של פניצילין 100x / סטרפטומיצין סטרילי ו25 מיליליטר של סרום שור עוברי חום מומת סטרילי. חנות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על קרח, לערבב 800 μlשל קולגן פתרון (3.77 מ&quot;ג / מיליליטר ב0.02 N חומצה אצטית, פילטר מעוקר), 600 μl של 5x DMEM המלא ו17 μl של 1 N NaOH. לדלל עם מים סטריליים כדי נפח סופי של 3 מיליליטר. כוללים גורמי גדילה רלוונטיים בתמהיל. אנו משתמשים בדרך כלל בGDNF 10 מיליליטר / ng כדי לעורר הגירת NCC enteric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקדה על 480 μl בכל טוב של שורה אחת בצלחת 24 גם. למנוע בועות. השורות שנותרו ניתן להשתמש כדי לבחון את השפעתם של גורמי גדילה אחרים על נדידת תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו קולגן פלמר שעה לפחות 1 בחממה סטרילית ב 37 ° C. </li></ol> 2. דיסקציה של בעלי חיים 16 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת הזדווגויות ולבדוק תקעי נרתיק למחרת בבוקר. E0.5 היום להיות בצהריים ביום תוסף הנרתיק נמצא, לבודד את הנקבה ולחכות 12 ימים עד E12.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברים בהריון עם isoflurane ולהרדים על ידי CO 2 שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסס את העכבר עם 70% אתנול. הרם את של הבטןקרובי משפחה ולפתוח את חלל הבטן עם מספריים לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרחם לתוך צלחת פטרי זכוכית מלאה קר כקרח PBS (פוספט שנאגרו מלוח). חותכים את הרחם באופן רוחבי בין נפיחויות deciduum פרט לבודד כל אתר השרשת עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה על כל אתר השתלה בנפרד בצלחת פטרי עוד כוס מלאה PBS קר כקרח. תחת מיקרוסקופ לנתח, להשתמש במלקחי קנס כדי להסיר את שכבת השריר של הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את שק החלמון הקרביים וamnion כדי לחשוף את העובר. היזהר בעת ניתוק כלי הדם שהצטרף לעובר שק חלמון השליה / קרביים, כפי שהם שזורים במעיים מתפתחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את ראשו של העובר בצוואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מלקחיים סגורים בחלל הבטן של עובר, בדיוק מעל הכבד בצבע אדום הכהה ולתת את המלקחיים פתוחים של עצמו (להפסיק הפעלת לחץ) כדי להפוך את הפתיחה רוחבית בחלל הבטן. משוך כלפי מטה את המלקחיים נפתחו לעברהקצה האחורי של העובר כדי לפתוח את הבטן לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את רקמת חיבור מאחורי הכבד ולמשוך את האומץ לצאת מהבטן, נזהר שלא לשבור את המעיים (המעי הגס מחובר אל פי הטבעת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את המעי הגס כדי לשחרר את האומץ משאר העובר. החתך יכול להיעשות בכל מקום לאורך המעי הגס. שומר לעצמנו את חלק הזנב למועד מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקניט את רקמת החיבור של cecum, ולאחר מכן את שאר קרבים. היזהר שלא לפצוע את המעיים תוך כדי כך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את הכבד וקיבה (בסוף מקורי של המעי הדק), כמו גם את הכליה בינים ורכסים באיברי המין, אם חלקם בהווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את המעי הדק. שוב, להיזהר שלא לקטוע את המעי. מעתה והלאה, את כיוון rosrrocaudal של רקמת המעי ניתן לעקוב באמצעות העקמומיות החדה ההווה בסוף מקורי. השאר את המעי הדק בPBS בטמפרטורת חדר למשך זמן קצר ביותר ככל האפשר לפניהםמצעים (ראה שלב 3.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, רשום את המספר של somites זנב לכל עובר כדי לקבוע את השלב של התפתחות עוברית באופן מדויק. </li></ol> 3. חתך של מעיים עובריים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שאמשיך עם ניתוחי עובר, להמס 1.5 agarose גרם ב100 מיליליטר PBS (פוספט שנאגרו מלוח) ולשמור ב50 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים נמס agarose לתוך עובש הטבעה (למשל סגר 2 צינור microcentrifuge מיליליטר שנחתך לאורכו לבלו על 1/4 מהצינור בקיר). בואו agarose להתקרר כ 42-45 מעלות צלזיוס, זה צריך להיות חם מעט רק למגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את המעי העוברי ממש לפני agarose מתמצק (זה יכול להיות מוערך עם טיפים מלקחיים ויתרחש סביב 36-38 מעלות צלזיוס). מחזיק את המעי עם מלקחיים עד הסוף מקורי המקופל, למשוך אותו באיטיות רבה דרך agarose לאורכו של העובש. זה עוזר לשמור על הבטן ישר ואילו ערכות agarose. שחרר את tלהנפיק ברגע שהיא מתחילה להתנגד מועברת. עקוב אחר הנטייה מקורי, הזנב של המעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את התבנית במקרר 2-3 דקות, כדי להבטיח את agarose יש להגדיר לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את agarose מהתבנית (על ידי הזזה מצינור Eppendorf פתח אותו). עם להב, להוציא את agarose העודף בשני הקצוות, ביצוע חתכים בניצב למעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדביקים את הסוף מקורי של המעי / agarose לחסום למטה על הבמה המתכת של microtome עם להב רוטט. חתוך את agarose העודף על הצדדים של בלוק המעי / agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עולה לבמת המתכת על חדר microtome הרוטט. במידת צורך, להתאים את הזווית של השלב כל כך המעי הוא אנכי ככל האפשר (ומכאן בניצב ללהב). כסה את הדגימה עם PBS קר כקרח. להביא את להב microtome עד כמה מילימטרים מתחת לפני שטח החיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 200 מיקרומטר vibratome רוחבי קיצוצים של מעי הזנב הכי קטן, על מנת להבטיח שדוארפרוסת agarose ach מכילה סעיף מעיים מלא. </li></ol> 4. תרבות של המעיים Explants <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להפקיד את פרוסות מעי / agarose טרי חתוך שטוחות על גבי ג&#39;ל קולגן עם מלקחיים, מניח פרוסה אחת לקראת אמצע היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 3 ימים על 37 מעלות צלזיוס, ב5% CO 2 אווירה לחה, כדי לאפשר הגירה של NCC מתוך explant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את פרוסות המעי / agarose את ג&#39;ל קולגן מאוד בעדינות עם מלקחיים. יש להיזהר שלא לגרום נזק לג&#39;ל בהמשך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנע מלגעת בג&#39;ל קולגן ישירות במהלך שלבי דגירה ולשטוף לאחר מכן על מנת להבטיח כי דפוס נדידת תאים אינו מופרע. לתקן עם 500 μl של PFA 4% (paraformaldehyde) (PBS) לכל שעה גם 1 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את מקבע עם 500 μl של DAPI (4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole) פתרון (5 מיקרוגרם / מיליליטר PBS) לכל היטב דגירה 10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף היטב כל אחד 3xעם 500 μl של PBS במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלם את תאי הניאון (ערוצי ה-GFP וDAPI) משובצים בג&#39;ל קולגן בתוך היטב כל אחד. </li></ol> 5. ניתוח תמונה אנחנו עשינו שימוש נרחב בImageJ 17 לעבד ולכמת את התמונות שנוצרו אחרי תרבות explant. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל על ידי ההדמיה שקופית מיקרומטר בהגדלה זהה כמו תמונות תא ניאון. מדוד את אורכו של מיקרון אחד בפיקסלים (באמצעות כלי קו ישר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את קנה המידה (ניתוח / סט קנה מידה; קלט מספר הפיקסלים / מיקרון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל תצלום הקרינה ה-GFP, לשנות את פורמט תמונה לגוונים אפור 8 סיביות (Image/Type/8-bit). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם עוצמת האות (תמונה / התאם / בהירות / ניגודיות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחת את רעשי רקע במידת צורך (תהליך / חיסור רקע; להתאים את רדיוס הכדור המתגלגל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת סף כדי להדגיש תאים וגושי תא (תמונה / התאם / סף),n להחיל קו פרשת מים לחלק את הגושים (תהליך / בינארי / פרשת מים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח חלקיקים כדי לציין אזורים של עניין (ROI) וליצור סטטיסטיקות מספר התא (ניתוח / ניתוח חלקיקים; מינימום גודל קבוצה שלא לכלול פיקסלים שנותרו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר אפשרויות מדידה לכלול בקוטר של Feret (ניתוח / מדידות סט). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבוצת ROIs ולמדוד בכללותה כדי לקבוע בקוטר של Feret, אינדיקציה של תא התפשטות (ניתוח / כלים / מנהל ROI / מנהל ROI / למדוד יותר / או, אז מנהל ROI / הוסף ו). </li></ol>

<ol>
	<li>Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evolution+of+the+neural+crest:+An+overview.">Development and evolution of the neural crest: An overview.</a> Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).</li><li>Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+genetics+of+Hirschsprung's+disease.">The developmental genetics of Hirschsprung's disease.</a> Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).</li><li>Obermayr, F., Hotta, R., Enomoto, H., Young, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+developmental+disorders+of+the+enteric+nervous+system.">Development and developmental disorders of the enteric nervous system.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 10 (1), 43-57 (2012).</li><li>Sasselli, V., Pachnis, V., Bursn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enteric+nervous+system.">The enteric nervous system.</a> Dev. Biol. 366 (1), 64-73 (2012).</li><li>Sanchez, M. P., Silos-Santiago, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+agenesis+and+the+absence+of+enteric+neurons+in+mice+lacking+GDNF.">Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF.</a> Nature. 382 (6586), 70-73 (1996).</li><li>Baynash, A. G., Hosoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+endothelin-3+with+endothelin-B+receptor+is+essential+for+development+of+epidermal+melanocytes+and+enteric+neurons.">Interaction of endothelin-3 with endothelin-B receptor is essential for development of epidermal melanocytes and enteric neurons.</a> Cell. 79 (7), 1277-1285 (1994).</li><li>Chalazonitis, A., Pham, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin-3+is+required+for+the+survival-differentiation+of+subsets+of+developing+enteric+neurons.">Neurotrophin-3 is required for the survival-differentiation of subsets of developing enteric neurons.</a> J. Neurosci. 21 (15), 5620-5636 (2001).</li><li>Goldstein, A. M., Brewer, K. C., Doyle, A. M., Nagy, N., Roberts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+is+necessary+for+neural+crest+cell+migration+and+ganglion+formation+in+the+enteric+nervous+system.">BMP signaling is necessary for neural crest cell migration and ganglion formation in the enteric nervous system.</a> Mech. Dev. 122 (6), 821-833 (2005).</li><li>Jiang, Y., Liu, M. T., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrins+and+DCC+in+the+guidance+of+migrating+neural+crest-derived+cells+in+the+developing+bowel+and+pancreas.">Netrins and DCC in the guidance of migrating neural crest-derived cells in the developing bowel and pancreas.</a> Dev. Biol. 258 (2), 364-384 (2003).</li><li>Ramalho-Santos, M., Melton, D. A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signals+regulate+multiple+aspects+of+gastrointestinal+development.">Hedgehog signals regulate multiple aspects of gastrointestinal development.</a> Development. 127 (12), 2763-2772 (2000).</li><li>Natarajan, D., Marcos-Gutierrez, C., Pachnis, V., de Graaf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+signaling+by+receptor+tyrosine+kinase+RET+for+the+directed+migration+of+enteric+nervous+system+progenitor+cells+during+mammalian+embryogenesis.">Requirement of signaling by receptor tyrosine kinase RET for the directed migration of enteric nervous system progenitor cells during mammalian embryogenesis.</a> Development. 129 (22), 5151-5160 (2002).</li><li>Young, H. M., Hearn, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDNF+Is+a+chemoattractant+for+enteric+neural+cells.">GDNF Is a chemoattractant for enteric neural cells.</a> Dev. Biol. 229 (2), 503-516 (2001).</li><li>Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirschsprung+disease,+associated+syndromes+and+genetics:+a+review.">Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review.</a> J. Med. Genet. 45 (1), 1-14 (2008).</li><li>Pilon, N., Raiwet, D., Viger, R. S., Silversides, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+pre-+and+post-gastrulation+expression+of+Gata4+within+cells+of+the+inner+cell+mass+and+migratory+neural+crest+cells.">Novel pre- and post-gastrulation expression of Gata4 within cells of the inner cell mass and migratory neural crest cells.</a> Dev. Dyn. 237 (4), 1133-1143 (2008).</li><li>Nagy, N., Goldstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-3+regulates+neural+crest+cell+proliferation+and+differentiation+in+the+hindgut+enteric+nervous+system.">Endothelin-3 regulates neural crest cell proliferation and differentiation in the hindgut enteric nervous system.</a> Dev. Biol. 293 (1), 203-217 (2006).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersen, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , 209-250 (2003).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Byth, K. F., Thomas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AZD5438,+a+potent+oral+inhibitor+of+cyclin-dependent+kinases+1,+2,+and+9,+leads+to+pharmacodynamic+changes+and+potent+antitumor+effects+in+human+tumor+xenografts.">AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts.</a> Mol. Cancer Ther. 8 (7), 1856-1866 (2009).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

אנו מראים כיצד vivo לשעבר טכניקת תרבות explant שלנו יכולה לשמש כדי לכמת באופן מדויק את פוטנציאל הגירת NCC enteric בנוכחות GDNF. כימות מדויק כזה הוא הקל מאוד על ידי שימוש 200 חלקי מעיים vibratome מיקרומטר עבים במקום חתיכות גדולות של גודל משוער, כפי שתואר 11,12,15 בעבר. ואכן, זה מאפ?...

תאי רכס עצביים (NCC) הם סוג תא חולף ייחודי לבעלי חוליות שמהווה נגזרים רבים במהלך ההתפתחות העובר. אוכלוסיית תא זו מתעוררת בגבול של הצלחת העצבית, סמוך להאאקטודרם אינו עצבי 1. במהלך neurulation, כיפוף של מקומות צלחת העצביים NCC לאורך קצה הגב של הצינור העצבי ויוצרים. NCC אז לעבור מעבר אפיתל-mesenchymal, הפרדה ונודדות הרחק בצינור העצבי. NCC ליישב מבנים עובריים שונים, כולל מערכת העיכול שבו הם יוצרים את כל מערכת העצבים enteric (ENS), רשת מקושרת ביניהם של הגרעינים עצביים מוטבעת בדופן המעי. כפי שנסקר 2,3 לאחרונה, גנים רבים היו מעורבים בפיתוח של המבנה המורכב הזה. רוב ENS נגזר מברכה קטנה של מקור NCC מצינור מחנק העצבי (כלומר סביב הגבול למוח האחורי / חוט השדרה הפוטנציאלי) 4.אבות עצביים אלה מגיעים למעי הקדמי סביב היום העוברי (ה) 9.0 בעכברים ולאחר מכן להעביר caudally בתוך mesenchyme הבטן עד כ e15.0 ליישב את המעיים העובריים כולה. קבוצת משנה של קטין אבות עצביים במעי הגס הוא גם סיפקה ידי NCC עצם העצה, שיפלוש הבטן האחורית בכיוון ההפוך עד cecum 4. NCC שני מחנק ועצם העצה דורש מספר רב של הגירה, שגשוג, הישרדות ורמזי קידום בידול כדי להבטיח היווצרות של ENS מלא. בהקשר זה, מודלים של בעלי חיים - עכברים מהונדסים גנטי במיוחד - כבר סייעו בזיהוי של מספר ligands תאי החיוני: GDNF (גורם נוירוטרופי שמקורן בתאים גליה),,, (חלבוני morphogenic עצם) BMPs אנדותלין-3 neurotrophin-3, Netrin , כמו גם סוניק וההודי קיפוד (ששש וIHH) 5-10. מתוכם, GDNF איתות דרך RET טירוזין קינאז רצפטור הטרנסממברני (Rearranged במהלך transfection) מוכר כהדואר נתיב הקריטי ביותר לאטרקציה והדרכתו של NCC ולבתוך הבטן העוברית. GDNF מופרש על ידי mesenchyme המעיים ויוצר שיפוע rosrrocaudal spatiotemporally מבוקר שהוא ישירות chemoattractive לNCC enteric, המבטא RET 11,12. בין פונקציות אחרות, ENS מסדיר תנועה בתוך מערכת העיכול דרך האינטראקציה שלו עם שריר חלק שבדופן המעי. היעדרם של הגרעינים עצביים באזור הטרמינל של תוצאות המעי במחלת הירשפרונג: התכווצות טוניק של המגזר המושפע מוביל לחסימה, הצטברות במעלה הזרם של חומר מתעכל והתנפחות מסיבית של המעי והבטן. מחלת הירשפרונג מתרחשת כ אחד 5,000 לידה חי. דפוס הגירת rostro-הזנב של NCC enteric הוא האמין להיות הגורם העיקרי התורמים לאטיולוגיה של מחלת הירשפרונג. המעי הגס, הרחוק ביותר מהמקור הנודד NCC והחלק האחרון של bowel שאפשר לכבוש, הוא רגיש ביותר לפגמים בהיווצרות ENS. בהתאם לתפקיד המכריע שלה בהגירה NCC enteric, שיבוש איתות GDNF / RET הוא הגורם הגנטי הידוע העיקרי של מחלת הירשפרונג 13. כדי ללמוד טוב יותר NCC ופיתוח ENS, אנחנו שנוצרנו קו מהונדס עכבר - בשם Gata4p [5KB]-GFP 14 - בי NCC נדידה מסומנים עם חלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP). בשלב הבא אנו שיכללתי לשעבר assay vivo נדידת תאים, מותאם מעבודה שפורסמה על ידי קבוצות אחרות 11,12,15, שכעת מאפשר כימות מדויק של פוטנציאל הגירת NCC enteric בנוכחות של גורמי גדילה שונים, כגון GDNF.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM powder</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>219-010-XK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOB999</td>
			<td>Biotechnology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin solution, 100x</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>095-150</td>
			<td>High quality grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SHY700</td>
			<td>Diluted from 10 N stock then sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CLCYT305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 24-well Plate</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>089515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493</td>
			<td>Cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGA001</td>
			<td>Biotechnology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All Purpose Instant Krazy Glue Pen</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>KG824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HM 650V Vibrating-Blade Microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>920110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative cell migration assay for murine enteric neural progenitors

תאי רכס עצביים (NCC) הם אוכלוסיית תאים חולפת וmultipotent שמקורו בצינור העצבי הגבי ונודדת בהרחבה לאורך כל עובר חוליות המתפתחת. בנוסף לאספקת גליה ותאי עצב היקפיים, NCC ליצור מלנוציטים כמו גם רוב שלד קרניו-פנים. הגירת NCC והבידול נשלט על ידי שילוב של מוצא הצירי שלהם יחד בצינור העצבי ואת החשיפה שלהם לאותות תאיים אזורי שונים. תרומה כזו של ligands תאי באה לידי ביטוי במיוחד בתקופת היווצרותה של מערכת העצבים enteric (ENS), רשת מורכבת ביניהם של הגרעינים עצביים השולטת באופן מקומי (בין השאר) תנועת שרירים בטן ואת תנועתיות מעיים. רוב ENS נגזר מברכה ראשונית קטנה של NCC שמתחייב למסע ארוך על מנת ליישב - במקורי לאופנה הזנב - לכל אורכו של המעי הפוטנציאלי. בין כמה מסלולי איתות ידועיםלהשפיע קולוניזציה NCC enteric, GDNF / איתות RET מוכרת כחשוב ביותר. ואכן, הפרשת spatiotemporally המבוקר של ליגנד RET GDNF ידי mesenchyme הבטן היא בעיקר אחראית למשיכה והדרכתו של NCC enteric-להביע RET ולבתוך הבטן העוברית. כאן, אנו מתארים vivo לשעבר assay נדידת תאים, מה שהופך את שימוש בקו עכבר מהונדס בעלי NCC שכותרתו fluorescently, המאפשר כימות מדויק של פוטנציאל הגירת NCC enteric בנוכחות של גורמי גדילה שונים, כולל GDNF.

התוצאות הבאות הן נציג של מה שניתן להשיג עם הטכניקה שתוארה כאן (איור 1). השימוש בגורמי גדילה (כלומר GDNF) מגרה הגירה של NCC enteric מתוך explant המעיים ולג&#39;ל קולגן-GFP-לבטא (איור 2). למרות שחלק מהתאים לצאת מexplant בהעדר גורמי גדילה, אלה הם בעיקר לא-GFP שכותרתו ויצי?...

Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors at JoVE.com

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

אנו מציגים vivo לשעבר assay נדידת תאים המאפשר כימות מדויק של פוטנציאל נדידת תאי רכס העצבי enteric בנוכחות של גורמי גדילה שונים.

Assay נדידת תאים כמותיות לMurine אבות עצביים enteric

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

a-quantitative-cell-migration-assay-for-murine-enteric-neural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.2K Views.  UQAM.  אנו מציגים vivo לשעבר assay נדידת תאים המאפשר כימות מדויק של פוטנציאל נדידת תאי רכס העצבי enteric בנוכחות של גורמי גדילה שונים. 

Video: A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or thinned-skull 3 preparations. While the open-skull technique is very versatile, it is not optimal for studying microglia because it is invasive and can cause microglial activation. Even though the thinned-skull approach is minimally invasive, the repeated re-thinning of skull required for chronic imaging increases the risks of tissue injury and microglial activation and allows for a limited number of imaging sessions. Here we present a chronic thin-skull window method for monitoring murine microglia in vivo over an extended period of time using two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a stable, accessible, thinned-skull cortical window (TSCW) with an apposed glass coverslip that remains translucent over the course of three weeks of intermittent observation. This TSCW preparation is far more immunologically inert with respect to microglial activation than open craniotomy or repeated skull thinning and allows an arbitrary number of imaging sessions during a time period of weeks. We prepare TSCW in CX3CR1 GFP/+ mice 4 to visualize microglia with enhanced green fluorescent protein to &le;150 &mu;m beneath the pial surface. We also show that this preparation can be used in conjunction with stereotactic brain injections of the HIV-1 neurotoxic protein Tat, adjacent to the TSCW, which is capable of inducing durable microgliosis. Therefore, this method is extremely useful for examining changes in microglial morphology and motility over time in the living brain in models of HIV Associated Neurocognitive Disorder (HAND) and other neurodegenerative diseases with a neuroinflammatory component.

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

We describe a method for repeatedly visualizing murine microglia and circulating monocytes in vivo over hours, days or weeks using transcranial two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a thinned-skull window that allows intermittent observation of quiescent microglia that can be activated by adjacent stereotactic injection of the HIV-1 regulatory protein Tat.

הגולגולת דק חלון טכניקה כרונית דו פוטון ב-vivo הדמיה של microglia Murine של מודלים של Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

הקמת עכבר עובריים גזע עצביים תרבית תאים באמצעות Assay Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

עצבית, המושבה יצירת Assay נייד: Assay להפלות בונה תאים בתום גזע עצביים מן ובתאים עצבית

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after undergoing an epithelial-mesenchymal transition 1,2. Following EMT, NCCs migrate large distances along stereotypic pathways until they reach their targets. NCCs differentiate into a vast array of cell types including neurons, glia, melanocytes, and chromaffin cells 1-3. The ability of NCCs to reach and recognize their proper target locations is foundational for the appropriate formation of all structures containing trunk NCC-derived components 3. Elucidating the mechanisms of guidance for trunk NCC migration has therefore been a matter of great significance. Numerous molecules have been demonstrated to guide NCC migration 4. For instance, trunk NCCs are known to be repelled by negative guidance cues such as Semaphorin, Ephrin, and Slit ligands 5-8. However, not until recently have any chemoattractants of trunk NCCs been identified 9. 
Conventional in vitro approaches to studying the chemotactic behavior of adherent cells work best with immortalized, homogenously distributed cells, but are more challenging to apply to certain primary stem cell cultures that initially lack a homogenous distribution and rapidly differentiate (such as NCCs). One approach to homogenize the distribution of trunk NCCs for chemotaxis studies is to isolate trunk NCCs from primary NT explant cultures, then lift and replate them to be almost 100% confluent. However, this plating approach requires substantial amounts of time and effort to explant enough cells, is harsh, and distributes trunk NCCs in a dissimilar manner to that found in in vivo conditions. 
Here, we report an in vitro approach that is able to evaluate chemotaxis and other migratory responses of trunk NCCs without requiring a homogenous cell distribution. This technique utilizes time-lapse imaging of primary, unperturbed trunk NCCs inside a modified Zigmond chamber (a standard Zigmond chamber is described elsewhere10). By exposing trunk NCCs at the periphery of the culture to a chemotactant gradient that is perpendicular to their predicted natural directionality, alterations in migratory polarity induced by the applied chemotactant gradient can be detected. This technique is inexpensive, requires the culturing of only two NT explants per replicate treatment, avoids harsh cell lifting (such as trypsinization), leaves trunk NCCs in a more similar distribution to in vivo conditions, cuts down the amount of time between explantation and experimentation (which likely reduces the risk of differentiation), and allows time-lapse evaluation of numerous migratory characteristics.

An approach to analyze the migration of explanted cells (trunk neural crest cells) is described. This method is inexpensive, gentle, and capable of distinguishing chemotaxis from both chemokinesis and other influences on migratory polarity such as those derived from cell-cell interactions within the primary trunk neural crest cell culture.

ניתוח של נדידת תאים עצביות קרסט טרונק באמצעות Assay השתנה Zigmond הקאמרי

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

עכבר לשחזור Sciatic עצב קראש והערכה לאחר ההתחדשות של ניתוח הר שלם שריר

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. Chimeric avian embryos, in which quail donor tissue is transplanted into a chick embryo in ovo, combine the power of indelible genetic labeling of cell populations with the ease of manipulation presented by the avian embryo.
Quail-chick chimeras are a classical tool for tracing migratory neural crest cells (NCCs)1-3. NCCs are a transient migratory population of cells in the embryo, which originate in the dorsal region of the developing neural tube4. They undergo an epithelial to mesenchymal transition and subsequently migrate to other regions of the embryo, where they differentiate into various cell types including cartilage5-13, melanocytes11,14-20, neurons and glia21-32. NCCs are multipotent, and their ultimate fate is influenced by 1) the region of the neural tube in which they originate along the rostro-caudal axis of the embryo11,33-37, 2) signals from neighboring cells as they migrate38-44, and 3) the microenvironment of their ultimate destination within the embryo45,46. Tracing these cells from their point of origin at the neural tube, to their final position and fate within the embryo, provides important insight into the developmental processes that regulate patterning and organogenesis.
Transplantation of complementary regions of donor neural tube (homotopic grafting) or different regions of donor neural tube (heterotopic grafting) can reveal differences in pre-specification of NCCs along the rostro-caudal axis2,47. This technique can be further adapted to transplant a unilateral compartment of the neural tube, such that one side is derived from donor tissue, and the contralateral side remains unperturbed in the host embryo, yielding an internal control within the same sample2,47. It can also be adapted for transplantation of brain segments in later embryos, after HH10, when the anterior neural tube has closed47.
Here we report techniques for generating quail-chick chimeras via neural tube transplantation, which allow for tracing of migratory NCCs derived from a discrete segment of the neural tube. Species-specific labeling of the donor-derived cells with the quail-specific QCPN antibody48-56 allows the researcher to distinguish donor and host cells at the experimental end point. This technique is straightforward, inexpensive, and has many applications, including fate-mapping, cell lineage tracing, and identifying pre-patterning events along the rostro-caudal axis45. Because of the ease of access to the avian embryo, the quail-chick graft technique may be combined with other manipulations, including but not limited to lens ablation40, injection of inhibitory molecules57,58, or genetic manipulation via electroporation of expression plasmids59-61, to identify the response of particular migratory streams of NCCs to perturbations in the embryo's developmental program. Furthermore, this grafting technique may also be used to generate other interspecific chimeric embryos such as quail-duck chimeras to study NCC contribution to craniofacial morphogenesis, or mouse-chick chimeras to combine the power of mouse genetics with the ease of manipulation of the avian embryo.62

An approach for analyzing migration and eventual fate of avian neural crest cells in quail-chick chimeric embryos is described. This method is a simple and straightforward technique for tracing neural crest cells during migration and differentiation that are otherwise difficult to distinguish within an unmanipulated chick embryo.

ניתוח של הגירה קרסט בידול עצבית ועל ידי חוצה מינים להשתלות

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of the central nervous system (CNS); namely, astrocytes, oligodendrocytes and neurons. These characteristics make neural stem and progenitor cells an invaluable renewable source of cells for in vitro studies such as drug screening, neurotoxicology and electrophysiology and also for cell replacement therapy in many neurological diseases. In practice, however, heterogeneity of NSC progeny, low production of neurons and oligodendrocytes, and predominance of astrocytes following differentiation limit their clinical applications. Here, we describe a novel methodology for the generation and subsequent purification of immature neurons from murine NSC progeny using fluorescence activated cell sorting (FACS) technology. Using this methodology, a highly enriched neuronal progenitor cell population can be achieved without any noticeable astrocyte and bona fide NSC contamination. The procedure includes differentiation of NSC progeny isolated and expanded from E14 mouse ganglionic eminences using the neurosphere assay, followed by isolation and enrichment of immature neuronal cells based on their physical (size and internal complexity) and fluorescent properties using flow cytometry technology. Overall, it takes 5-7 days to generate neurospheres and 6-8 days to differentiate NSC progeny and isolate highly purified immature neuronal cells.

This video protocol demonstrates a novel method for the generation and subsequent purification of neuronal progenitor cells from a renewable source of neural stem cells (NSCs) based on their physical (size and internal granularity) and fluorescent properties using flow cytometry technology.

Assay Neuroblast: Assay לדור והעשרה של ובתאים העצבית הבחנה בין צאצאיהם גזע עצביים Cell שימוש cytometry זרימה

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

The discovery of neural stem and progenitor cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult mammalian brain has led to a body of research aimed at utilizing the multipotent and proliferative properties of these cells for the development of neuroregenerative strategies. A critical step for the success of such strategies is the mobilization of NPCs toward a lesion site following exogenous transplantation or to enhance the response of the endogenous precursors that are found in the periventricular region of the CNS. Accordingly, it is essential to understand the mechanisms that promote, guide, and enhance NPC migration. Our work focuses on the utilization of direct current electric fields (dcEFs) to promote and direct NPC migration - a phenomenon known as galvanotaxis. Endogenous physiological electric fields function as critical cues for cell migration during normal development and wound repair. Pharmacological disruption of the trans-neural tube potential in axolotl embryos causes severe developmental malformations1. In the context of wound healing, the rate of repair of wounded cornea is directly correlated with the magnitude of the epithelial wound potential that arises after injury, as shown by pharmacological enhancement or disruption of this dcEF2-3. We have demonstrated that adult subependymal NPCs undergo rapid and directed cathodal migration in vitro when exposed to an externally applied dcEF. In this protocol we describe our lab's techniques for creating a simple and effective galvanotaxis assay for high-resolution, long-term observation of directed cell body translocation (migration) on a single-cell level. This assay would be suitable for investigating the mechanisms that regulate dcEF transduction into cellular motility through the use of transgenic or knockout mice, short interfering RNA, or specific receptor agonists/antagonists.

In this protocol we demonstrate how to construct custom chambers that permit the application of a direct current electric field to enable time-lapse imaging of adult brain derived neural precursor cell translocation during galvanotaxis.

Assay Galvanotaxis לניתוח של קינטיקס נדידת תאים העצביים המבשר בשדה חשמלי נוכחי לשימוש חיצוני ישיר

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.