המחברים מבקשים להודות לכל חברי המעבדה ריינולדס באוניברסיטת פרנקלין רוזלינד לרפואה ומדע, ומעבדת חן דונג באוניברסיטת טקסס מרכז סרטן MD Anderson לאופטימיזציה של פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק לJMR מהמכונים הלאומי לבריאות (K22AI104941).

כל הליכי הניסוי מבוצעים תוך שימוש בפרוטוקולים שאושרו על ידי משרד בריאות הסביבה והבטיחות באוניברסיטת פרנקלין רוזלינד לרפואה ומדע. C57BL / 6 עכברים (שנרכשו מNCI) המשמשים לפרוטוקול זה שוכנו בתנאי הפתוגן ללא ספציפיים, וכל הניסויים בבעלי החיים בוצעו באמצעות פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת טיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים (IACUC) באוניברסיטת פרנקלין רוזלינד לרפואה ו מדע. 1. הכנה של מכשירים, ציוד, וריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות מעיל 48 היטב או 24 גם עם אנטי CD3 ואנטי CD28 (טבלה 1) בPBS סטרילי, מכסים ולעטוף בparafilm על מנת למנוע אידוי וזיהום, ולאחר מכן דגירה O / N ב 4 o C היום לפני T תא בידוד. לחלופין, h 1 בארות מעיל ב 37 o C. בצע תנאי Th0, Th1, Th2, וiTreg על ידי ציפוי שני אנטי-CD3 ואנטי-CD28 ב1μg / מיליליטר ב0.5-1 מ&quot;ל לטל נפח (צלחת 48-היטב). לTH17, אנחנו בדרך כלל מעיל אנטי-CD3 ב2 מיקרוגרם / מיליליטר ואנטי-CD28 ב1 מיקרוגרם / מיליליטר. הערה: מצאנו כי ריכוז אנטי-CD3 נמוך הוא אופטימלי עבור דור Th1, Th2, וiTreg תוך ריכוז אנטי-CD3 גבוה יותר הוא אופטימלי עבור דור TH17. לפיכך, יש טיטרציה אנטי-CD3 וריכוזים אנטי CD28 ומותאם למעבדות בודדות (טבלה 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר סט של כלים לנתיחה (מספריים ומלקחיים) על ידי פתרון החיטוי או חומר חיטוי. צינור או כוס קטנה המכילה 70% אתנול יהיה צורך העיקור מהיר של כלים בין ניתוחים. לבסוף, בקבוק תרסיס המכיל 70% אתנול יהיה צורך לחיטוי את פני השטח של העכבר לפני הנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן משטח לנתיחה על ידי לפפה חתיכה שטוחה של קלקר או לוח שעם ברדיד אלומיניום. סיכות או מחטים לנתח משמשות כדי לתקן את בעלי החיים במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מאכלים או צלחות לאיסוף tissues. אם רקמות איגום, 60mm מנות נפרדות המכילות 3ml של סטרילית PBS + 1% FBS (PBS +) לרקמות טחול ובלוטות לימפה הוא מספיק. אם רקמות שמירה מעכברים בודדים להפריד, להכין 1ml צלחת 24-המכיל גם של PBS + במספר הרצוי של בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת RPMI מלא לתרבית תאים וטרום חם לפני השימוש (טבלה 1). הערה: אנו משתמשים באופן שגרתי RPMI אבל מדיה אחרת כגון IMDM וDMEM עשויה להיות יעילה באותה מידה או מעולה בהתאם למעבדה והניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנטימטר Cut 2x2 ריבועים של רשת ניילון עם גודל נקבובית 120 מיקרומטר וחיטוי לעקר (טבלת 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: אם משתמש בתא המגנטי במהירות הגבוהה מיון מערכת כגון autoMACS להעשרת תאי CD4 +, ריצה טרום חמה ושטיפת מאגרים באמבט מים C 37 o כדי למנוע נזק למכונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: העשרה מומלץ להגדיל את התשואה ולהקטין מיון מיון זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלצעדי הכנה, פרט לנתיחה, צריכים להתבצע בברדס רקמת סטרילית תרבות. </li></ol> 2. בידוד של בלוטות לימפה וטחול מעכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את המספר הדרוש של בעלי חיים באמצעות טכניקה שאושרה על-מוסדי. השתמש C57BL / 6 נקבות עכברים, גיל 5-10 wks, בשל אחוז הגבוה שלהם של תאי T נאיביים ושומן בגוף נמוך יותר בהשוואה לגברים או לעכברים מבוגרים. הערה: תאים שנלקחו מעכברים ממין זכר יהיו לבצע באופן דומה במבחנה והצעדים הפרוטוקול יישארו זהים. נקבות עכברים, ישנים 5-10 wks, בדרך כלל יניבו 3-6 x 10 6 תאי CD4 + T נאיביים לכל עכבר. עם זאת, זנים השונים של עכברים באמצעות עלולים להשפיע על תשואה וביצועים. לדוגמא, תאים מעכברי C57BL / 6 הם טובים יותר ליצירת תאי Th1 תוך תאים מעכברי Balb.c טובים יותר ליצירת תאי Th2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים את הגפיים של בעלי החיים ולהצמיד אותם במקום, כפי שמוצג באיור 1. חותך את העור ארוךitudinally מפי הטבעת לסנטר והקפד לא לנקב רקמות עמוקות יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התפשטות לפתוח את העור עם מלקחיים ולהצמיד את העור במקום לאפשר גישה קלה לבלוטות הלימפה, כפי שמוצגת באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את בלוטות לימפה נגישות מהמקומות שמוצגים באיור 1. תופסת הבלוטה לימפה עם זוג המלקחיים תוך הפרדת רקמות עם עוד זוג המלקחיים תאפשר להסרת קלה. הנח את הרקמה בצלחת האוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את הטחול מהמיקום שמוצג באיור 1. במקרה זה, יש צורך בחיתוך זהיר להצפק כדי לקבל גישה לטחול. הנח את הרקמה בצלחת אוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התהליך אם יותר רקמות תהיה לקצור. אחרת להמשיך לשלבים הבאים. בשלב זה, לבצע את כל השלבים הנותרים על קרח עד הציפוי של תאי T לאחר המיון. </li></ol> 3. עיבוד רקמות וCD4 + העשרה<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את בלוטות הלימפה וטחול במנות שונות כדי להגדיל את התשואה וההכנות בלוטה לימפה תא אינו דורשות תמוגה כדורית אדומה, אשר עלול לגרום למוות לויקוציטים קטין. לכן, בשלבים הבאים מתארים שיטה לעיבוד אוכלוסיות טחול ובלוטות לימפה בנפרד ואחריו שילוב לפני תיוג למיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את הרקמה (טחול או בלוטות לימפה ותקווינה) מצלחת האוסף ומניחים בצלחת 60 מ&quot;מ חדשה המכילה 3 מיליליטר של PBS +. הנח זווית של ניילון סטרילי רשת על הרקמות באמצעות מלקחיים מעוקרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את צד האגודל של בוכנת מזרק (3-10 מיליליטר) ובעדינות לנפץ את הרקמה נגד הרשת. כמעט כל הרקמה צריך ללכת להשעיה. לחלופין, הנח את הרקמה בין שתי שקופיות חלבית autoclaved וחרק להשעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה ההשעיה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לשבור את הגושים מסיסים שנותרו. מניחים חתיכה מרובעת חדשה של רשת ניילון על הפתיחהצינור חרוטי 15 מ&quot;ל ולסנן את ההשעיה דרך להסיר את הפסולת שנותרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2-4 לבלוטה לימפה נוספת ורקמת טחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שההשעיה סוננה לתוך צינור 15 מ&quot;ל למלא את שארית הצינור עם PBS + ולהפוך כמה פעמים. צנטריפוגה התאים ב475 XG במשך 5 דקות ב 4 o C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתאי טחול, לשאוב צנטריפוגה הבאה supernatant ו resuspend התא גלולה ב 1 מיליליטר של קר כקרח פתרון 1X ACK לטחול דקות 1 לlyse אריתרוציטים. לאחר מכן להוסיף 10 מיליליטר של PBS + על גבי ACK, להפוך את הצינור, ו צנטריפוגות 475 XG במשך 5 דקות ב 4 o C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתאי בלוטה לימפה, לשאוב supernatant וגלול ב2ml של PBS +. אם ארצה ניתן לשלב הבאים עם תאי הטחול לאחר תמוגה ACK שלהם ושלב כביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant לאחר צנטריפוגה של splenocytes וגלול בעוד 10 מיליליטר של PBS +. בשלב זה ההשעיה בלוטות לימפה יכולה להיותdded על גבי ההשעיה הטחול אם נדרש איגום רקמה למיון. צנטריפוגות הצינור שוב ב475 XG במשך 5 דקות ב 4 o C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התא גלולה עכשיו יכול להיות מוכן להעשרת CD4. אם שלב זה לא יבוצע, להמשיך לשלבי הכנת המיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעשרת CD4 באמצעות מערכת מיון תא המגנטית במהירות הגבוהה, resuspend גלולה הסלולרי עם חרוזים CD4. בדרך כלל 15 μl של חרוזים מדוללים ב -85 μl של PBS + משמש לתייג רקמות מהעכבר 1. כבש את הנפח של תערובת חרוז לפי צורך, resuspend גלולה, ודגירה של 15-30 דקות ב 4 o C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של PBS +, להעביר את ההשעיה דרך ניילון לתוך צינור 15 מיליליטר חדש כדי להסיר שאריות, וצנטריפוגות שוב ב475 XG במשך 5 דקות ב 4 o C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב+ של PBS לכל עכבר 100 μl ולהמשיך לבחירה חיובית על מערכת תא מגנטי במהירות הגבוהה מיון. אם אתם משתמשים במערכת הפרדה ידנית, וollow הוראות היצרן להעשרה. לחלופין, resuspend הדגימות במאגר FACS: PBS עם 1 המ&quot;מ EDTA (pH = 8) ו -1% BSA, מסונן סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החלק החיובי ולשטוף שוב עם 10 מ&quot;ל של PBS +. חלק CD4 + המועשר מוכן להיות מתויג למיון עכשיו. </li></ol> 4. תאי המיון הנאיביים CD4 + T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית התא גלולה עם PBS + נוגדני ניאון מכילים מכוונים נגד CD62L, CD44, CD25, וCD4. אם באמצעות הנוגדנים המופיעים בטבלה 1, דילולים עבור כל מסופקים. עבור מכתים, 100 μl נפח של הקוקטייל של הנוגדנים משמש לרקמות מעכבר אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה בקוקטייל של נוגדנים ודגירה של 15-30 דקות ב 4 o C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם 10 מ&quot;ל של PBS + ו צנטריפוגות 475 XG במשך 5 דקות ב 4 o C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התערובת מעל מכסה מסנן ניילון או מסננת תא אחר מחדשלהעביר כל שאריות פסולת. פיפטה התאים שכותרתו לתוך צינור שתואם לסדרן התא. שמור את התאים על קרח ומוגן מפני האור עד הסוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צינורות אוסף ידי pipetting 1-2ml של תקשורת RPMI מלאה או FBS לתוך החלק התחתון של צינורות תואמים לאוסף על סדרן תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין תאי CD4 + T הנאיביים כCD4 + CD25 - CD62L + CD44 - אוכלוסייה (איור 2). שוטף את התאים שנאספו עם תקשורת RPMI מלאה ו צנטריפוגות כמתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה בRPMI המלא, לספור את התאים הנאיביים, ולהתאים את הריכוז עד 1 x 10 6 תאים / מיליליטר. </li></ol> 5. הגדרת הבידול במבחנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הבארות של הצלחות המצופים אנטי CD3 ואנטי CD28 ולשטוף היטב עם כל 1ml של PBS סטרילי (לא FBS). לצלחות 48-היטב, צלחת 0.5 x 10 6 תאים / גם ב 0.5 מיליליטר של RPMI. לצלחות 24 גם, תרבות 1 x 10 6 תאים / גם ב1.0 מיליליטר של RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם בודק את ההשפעה של גורם כגון סמים להוסיף חומר לבארות המתאימות גם לפני, במהלך או אחרי תהליך ההתמיינות בהתאם לניסוי. בשלב הבא, להשלים את תרבות התקשורת עם ציטוקינים ונוגדני חסימה בהתאם. Th0: 30 U / ml Hil-2. Th1: 15 ng / ml rmIL-12, 30 U / ml Hil-2, ו5,000 ng / ml 11B11.Th2: 10 ng / ml rmIL-4, 30 U / ml Hil-2, 2,000 ng / ml המסיס 37.51, וng 5000 / XMG1.2 מיליליטר. iTreg: 15-2 Hil, 5,000 XMG1.2 מיליליטר / ng, ו5,000 ng / ml hTGFβ, 30 U / ml ng / ml 11B11. TH17: 20 / מיליליטר rmIL-6, 3 ng / ml hTGFβ, 5,000 XMG1.2 מיליליטר / ng, ו5,000 ng ng / ml 11B11. הערה: התנאים שהוצגו לעיל נמצאו אופטימלי למקסם את ייצור ציטוקינים כפי שנמדד בסוף ניסוי הבידול (סעיף נציגי תוצאות). עם זאת, כל מצב צריך להיות מותאם למעבדות (טבלה 2 בודדות </strong&gt;). יתר על כן, התוספת של אנטי CD28 המסיס בנוסף לאנטי-CD28-מחויב הצלחת כבר נמצאה לשפר את ייצור ציטוקינים Th2 במעבדה שלנו, אבל אין לו השפעה על תת תא T אחר: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת על C 37 o עם 5% CO 2 4-5 ד לפני הניתוח של ביטוי גנים וייצור ציטוקינים. לחלופין, להסיר את התאים מגירויי TCR לאחר 2 ד, מותאם ל1 x 10 6 תאים / מיליליטר עם תקשורת טרי, וצלחת בבארות חדשות (לא מצופה) כדי לשפר את ההתפשטות ותשואה סופית. במקרה זה, ציטוקינים קיטוב טריים ונוגדנים אינם נחוצים, אבל 10 U / ml של IL-2 יש להוסיף לאמצעי תקשורת החדש לTh0, Th1, Th2, ותרבויות iTreg. </li></ol> 6. ניתוח של בידול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח ציטוקינים על ידי cytometry זרימה, restimulate היטב עם כל 10ng / ml PMA ו1,000 ng / ml ionomycin או טבלה / מיליליטר אנטי-CD3 במשך 4-6 שעות בנוכחות מעכב Golgi כגון brefeldin (1 מיקרוגרם1). לבצע מכתים ציטוקינים תאיים תלוי בניסוי (איור 3). הערה: כתם שאינה שושלת ספציפית ציטוקינים או גורמי שעתוק, כגון IL-4 (לא מוצגים) וIFNγ (איור 3) לתרבויות TH17, לכל מצב כפקדים שליליים וכמדד ליעילות בידול. יתר על כן, Foxp3 כתם לתרבויות TH17 כפיתוח ההדדי של Tregs עלול להתרחש בתוספת TGFβ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכימות חלבון, לאסוף supernatants מכל assay היטב ועל ידי ציטוקינים ספציפיים ELISA (איור 3). אם קיים חשש שהגורם נבדק השפיע שגשוג בהשוואה לדגימות בקרה, ניתן לכבס את התאים, נספרו, מנורמל, ולאחר מכן restimulated עם 1 מיקרוגרם / מיליליטר של אנטי-CD3 במשך 24 שעות לפני איסוף supernatants למבחני ELISA. אם מנסה לאמוד IL-4 מTh2 תנאים, כביסה וrestimulating יש צורך להסיר IL-4 שעשויות להיות leftover מתרבות הבידול הראשונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח ביטוי גנים על ידי PCR בזמן אמת, תאי קציר לאחר תקופת הדגירה, לשטוף, לנרמל, ולעורר מחדש במשך 2-6 שעות עם 1 מיקרוגרם / מיליליטר של אנטי-CD3 לפני mRNA קציר (איור 3). </li></ol>

<ol>
	<li>Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+murine+helper+T+cell+clone.+I.+Definition+according+to+profiles+of+lymphokine+activities+and+secreted+proteins.">Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins.</a> J Immunol. 136 (7), 2348-2357 (1986).</li><li>Dong, C., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+decision:+T-helper+1+and+2+subsets+in+immune+responses.">Cell fate decision: T-helper 1 and 2 subsets in immune responses.</a> Arthritis Res. 2 (3), 179-188 (2000).</li><li>Hsieh, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+TH1+CD4++T+cells+through+IL-12+produced+by+Listeria-induced+macrophages.">Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeria-induced macrophages.</a> Science. 260 (5107), 547-549 (1993).</li><li>Seder, R. A., Gazzinelli, R., Sher, A., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+12+acts+directly+on+CD4++T+cells+to+enhance+priming+for+interferon+gamma+production+and+diminishes+interleukin+4+inhibition+of+such+priming.">Interleukin 12 acts directly on CD4+ T cells to enhance priming for interferon gamma production and diminishes interleukin 4 inhibition of such priming.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (21), 10188-10192 (1993).</li><li>Szabo, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+transcription+factor,+T-bet,+directs+Th1+lineage+commitment.">A novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment.</a> Cell. 100 (6), 655-669 (2000).</li><li>Afkarian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-bet+is+a+STAT1-induced+regulator+of+IL-12R+expression+in+naive+CD4.">T-bet is a STAT1-induced regulator of IL-12R expression in naive CD4.</a> T cells. Nat Immunol. 3 (6), 549-557 (2002).</li><li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+T-bet+is+induced+by+multiple+pathways+and+prevents+an+endogenous+Th2+cell+program+during+Th1+cell+responses.">The transcription factor T-bet is induced by multiple pathways and prevents an endogenous Th2 cell program during Th1 cell responses.</a> Immunity. 37 (4), 660-673 (2012).</li><li>Le Gros, G., Ben-Sasson, S. Z., Seder, R., Finkelman, F. D., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+interleukin+4+(IL-4)-producing+cells+in+vivo+and+in+vitro:+IL-2+and+IL-4+are+required+for+in+vitro+generation+of+IL-4-producing+cells.">Generation of interleukin 4 (IL-4)-producing cells in vivo and in vitro: IL-2 and IL-4 are required for in vitro generation of IL-4-producing cells.</a> J Exp Med. 172 (3), 921-929 (1990).</li><li>Swain, S. L., Weinberg, A. D., English, M., Huston, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-4+directs+the+development+of+Th2-like+helper+effectors.">IL-4 directs the development of Th2-like helper effectors.</a> J Immunol. 145 (11), 3796-3806 (1990).</li><li>Zhang, D. H., Cohn, L., Ray, P., Bottomly, K., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+GATA-3+is+differentially+expressed+in+murine+Th1+and+Th2+cells+and+controls+Th2-specific+expression+of+the+interleukin-5+gene.">Transcription factor GATA-3 is differentially expressed in murine Th1 and Th2 cells and controls Th2-specific expression of the interleukin-5 gene.</a> J Biol Chem. 272 (34), 21597-21603 (1997).</li><li>Zheng, W., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+GATA-3+is+necessary+and+sufficient+for+Th2+cytokine+gene+expression+in+CD4+T+cells.">The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells.</a> Cell. 89 (4), 587-596 (1997).</li><li>Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TH17+cells+in+development:+an+updated+view+of+their+molecular+identity+and+genetic+programming.">TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming.</a> Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).</li><li>Jiang, S., Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+issue+on+CD4(+)+T-cell+subsets.">A complex issue on CD4(+) T-cell subsets.</a> Immunol Rev. 252 (1), 5-11 (2013).</li><li>Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+and+Foxp3.">Regulatory T cells and Foxp3.</a> Immunol Rev. 241 (1), 260-268 (2011).</li><li>Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T., Ono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+and+immune+tolerance.">Regulatory T cells and immune tolerance.</a> Cell. 133 (5), 775-787 (2008).</li><li>Barzaghi, F., Passerini, L., Bacchetta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+dysregulation,+polyendocrinopathy,+enteropathy,+x-linked+syndrome:+a+paradigm+of+immunodeficiency+with+autoimmunity.">Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, x-linked syndrome: a paradigm of immunodeficiency with autoimmunity.</a> Front Immunol. 3, 211 (2012).</li><li>Shea, J. J., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+lineage+commitment+and+plasticity+of+helper+CD4+T+cells.">Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4 T cells.</a> Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).</li><li>Zhou, L., Chong, M. M., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+CD4++T+cell+lineage+differentiation.">Plasticity of CD4+ T cell lineage differentiation.</a> Immunity. 30 (5), 646-655 (2009).</li><li>Harrington, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+17-producing+CD4++effector+T+cells+develop+via+a+lineage+distinct+from+the+T+helper+type+1+and+2+lineages.">Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages.</a> Nat Immunol. 6 (11), 1123-1132 (2005).</li><li>Langrish, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-23+drives+a+pathogenic+T+cell+population+that+induces+autoimmune+inflammation.">IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation.</a> J Exp Med. 201 (2), 233-240 (2005).</li><li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+lineage+of+CD4+T+cells+regulates+tissue+inflammation+by+producing+interleukin+17.">A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17.</a> Nat Immunol. 6 (11), 1133-1141 (2005).</li><li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+nuclear+receptor+RORgammat+directs+the+differentiation+program+of+proinflammatory+IL-17++T+helper+cells.">The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells.</a> Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).</li><li>Chung, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+regulation+of+early+Th17+cell+differentiation+by+interleukin-1+signaling.">Critical regulation of early Th17 cell differentiation by interleukin-1 signaling.</a> Immunity. 30 (4), 576-587 (2009).</li><li>Reynolds, J. M., Martinez, G. J., Chung, Y., Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+4+signaling+in+T+cells+promotes+autoimmune+inflammation.">Toll-like receptor 4 signaling in T cells promotes autoimmune inflammation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13064-13069 (2012).</li><li>Reynolds, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+2+signaling+in+CD4(+)+T+lymphocytes+promotes+T+helper+17+responses+and+regulates+the+pathogenesis+of+autoimmune+disease.">Toll-like receptor 2 signaling in CD4(+) T lymphocytes promotes T helper 17 responses and regulates the pathogenesis of autoimmune disease.</a> Immunity. 32 (5), 692-702 (2010).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pathogenic+TH17+cells+by+inducible+salt-sensing+kinase+SGK1.">Induction of pathogenic TH17 cells by inducible salt-sensing kinase SGK1.</a> Nature. 496 (7446), 513-517 (2013).</li><li>Ghoreschi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+pathogenic+T(H)17+cells+in+the+absence+of+TGF-beta+signalling.">Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-beta signalling.</a> Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).</li><li>Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta+in+the+context+of+an+inflammatory+cytokine+milieu+supports+de+novo+differentiation+of+IL-17-producing+T+cells.">TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells.</a> Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).</li><li>Avni, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T(H)+cell+differentiation+is+accompanied+by+dynamic+changes+in+histone+acetylation+of+cytokine+genes.">T(H) cell differentiation is accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes.</a> Nat Immunol. 3 (7), 643-651 (2002).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification.">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. (9), (2007).</li><li>Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+th17+differentiation+of+naive+CD4+T+lymphocytes.">Isolation and th17 differentiation of naive CD4 T lymphocytes.</a> J Vis Exp. (79), e50765 (2013).</li></ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

בעוד הטחול מכיל תאי Th נאיביים, חלקם של אוכלוסייה זו בבלוטות לימפה הוא הרבה יותר גבוה. הכישלון לזהות כראוי ולהסיר בלוטות לימפה בפרוטוקול זה יגרום לתשואה ירודה של תאים נאיביים. זה יכול להיות קשה במיוחד בעכברים מבוגרים או עכברי זכרים שיש לי רקמת שומן יותר. כפי שניתן לראו...

הרעיון של שושלות או תת קבוצות של עוזר CD4 + T מובחנים תאים (ה &#39;) כבר בסביבות מאז שלהי המאה ה -20 1. הכרה של אנטיגן המקור בנוכחות תוצאות אותות costimulatory בכמה סבבים של התרבות תאים וההתמיינות הסופית למפעיל Th תאים. סוג Th תא שנוצר במהלך תהליך זה תלוי בסביבת ציטוקינים נוכחת במהלך ההפעלה 2. בתחילה, תאי Th נאיביים נחשבו ללקטב לתוך 2 שושלות שונות הבאים קולט תא T הפעלה (TCR), קשירת CD28 costimulatory, ואיתות ציטוקינים. תאים מסוג 1 עוזר (Th1) מתאפיינים בייצור שלהם מפעיל של ציטוקינים IFNγ כמו גם הדרישה שלהם לאיתות IL-12 במהלך 3,4 תהליך ההתמיינות. סופו של דבר התברר שיש לי תאי Th1 מובחנים פרופיל גנטי שמאופיין ב מובהק ביותרy הביטוי של גורם שעתוק משפחת תיבת T, Tbx21 (T-הימור), הנחשב לרגולטור הראשי של התכנית הגנטית Th1 5. יתר על כן, IL-12, כמו גם IFNγ יכול לקדם את ביטוי T-הימור 6,7. בתגובה החיסונית, תאי Th1 חשובים להגנה מפני פתוגנים המארח תאיים, כמו גם יזמים חזקים של דלקת אוטואימונית. בניגוד לכך, תאים מסוג 2 עוזר (Th2) דורשים IL-4 לפיתוחם וציטוקינים מפעיל שלהם, כולל IL-4, IL-5, ו- IL-13, הם חשובים לנהיגת תגובות תא B והם פתוגניים באלרגיה 8, 9. בדומה לתאי Th1, תאי Th2 נמצאו להביע רגולטור תעתיק הורים שלהם, כינה Gata-3 10,11. מעניין לציין, כי הנוכחות של ציטוקינים קיטוב והדור של שושלת Th ספציפית הם עוינות להתפתחותם של אחרים 2,12, המצביע על כך רק קבוצת משנה Th מסוימת עשויה להיות דומיננטית במהלך מחדש חיסוניsponse. מאז זיהוי של שושלות Th1 וTh2, עבודה נוספת הוכיחה עוד יותר ייחודי תת קבוצות של תאי T helper, כוללים עוזר זקיקים (TFH), IL-9-ייצור (Th9), וIL-22-ייצור (Th22) (לאחרונה בביקורת ב- 13). לצורך ניסויי בידול במבחנה, פרוטוקול זה יתמקד רק בשני תת Th נוסף, המכונה תאי T רגולטורים (Treg) וIL-ייצור-17 תאי CD4 + T (TH17). CD25 + תאי T רגולטורים יכולים להתרחש באופן טבעי (nTreg) בבלוטת התימוס; תאי Th נאיביים יכולים להיות גם מושרה (iTreg) להפוך לרגולציה בפריפריה (שנסקרה ב14,15). שני הסוגים של Tregs להביע גורם שעתוק אופייני, כינה P3 forkhead התיבה (Foxp3), שהוא קריטי למנגנוני דיכוי מפעיל שלהם הכוללים ייצור אנטי דלקתי מסיס מתווך, IL-2 הצריכה, ותא מנגנוני קשר תלוי 14,15. חוסר Foxp3 תוצאות ביטוי בהפרעה אוטואימונית חמורה, רב-איבר כינו dysregulation חיסוני, polyendocrinopathy, enteropathy, תסמונת X-צמוד (אייפקס), הממחישה את התפקיד הקריטי של קבוצת משנה Th זה בפתרון דלקת והסדרת סובלנות היקפית לעצמי אנטיגנים 16. במבחנה, תאי CD4 + T helper נאיביים להסדיר את-Foxp3 ולהיות מחויבים לתכנית Treg על גירוי עם IL-2 וTGF-β 14,15. ייתכן שיש מתון לפלסטיות רבה בשושלות תאי CD4 + T, במיוחד כאשר בוחנים ייצור ציטוקינים רק (שנסקר ב17,18). עם זאת, למטרות פרוטוקולי בידול במבחנה, נדונונו בכל תת-קבוצה כשושלת ייחודית. לאחרונה, קבוצת משנה של תאי TH17 שמייצר ציטוקינים IL-17 זוהתה כשושלת ייחודית עם פונקציות פרו-דלקתיות הבמיוחד פתוגניים בדלקת אוטואימונית 19-21. תאי TH17 להביע גורם שעתוק ייחודי, t גמא קולט היתום הקשורות retinoid מכונה (RORγt) המרכז את התכנית הגנטית TH17 22. TGFβ חשוב לדור של שושלת TH17 דרך האינדוקציה של RORγt. עם זאת, ההשפעה של איתות TGFβ הוא האמין כדי לגרום רק מחויבות TH17 על synergizing עם IL-6 (הנסקרת ב 12). מחקרים נוספים הראו כי מגוון רחב של אותות אחרים שיכולה באופן חיובי להסדיר את מחויבות TH17, כולל IL-1β, נתרן מוגבר, וTLR איתות 23-26. דיווחים אחרים לא הציעו כי תאי TH17 פתוגניים in vivo הם אלה שלמעשה לעקוף איתות TGFβ ובמקום להסתמך על שילוב של IL-1, IL-6, IL-23 והבידול שלהם 27. כך, תאי TH17 ניתן לגזור ממגוון רחב של מסלולי איתות; מסלול למטרות פרוטוקול זה, משמש בדרך כלל-(TGFβ וIL-6) למחויבות שושלת TH17יוצג. פרוטוקולי הבידול מתוארים להלן לכל שושלות מפעיל מסתמך על נוגדנים קבועים כגירויים לTCR וCD28 במהלך הקורס כולו של הניסוי. עם זאת, אחרים הראו כי הפעלת TCR עם תאי מציגי אנטיגן 28 או אנטי-CD3 ונוגדנים נגד CD28 עם נוגדן אוגר cross-linking במשך 2 ימים 29 גם אמצעי היעיל ביותר לגרימת הדור של תת Th השונים. הפרוטוקול המובא כאן מתבסס על שיטות שדווחו בעבר לבידוד תאי CD4 + T עכבריים מאיברי הלימפה משניים 30 ויצירת תאי TH17 31. אחד הבדלים עיקריים הוא שפרוטוקול זה מסתמך על השימוש בסדרן תא לבודד תאי CD4 + T נאיביים מרקמות הלימפה. עם זאת, חברות רבות מציעות כעת ערכות הפרדה מהירות שיכול להעשיר לתאי CD4 + T הנאיבי, שייתכן שתוכל לעקוף את דרישת fאו מיון בהתאם לניסוי. השיטות וחומרים הכימיים שהוצגו בפרוטוקול זה מה שאנחנו משתמשים באופן שיגרתי ולמצוא להיות היעיל ביותר. עם זאת, יש לזכור כי חומרים כימיים ושיטות אלטרנטיביים קיימות עבור רבים מהצעדים שיוצגו להלן וזה תלוי למעבדה בודדת כדי לקבוע מה יעבוד הכי טוב למטרות שלהם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Complete RPMI:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Warm in a 37 oC water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000X 2-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Pen/Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120 micron nylon mesh</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>CMN-0120-10YD</td>
			<td>Cut into 2 cm2 squares and autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alternative: 100 micron cell strainers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td>Alternative to cutting nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS running buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>Warm in a 37 oC water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS rinsing solution</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>Warm in a 37 oC water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 beads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-049-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokines:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human (h) IL-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse (rm) IL-4</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>214-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rmIL-6</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>406-ML-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rmIL-12</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>210-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hTGFb</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>240-B-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2C11 (anti-CD3)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37.51 (anti-CD28)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0015-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11B11 (anti-IL-4)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XMG1.2 (anti-IFNg)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD62L-FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>104406</td>
			<td>Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD25-PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102008</td>
			<td>Use at 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD4-PerCP</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100434</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD44-APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103012</td>
			<td>Use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol&#160; 12-myristate 13 acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8139</td>
			<td>Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I-0634</td>
			<td>Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4506-51</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse na&#239;ve cd4+ t cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

הנקודה לניתוח הבידול יכול להשתנות בהתאם למצב Th הזמן נבדק, כמו גם את הכוח של הפעלת קולטן תא T. לאחר 2-3 ימים של בידול, ניתן דמיינו תאים על ידי מיקרוסקופ אור כדי לקבוע את מידת התפשטות תאי T. ולס מציג התפשטות ויצירת גושים נרחבות של תאים יהיה ככל הנראה מוכן לניתוח ביום 4. תנאי ב...

Watch this Scientific Journal Video about Mouse NaÃ¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets at JoVE.com

Mouse Na&amp;#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

העכבר נאיבי CD4<sup&gt; +</supו&gt; בידוד תא T<em&gt; במבחנה</em&gt; בידול לתוך תת תא T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

mouse-nave-cd4-t-cell-isolation-vitro-differentiation-into-t-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

51.3K Views.  Rosalind Franklin University of Medicine and Science. Naïve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of naïve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals. 

Video: Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

בידוד של קבוצות משנה מבשר B-cell מדם טבורים

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

התמרה adenoviral של CD4 תמימים תאי T ללמוד בידול Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&amp;#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

בידוד ובידול של Th17 הנאיביים T מסוג CD4 לימפוציטים

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

במבחנה Assay כדי להעריך את ההשפעה של immunoregulatory מסלולים על פונקצית Effector הנייד HIV-ספציפית T מסוג CD4

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been considered as the only source of &#945;&#946;T cells. Yet, thymic involution begins early in life leading to a drastically reduced output of na&#239;ve &#945;&#946;T cells into the periphery. Nevertheless, even centenarians can build immunity against newly acquired pathogens. Recent research suggests extrathymic &#945;&#946;T cell development, however our understanding of pathways that may compensate for thymic loss of function are still rudimental. &#947;&#948; T cells are innate lymphocytes that constitute the main T-cell subset in the tissues. We recently ascribed a so far unappreciated outstanding function to a &#947;&#948; T cell subset by showing that the scarce entity of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells can transdifferentiate into &#945;&#946;T cells in inflammatory conditions. Here, we provide the protocol for the isolation of this progenitor from peripheral blood and its subsequent cultivation. V&#948;1 cells are positively enriched from PBMCs of healthy human donors using magnetic beads, followed by a second step wherein we target the scarce fraction of CD4+ cells with a further magnetic labeling technique. The magnetic force of the second labeling exceeds the one of the first magnetic label, and thus allows the efficient, quantitative and specific positive isolation of the population of interest. We then introduce the technique and culture condition required for cloning and efficiently expanding the cells and for identification of the generated clones by FACS analysis. Thus, we provide a detailed protocol for the purification, culture and ex vivo expansion of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells. This knowledge is prerequisite for studies that relate to this &#945;&#946;T cell progenitor`s biology and for those who aim to identify the molecular triggers that are involved in its transdifferentiation.

Isolation and Ex Vivo Culture of V&amp;#948;1+CD4+&amp;#947;&amp;#948; T Cells, an Extrathymic &amp;#945;&amp;#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

ובידוד<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבות של Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; תאי T γδ, Extrathymic αβT-תא אב

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

הדמית תא CD4 T גירת ביניים בדרמיס המוסת

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

במבחנה בידול של האדם CD4 + FOXP3 + מושרה תקינה בתאי T (iTregs) מ נאיבית CD4 + T תאים באמצעות פרוטוקול TGF-β-המכיל

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

An &lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Mouse Model to Measure Na&amp;#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

מודל העכבר In Vivo הפעלת תא T CD4 תמים מידה, התפשטות של בידול Th1 הנגרם על ידי תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, thymic derived Treg (tTreg) cells and peripherally induced Treg (pTreg) cells. They are present in different organs of our body and can be distinguished by specific markers, such as Helios and Neuropilin 1. It has been reported that tTreg cells are functionally more suppressive than pTreg cells. Therefore, it is important to determine the proportion of both tTreg and pTreg cells when investigating heterogeneous cell populations. Herein, we collected thymic glands, pancreatic draining lymph nodes and spleens from normoglycemic non-obese diabetic mice to distinguish tTreg cells from pTreg cells using flow cytometry. We manually prepared single cell suspensions from these organs. Fluorochrome conjugated surface CD4, CD8, CD25, and Neuropilin 1 antibodies were used to stain the cells. They were kept in the fridge overnight. On the next day, the cells were stained with fluorochrome conjugated intracellular Foxp3 and Helios antibodies. These markers were used to characterize the two subsets of Treg cells. This protocol demonstrates a simple but practical way to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen and use them for subsequent flow cytometric analysis.

Herein, we present a protocol to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen to further study these cells using flow cytometry. In addition, this protocol was used for determining the subsets of regulatory T cells using flow cytometry.

קביעת קבוצות משנה תא T רגולטורי ב מאתר התימוס, הלבלב ניקוז הלימפה והטחול באמצעות Cytometry זרימה

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...