עבודה זו נתמכה על ידי Associazione Italiana ללה Ricerca sul Cancro, משרד האיטלקי של אוניברסיטות ומחקר, פרויקטי Prin וProgetti di Ricerca di Ateneo, להעניק N ° CPDA137871, Fondazione Cariplo, להעניק N ° 2,011-0,485 לMDB, ועל ידי Finanziamento ג&#39;ובאני Studiosi, אוניברסיטה של ​​פדובה, לגאיה Codolo.

כל הנהלים לטיפול בבעלי חיים אושרו על ידי משרד בריאות האיטלקי (DM 204/2011-B). 1. בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול נקבות עכברי C57BL6 / י עד 8 שבועות של גיל בכלובים מאווררים בנפרד עם מסנני microisolation. הערה: נקבות הם העדיפו כי קונפורמציה האנטומי של מנגנון uro באיברי המין החיצוני שלהם הופכת את הצנתור קל יותר מאשר בגברים. </li></ol> תרבות 2. תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על קו urothelial עכבר תא קרצינומה MB49 במדיום RPMI 1,640 בתוספת 10% בסרום שור עוברי חום מומת ו -50 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאי MB49 בT-75 צלוחיות למפגש 80%. Trypsinize וגלול ברמה של 0.5 × 10 5-0.5 × 10 6 תאים לכל 150 μl של PBS לפני ההשתלה בעכברים. </li></ol> 3. השלפוחית ​​Tumour שתל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברים באמצעות שילוב של zoletil ההרדמה וxylor (33 מ&quot;ג / קילוגרם ו -20 מ&quot;ג / קילוגרם, בהתאמה), הזריק intraperitoneally. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח בעלי חיים במצב שכיבה ולתקן את הרגליים האחוריות למשטח עם נייר דבק. כפות יש להפריד מספיק כדי להבהיר meatus השופכה גם הגלוי ונגיש להחדרת הצנתר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: הצנתור, צנתר ורידי ילדים 24 G מתאים לעכברים 8 עד 10 שבועות-ישנים. הבחירה של צנתר היא מאוד חשובה כדי למנוע דליפה של נוזל בין קיר השופכה וקטטר. צנתרים שעם גדולים יותר יש להשתמש לעכברים גדולים יותר או מבוגרים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות זאטוט קטן, לצבוט קצה אחד של חלק החיצוני של שופכה ולסובב אותו בעדינות רבה לכיוון &quot;סוף הראש&quot; של העכברים. פעולה זו חושפת את meatus השופכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המחט הפנימית של הצנתר והכנס את האחרון בשופכה בזווית של 45 מעלות, מעט אוריינטציהלקראת &quot;הזנב&quot; של העכברים. אל תכריח את הכניסה של צנתר; במקרה של התנגדות, פשוט לסובב את הקטטר מאוד בעדינות, עד שהוא מחליק בתוך השופכה. כאשר על 0.5-0.8 סנטימטר של הצנתר הוא בשופכה, בזהירות במקום מקביל קטטר לזנב של העכברים והכניסו אותו לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק 1 מיליליטר, המחט שיש להיות מוכנסים בקטטר, לשטוף את שלפוחית ​​שתן משייר על ידי הזרקת 200-300 μl של PBS סטרילי ולשאוב את כל הנוזל משלפוחית ​​השתן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: כאשר הזרקת PBS, השלפוחית ​​תתמלא ונפיחות תהיה גלויה בין הרגליים האחוריות של העכברים; זה מאשר כי הצנתור הוא נכון. רוב הצנתרים נפח מת שיש לקחת בחשבון בעת ​​חישוב נפח ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק 1 מיליליטר סטרילי, להזריק 200 μl של 0.1 N HCl. מלא את השלפוחית ​​כדי לשרוף כל הקיר שלה. לאחר 10 שניות, להסיר את כל החומצה ומייד neutralize ידי הזרקת 200 μl של 0.1 N NaOH עם מזרק סטרילי. במקרה של הזרקה של המספר הגבוה ביותר של תאים (0.5 × 10 6), לא נדרש צעד החמצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הנוזל שיורית לשאוב ומייד לשטוף את החלל עם 300 μl של PBS סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוקן את שלפוחית ​​השתן על ידי שאיפה, ולהזריק 150 μl של PBS המכיל תאי MB49 (טווח 0.5 × 10 5-0.5 × 10 6) לשלפוחית ​​השתן. השאר את המזרק התאסף לקטטר כדי למנוע הדליפה של תאים. עדיף להבטיח את המזרק על ידי תיקון אותו למשטח עם נייר דבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1, בעדינות לחלץ את הקטטר מהשופכה, ולמקם את העכברים בכלוב, תחת מנורת ליבון עד שהם מתעוררים: זה קורה בדרך כלל בין 1 ל 2 שעות לאחר תום הטיפול. </li></ol> 4. משלוח שלפוחית ​​של HP-NAP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: לפחות 3 ימים לאחר החדרת תא, אפשר להתחילטיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קטטר כמתואר בצעדים 3.1-3.4. בשלב זה, אין צורך לשרוף את קיר שלפוחית ​​השתן עם HCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק 1 מיליליטר, לשטוף את שלפוחית ​​שתן משייר על ידי הזרקת 200-300 μl של PBS סטרילי ולשאוב את כל הנוזל משלפוחית ​​השתן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 50 מיקרוגרם של HP-NAP לμl 150 PBS לתוך שלפוחית ​​השתן. השאר את המזרק המצורף לקטטר כדי למנוע דליפה של פתרון החלבון. אבטח את המזרק על ידי תיקון אותו למשטח עם נייר דבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1, בעדינות לחלץ את הקטטר מהשופכה ולמקם את העכברים בכלוב, תחת מנורת ליבון, עד שהם מתעוררים. </li></ol> 5. Tumour Explants וניתוח היסטולוגית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של הטיפול, להקריב בעלי החיים, למקם אותם בעמדות שכיבה ולתקן את הרגליים האחוריות למשטח עם נייר דבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל כירורגי, לעשות חתך אנכי ארוך על 1.52 סנטימטר דרך העור והצפק, מתחיל בדיוק מעל איברי מין חיצוניים ל&quot; סוף הראש &quot;של העכברים. כדי למזער את הסיכון של פגיעה בשלפוחית ​​השתן, להקדיש תשומת לב מיוחדת לעומק של החתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלפוחית ​​השתן ימוקם במרכז-השמאל של הקיצוץ והגידול יהיה גלוי כגוש ורוד / סגול כהה. על כריתתו, למקם את כל שלפוחית ​​השתן בכלוב היסטולוגית ולתקן ב 10% פורמלין שנאגרו לפני ההטבעה בפרפין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להיסטולוגית וניתוח histochemical חיסוני, להכין חלקים סידוריים של שלפוחית ​​השתן (46 עובי מיקרומטר) באמצעות microtome סטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכתים את החלקים עם haematoxylin / eosin ולהמשיך בחישוב של גודל גידול (D XD 2) וקביעת אחוז הנמק לשטח חתך באמצעות נתח תמונה בעזרת מחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספירת כלי, להמשיך על ידי צביעת החלקים לCD31 סמן אנדותל / PECAM, תוך שימוש בטכניקת פרוקסידאז סטנדרטית. סרוק את הסעיפיםt חשמל נמוך (4 ×) כדי לזהות את האזור של צפיפות כלי דם הגבוהה ביותר. בתוך אזור זה, לספור microvessels בודדת בחמישה תחומים נפרדים אקראיים בהספק גבוה (20 ×). </li></ol>

<ol>
	<li>Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Cancerstatistics Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CA Cancer J Clin. 64, 9-29 (2014).</li><li>Saint, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+a+T+helper+1+urinary+cytokine+response+after+intravesical+bacillus+Calmette-Guerin+treatment+for+superficial+bladder+cancer.">Prognostic value of a T helper 1 urinary cytokine response after intravesical bacillus Calmette-Guerin treatment for superficial bladder cancer.</a> J Urol. 167, 364-367 (2002).</li><li>Shahin, O., Thalmann, G. N., Rentsch, C., Mazzucchelli, L., Studer, U. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retrospective+analysis+of+153+patients+treated+with+or+without+intravesical+bacillus+Calmette-Guerin+for+primary+stage+T1+grade+3+bladder+cancer:+recurrence,+progression+and+survival.">A retrospective analysis of 153 patients treated with or without intravesical bacillus Calmette-Guerin for primary stage T1 grade 3 bladder cancer: recurrence, progression and survival.</a> J Urol. 169, 96-100 (2003).</li><li>Lamm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complications+of+bacillus+Calmette-Guerin+immunotherapy.">Complications of bacillus Calmette-Guerin immunotherapy.</a> Urol Clin North Am. 19, 565-572 (1992).</li><li>De Jager, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+complete+remission+in+bladder+carcinoma+in+situ+with+intravesical+TICE+bacillus+Calmette+Guerin.+Overview+analysis+of+six+phase+II+clinical+trials.">Long-term complete remission in bladder carcinoma in situ with intravesical TICE bacillus Calmette Guerin. Overview analysis of six phase II clinical trials.</a> Urology. 38, 507-513 (1991).</li><li>Dovedi, S. J., Davies, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+targeted+therapies+for+bladder+cancer:+a+disease+waiting+for+a+drug.">Emerging targeted therapies for bladder cancer: a disease waiting for a drug.</a> Cancer Metastasis Rev. 28, 355-367 (2009).</li><li>Evans, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein.">Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein.</a> Infect Immun. 63, 2213-2220 (1995).</li><li>Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+Dps,+a+ferritin+homolog+that+binds+and+protects+DNA.">The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA.</a> Nat Struct Biol. 5, 294-303 (1998).</li><li>Amedei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neutrophil-activating+protein+of+Helicobacter+pylori+promotes+Th1+immune+responses.">The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori promotes Th1 immune responses.</a> J Clin Invest. 116, 1092-1101 (2006).</li><li>Bernard, M., D'Elios, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+modulating+activity+of+the+Helicobacter+pylori+HP-NAP:+Friend+or+foe.">The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe.</a> Toxicon. 56, 1186-1192 (2010).</li><li>Codolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neutrophil-activating+protein+of+Helicobacter+pylori+down-modulates+Th2+inflammation+in+ovalbumin-induced+allergic+asthma.">The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori down-modulates Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma.</a> Cell Microbiol. 10, 2355-2363 (2008).</li><li>Gunther, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+syngeneic+orthotopic+murine+bladder+cancer+(MB49).">Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49).</a> Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).</li><li>Codolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP-NAP+inhibits+the+growth+of+bladder+cancer+in+mice+by+activating+a+cytotoxic+Th1+response.">HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response.</a> Cancer Immunol Immunother. 61, 31-40 (2012).</li><li>Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+orthotopic+models+for+bladder+cancer+research.">Mouse orthotopic models for bladder cancer research.</a> BJU Int. 104, 1286-1291 (2009).</li><li>Kubota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+models+of+human+cancer+xenografted+in+the+nude+mouse:+the+importance+of+orthotopic+transplantation.">Metastatic models of human cancer xenografted in the nude mouse: the importance of orthotopic transplantation.</a> J Cell Biochem. 56, 4-8 (1994).</li><li>Loi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+the+orthotopic+model+to+validate+antivascular+therapies+for+cancer.">The use of the orthotopic model to validate antivascular therapies for cancer.</a> Int J Dev Biol. 55, 547-555 (2011).</li><li>Miyazaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preconditioning+methods+influence+tumor+property+in+an+orthotopic+bladder+urothelial+carcinoma+rat+model.">Preconditioning methods influence tumor property in an orthotopic bladder urothelial carcinoma rat model.</a> Mol Clin Oncol. 2, 65-70 (2014).</li><li>Horiguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+orthotopic+mouse+superficial+bladder+tumor+model+for+studies+on+intravesical+treatments.">Establishment of orthotopic mouse superficial bladder tumor model for studies on intravesical treatments.</a> Hum Cell. 21, 57-63 (2008).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

רוב ההתקדמות בטיפול בסרטן דורשים בדיקות במודלים של בעלי חיים לפני שמתחיל ניסויים קליניים. האפשרות ללמוד ביולוגיה גידול in vivo, מנצל מודלים של בעלי חיים, מהווה כלי חיוני לחוקרים חוקרים פתוגנזה של הסרטן, המאפשרים ההערכה של גישות טיפוליות שונות. דגמי orthotopic יישארו סט?...

סרטן שלפוחית ​​השתן הוא אחד מסוגי הסרטן הנפוצים ביותר במערכת ואברי המין, עם כמעט 75,000 מקרים חדשים בכל שנה בארה&quot;ב 1. שיעור גבוה של הישנות דורש מעקב לכל החיים, מה שהופך את סרטן שלפוחית ​​השתן אחד מסוגי הסרטן היקרים ביותר לטיפול. הטיפול הסטנדרטי הזהב לדרגה הגבוהה NMIBC הוא כריתת טרנס-שופכה, ואחריו טיפול חיסוני שלפוחית ​​עם BCG. למרות שהמנגנון המדויק של הפעילות אנטי-הסרטני של BCG נותר הובהר במלואו, הוא קיבל את זה ההפעלה של תגובה חיסונית של תאים מועשרים בעוזר T (Th) 1 ורעיל לתאי T (TC) 1 תאים חיונית ל ההצלחה של הטיפול 2. למרות העובדה כי BCG נשאר טיפול הבחירה בNMIBC, שיעור גבוה של חולים אינם מגיב לטיפול; יתר על כן, זה יכול לגרום למספר תופעות לוואי: כ -70% מגידולים שטופלו יחזרו אחרי כמה זמן ו~ התקדמות 15% לטופס השריר פולשנית שלמחלה. תופעות לוואי אחרים הקשורים לטיפול BCG כוללים dysuria, דלקת שלפוחית ​​השתן ודלקת כליות 3-6. פיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות חייב לקחת בחשבון את השימוש במודלים פרה-קליניים, הבא במבחנה הערכה ראשונית; זה רלוונטי במיוחד בגידולי מייקרו-סביבה שיכול להשפיע באופן משמעותי לפיתוח והיענותם לטיפול. בעשור האחרון, יש לנו לטפל בהיבטים שונים של פעילות הוויסות החיסונית של HP-NAP, חלבון היוצר על ידי החיידק הליקובקטר פילורי, בתחילה זוהה כמסוגל לקדם הידבקות האנדותל של תאי polymorphonuclear (PMNs) 7. מבחינה מבנית, HP-NAP שייך לחלבון הגנה-DNA בתנאים מורעבים משפחה (DPS) 8 וכולל 12 יחידות משנה זהות מסודרות בקליפת dodecameric. אנחנו הוכחנו כי HP-NAP הואקולט-כמו אגרה (TLR) 2 אגוניסט, עם פעילות ויסות-חיסונית חזקה אחראית לנהיגת הבידול של T לימפוציטים כלפי פנוטיפ Th1, הן במבחנה in vivo 9-10. בכוחה של פעילות זו, HP-NAP יכול להפנות את התגובה החיסונית Th2 לתגובת Th1 מועיל יותר במודל עכברי של אסתמה אלרגית 11. כדי להעריך את הפוטנציאל אנטי-הסרטני Th1 תלוי של HP-NAP, נצלנו מודל עכבר של סרטן שלפוחית ​​השתן שפותח לפני מספר שנים על ידי O&#39;Donnel ועמיתים 12 להערכת ההשפעה של ממשל BCG. עם פרוטוקול זה, אנו מראים כי HP-NAP יש פוטנציאל אנטי-סרטני חזק נגד סרטן שלפוחית ​​השתן ושהיעילות של ממשל HP-NAP מקביל להצטברות המשמעותית, בתוך בלוטות הלימפה אזורית וגידול, של שני לימפוציטים מסוג Th1 וTc1 ייצור אינטרפרון ( IFN) -γ 13 </sup&gt;. גידולים מבודדים מעכברים שטופלו-HP-NAP הראו יותר נמק ופחות כלי דם מאשר עמיתו שלא טופל. הדו&quot;ח הנוכחי מספק פרוטוקול stepbystep, המפרט את ההכנה של בעלי החיים, צנתור שופכתם, השריפה הכימית הנדרשת לחיבור של תאי רירית שלפוחית ​​השתן, וההזרקה של התאים הסרטניים. אנו גם מתארים את הממשל המקומי של HP-NAP שיכול להיחשב כאב טיפוס של כל סוכנים טיפוליים שפותחו לטיפול בסרטן שלפוחית ​​השתן. הראיות שהושגו על ידי השוואת גידולים מבודדים משליטה וHP-טופל NAP בעלי החיים מדגישה לא רק את העובדה שHP-NAP יכול להיות מועמד טוב לטיפול חיסוני בסרטן שלפוחית ​​השתן, אלא גם את היעילות הכללית של הניסוי להגדיר.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>C57BL/6J female mice</td><td>Harlan Italy (Udine, Italy)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MB49 Cells</td><td></td><td></td><td>Obtained from Prof. O&#039;Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td>10X, to be diluted in apyrogenic water</td></tr><tr><td>Flask</td><td>Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA)</td><td>353135</td><td></td></tr><tr><td>Syringe 1ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>301358</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Life Technologies</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>Xilor</td><td>Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy)</td><td></td><td>2% Xylazin</td></tr><tr><td>Zoletil</td><td>Virbac (Carros, France)</td><td>359713301992</td><td>5% Zolazepam + 5% Tiletamine</td></tr><tr><td>24G Catheter</td><td>Terumo (Rome, Italy)</td><td>SR+DM2419PX</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Carlo Erba Reagents (Milano, Italy)</td><td>403871</td><td>Liquid</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA)</td><td>10095011</td><td>Powder</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Surgical Scalpel</td><td>Albion Surgical Limited (Sheffield, England)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany)</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA)</td><td>631-0108</td><td></td></tr><tr><td>Image Analyzer</td><td>Zeiss (Jena, Germany)</td><td>Cyres System</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of the efficacy of the h. pylori protein hp-nap as a therapeutic tool for treatment of bladder cancer in an orthotopic murine model

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is the gold standard treatment for the high-grade non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). However, since the treatment-related side effects are relevant, newer biological response modifiers with a better benefit/side effects ratio are needed.
The tumour microenvironment can influence both tumour development and therapy efficacy. In order to obtain a good model, it is desirable to implant tumour cells in the organ from which the cancer originates.
In this protocol, we describe a method for establishing a tumour in the bladder cavity of female mice and subsequent delivery of therapeutic agents; the latter are exemplified by our use of Helicobacter pylori neutrophil activating protein (HP-NAP). A preliminary chemical burn of the mucosa, followed by the injection of mouse urothelial carcinoma cell line MB49 via urethral catheterization, enables the cells to attach to the bladder mucosa. After a period, required to allow an initial proliferation of the cells, mice are treated with HP-NAP, administrated again via catheterization. The anti-tumour activity of HP-NAP is evaluated comparing the tumour volume, the extent of necrosis and the degree of vascularization between vehicle- and HP-NAP-treated animals.

איור 1 מציג את טכניקת הצנתור; עכבר צינתור והחדיר עם 0.5 × 10 6 תאים MB49. טיפול עם HP-NAP הוא התחיל 3 ימים לאחר ההזרקה של תאים סרטניים, כדי לאפשר להם לצרף אל קיר שלפוחית ​​השתן ולהתרבות. כל בעלי החיים המשתייכים לקבוצת השליטה לפתח הגידול; חלק מהם עלול למות לפני תום...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model at JoVE.com

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Here the method to establish a syngeneic mouse model of orthotopic bladder tumour to evaluate the anti-tumour efficacy of the bacterial protein HP-NAP is described.

הערכת היעילות של<em&gt; H. פילורי</em&gt; חלבון HP-NAP ככלי טיפולי לטיפול בסרטן שלפוחית ​​השתן בדגם Murine Orthotopic

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is the gold ...

evaluation-efficacy-h-pylori-protein-hp-nap-as-therapeutic-tool-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

7.2K Views.  University of Padua. Here the method to establish a syngeneic mouse model of orthotopic bladder tumour to evaluate the anti-tumour efficacy of the bacterial protein HP-NAP is described.

Video: Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified to secrete human Prostate Specific Antigen (PSA), and the procedure for the confirmation of tumor implantation. In brief, mice are anesthetized using injectable drugs and are made to lay in the dorsal position. Urine is vacated from the bladder and 50 &#181;L of poly-L-lysine (PLL) is slowly instilled at a rate of 10 &#181;L/20 s using a 24 G IV catheter. It is left in the bladder for 20 min by stoppering the catheter. The catheter is removed and PLL is vacated by gentle pressure on the bladder. This is followed by instillation of the murine bladder cancer cell line (1 x 105 cells/50 &#181;L) at a rate of 10 &#181;L/20 s. The catheter is stoppered to prevent premature evacuation. After 1 h, the mice are revived with a reversal drug, and the bladder is vacated. The slow instillation rate is important, as it reduces vesico-ureteral reflux, which can cause tumors to occur in the upper urinary tract and in the kidneys. The cell line should be well re-suspended to reduce clumping of cells, as this can lead to uneven tumor sizes after implantation.
This technique induces tumors with high efficiency. Tumor growth is monitored by urinary PSA secretion. PSA marker monitoring is more reliable than ultrasound or fluorescence imaging for the detection of the presence of tumors in the bladder. Tumors in mice generally reach a maximum size that negatively impacts health by about 3 - 4 weeks if left untreated. By monitoring tumor growth, it is possible to differentiate mice that were cured from those that were not successfully implanted with tumors. With only end-point analysis, the latter may be mistakenly assumed to have been cured by therapy.

This protocol describes the generation of murine orthotopic bladder tumors in female C57BL/6J mice and the monitoring of tumor growth.

מודל גידול Murine Orthotopic שלפוחית ​​השתן סרטן מערכת איתור

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Cancer Research

Mouse Bladder Wall Injection

Mouse bladder wall injection is a useful technique to orthotopically study bladder phenomena, including stem cell, smooth muscle, and cancer biology. Before starting injections, the surgical area must be cleaned with soap and water and antiseptic solution. Surgical equipment must be sterilized before use and between each animal. Each mouse is placed under inhaled isoflurane anesthesia (2-5% for induction, 1-3% for maintenance) and its bladder exposed by making a midline abdominal incision with scissors. If the bladder is full, it is partially decompressed by gentle squeezing between two fingers. The cell suspension of interest is intramurally injected into the wall of the bladder dome using a 29 or 30 gauge needle and 1 cc or smaller syringe. The wound is then closed using wound clips and the mouse allowed to recover on a warming pad. Bladder wall injection is a delicate microsurgical technique that can be mastered with practice.

Mouse bladder wall injection is a useful approach to orthotopically study bladder stem cell and cancer biology. This delicate microsurgical method can be mastered with careful technique and practice.

שלפוחית ​​השתן עכבר וול Injection

Mouse bladder wall injection is a useful technique to orthotopically study bladder phenomena, including stem cell, smooth muscle, and cancer biology. ...

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

דגם orthotopic של סרטן שלפוחית ​​השתן Murine

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder tumor model. The mouse model is established by urethral catheterization under inhaled general anesthetic. Chemical burn is then introduced to the bladder mucosa using intravesical silver nitrate solution to disrupt the bladder glycosaminoglycan layer and allows cells to attach. Following several washes with sterile water, human bladder cancer KU-7-luc2-GFP cells are instilled through the catheter into the bladder to dwell for 2 hours. Subsequent growth of bladder tumors is confirmed and monitored by in vivo bladder ultrasound and bioluminescent imaging. The tumors are then treated intravesically with saRNA formulated in lipid nanoparticles (LNPs). Tumor growth is monitored with ultrasound and bioluminescence. All steps of this procedure are demonstrated in the accompanying video.

Establishing an orthotopic bladder tumor model to evaluate antitumor effects of intravesically delivered saRNA and monitoring tumor growth by ultrasound and bioluminescent imaging.

שלפוחית ​​השתן Orthotopic גידול דגם ואת הערכת טיפול סרנה השלפוחית

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are needed. The tumor microenvironment can significantly influence tumor development and therapy response. It is therefore often desirable to grow tumor cells in the organ from which they originated. This protocol describes an orthotopic model of bladder cancer, in which MB49 murine bladder carcinoma cells are instilled into the bladder via catheterization. Successful tumor cell implantation in this model requires disruption of the protective glycosaminoglycan layer, which can be accomplished by physical or chemical means. In our protocol the bladder is treated with trypsin prior to cell instillation. Catheterization of the bladder can also be used to deliver therapeutics once the tumors are established. This protocol describes the delivery of an adenoviral construct that expresses a luciferase reporter gene. While our protocol has been optimized for short-term studies and focuses on gene delivery, the methodology of mouse bladder catheterization has broad applications.

Implantation of cancer cells into the organ of origin can serve as a useful preclinical model to evaluate novel therapies. MB49 bladder carcinoma cells can be grown within the bladder following intravesical instillation. This protocol demonstrates catheterization of the mouse bladder for the purpose of tumor implantation and adenoviral delivery.

סרטן שלפוחית ​​השתן לדגם orthotopic ג&#39;ין משלוח לימודים

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy and/or cytotoxic chemotherapy. To induce bladder cancer, C57BL/6 mice (MUC1.Tg and wild type) were treated orally with the carcinogen N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine (OH-BBN) at 3.0 mg/day, 5 days/week for 12 weeks. To assess the effects of OH-BBN on serum cytokine profile during tumor development, whole blood was collected via submandibular bleeds prior to treatment and every four weeks. In addition, a MUC1-targeted peptide vaccine and placebo were administered to groups of mice weekly for eight weeks. Multiplex fluorometric microbead immunoanalyses of serum cytokines during tumor development and following vaccination were performed. At termination, interferon gamma (IFN-&#947;)/interleukin-4 (IL-4) ELISpot analysis for MUC1 specific T-cell immune response and histopathological evaluations of tumor type and grade were performed. The results showed that: (1) the incidence of bladder cancer in both MUC1.Tg and wild type mice was 67%; (2) transitional cell carcinomas (TCC) developed at a 2:1 ratio compared to squamous cell carcinomas (SCC); (3) inflammatory cytokines increased with time during tumor development; and (4) administration of the peptide vaccine induces a Th1-polarized serum cytokine profile and a MUC1 specific T-cell response. All tumors in MUC1.Tg mice were positive for MUC1 expression, and half of all tumors in MUC1.Tg and wild type mice were invasive. In conclusion, using a team approach through the coordination of the efforts of pharmacologists, immunologists, pathologists and molecular biologists, we have developed an immune intact transgenic mouse model of bladder cancer that expresses hMUC1.

An N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced bladder cancer model was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic mice for the purpose of testing MUC1-directed immunotherapy. After administering a MUC1-targeted peptide vaccine, a cytotoxic T lymphocyte response to MUC1 was confirmed by measuring serum cytokine levels and T-cell specific activity.

אינדוקציה של קרצינומה של תאי מעבר שלפוחית ​​השתן פולשנית בMUC1 עכברים הטרנסגניים חיסוניים אנושיים שלמים: מודל לפיתוח חיסוני

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy ...

Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts

Orthotopic bladder cancer xenografts are the gold standard to study molecular cellular manipulations and new therapeutic agents&#160;in vivo. Suitable cell lines are inoculated either by intravesical instillation (model of nonmuscle invasive growth) or intramural injection into the bladder wall (model of invasive growth). Both procedures are complex and highly time-consuming. Additionally, the superficial model has its shortcomings due to the lack of cell lines that are tumorigenic following instillation. Intramural injection, on the other hand, is marred by the invasiveness of the procedure and the associated morbidity for the host mouse.
With these shortcomings in mind, we modified previous methods to develop a minimally invasive approach for creating orthotopic bladder cancer xenografts. Using ultrasound guidance we have successfully performed percutaneous inoculation of the bladder cancer cell lines UM-UC1, UM-UC3 and UM-UC13 into 50 athymic nude. We have been able to demonstrate that this approach is time efficient, precise and safe. With this technique, initially a space is created under the bladder mucosa with PBS, and tumor cells are then injected into this space in a second step. Tumor growth is monitored at regular intervals with bioluminescence imaging and ultrasound. The average tumor volumes increased steadily in in all but one of our 50 mice over the study period.
In our institution, this novel approach, which allows bladder cancer xenograft inoculation in a minimally-invasive, rapid and highly precise way, has replaced the traditional model.

The established technique to inoculate primary invasive orthotopic bladder cancer xenografts requires laparotomy and mobilization of the bladder. This procedure inflicts significant morbidity on the mice, is technically challenging and time-consuming. We therefore developed a high-precision, percutaneous approach utilizing ultrasound guidance.

פולשנית הקמת Murine Orthotopic שלפוחית ​​השתן xenografts

Orthotopic bladder cancer xenografts are the gold standard to study molecular cellular manipulations and new therapeutic agents&#160;in vivo. Suitable ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. pylori-induced gastric inflammation by activating several innate leukocytes including neutrophils, monocytes, and mast cells. The immunogenic and immunomodulatory properties of HP-NAP make it a potential diagnostic and vaccine candidate for H. pylori and a new drug candidate for cancer therapy. In order to obtain substantial quantities of purified HP-NAP used for its clinical applications, an efficient method to purify this protein with high yield and purity needs to be established.
In this protocol, we have described a method for one-step negative chromatographic purification of recombinant HP-NAP overexpressed in Escherichia coli (E. coli) by using diethylaminoethyl (DEAE) ion-exchange resins (e.g., Sephadex) in batch mode. Recombinant HP-NAP constitutes nearly 70% of the total protein in E. coli and is almost fully recovered in the soluble fraction upon cell lysis at pH 9.0. Under the optimal condition at pH 8.0, the majority of HP-NAP is recovered in the unbound fraction while the endogenous proteins from E. coli are efficiently removed by the resin.
This purification method using negative mode batch chromatography with DEAE ion-exchange resins yields functional HP-NAP from E. coli in its native form with high yield and purity. The purified HP-NAP could be further utilized for the prevention, treatment, and prognosis of H. pylori-associated diseases as well as cancer therapy.

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

A high yield method for one-step negative purification of recombinant Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) overexpressed in Escherichia coli by using diethylaminoethyl resins in batch mode is described. HP-NAP purified by this method is beneficial for the development of vaccines, drugs, or diagnostics for H. pylori-associated diseases.

צעד אחד טיהור זיהוי תכונות חומרים שלילית של<em&gt; הליקובקטר פילורי</em&gt; חלבון נויטרופילים-הפעלת ביתר<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; במצב אצווה

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Immunology and Infection

Establishing a Murine Superficial Bladder Cancer Model via an Intravesical Cell Administration Technique

This study presents an innovative method for establishing an orthotopic murine bladder tumor model with high efficiency and precise tumor localization. After anesthetizing female C57BL/6J mice in a supine position, a 24 G intravenous needle is inserted into the bladder to evacuate its contents. A 34 G dispensing needle is then introduced through the catheter, rotated five times to create a focal injury to the bladder dome mucosa, and subsequently removed. The MB49 cell suspension is aspirated and connected to a 30 G dispensing needle, which is inserted into the bladder via the catheter. Tumor cells are injected submucosally into the bladder under pressure. This technique results in minimal trauma to the mice, a high tumor take rate, and a fixed tumor location. It is characterized by simplicity and excellent reproducibility. This model provides an ideal experimental platform for developing intravesical therapies for bladder cancer, facilitating the advancement and optimization of treatment strategies for this malignancy.

This protocol describes a unique method for constructing an orthotopic model of superficial bladder cancer.

ביסוס מודל שטחי של סרטן שלפוחית השתן בעכברים באמצעות טכניקת ניהול תאים תוך-שלפוחית

This study presents an innovative method for establishing an orthotopic murine bladder tumor model with high efficiency and precise tumor localization. ...

Evaluating the Anti-Tumor Efficacy of a Bacterial Immunomodulatory Protein in a Murine Model

Source: Codolo, G. et al. <a href="https://app.jove.com/v/52743">Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates a technique to assess the anti-tumor activity of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein, or HP-NAP, in a mouse bladder cancer model. HP-NAP interacts with tumor-cell neutrophils to produce pro-inflammatory cytokines, inducing the differentiation of na&#239;ve T cells into type 1 T helper (Th1) and type 1 cytotoxic (Tc1) T cell phenotypes. The Th1 and Tc1 cells secrete interferon-gamma, inhibiting tumor angiogenesis and promoting cytotoxic T cell-mediated tumor destruction, reducing tumor volume.

הערכת היעילות האנטי-סרטנית של חלבון אימונומודולטורי חיידקי במודל מורין

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

הערכת היעילות של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מודל גידול Murine Orthotopic שלפוחית השתן סרטן מערכת איתור

שלפוחית השתן עכבר וול Injection

דגם orthotopic של סרטן שלפוחית השתן Murine

שלפוחית השתן Orthotopic גידול דגם ואת הערכת טיפול סרנה השלפוחית

סרטן שלפוחית השתן לדגם orthotopic ג'ין משלוח לימודים

אינדוקציה של קרצינומה של תאי מעבר שלפוחית השתן פולשנית בMUC1 עכברים הטרנסגניים חיסוניים אנושיים שלמים: מודל לפיתוח חיסוני

פולשנית הקמת Murine Orthotopic שלפוחית השתן xenografts

צעד אחד טיהור זיהוי תכונות חומרים שלילית של

ביסוס מודל שטחי של סרטן שלפוחית השתן בעכברים באמצעות טכניקת ניהול תאים תוך-שלפוחית

הערכת היעילות האנטי-סרטנית של חלבון אימונומודולטורי חיידקי במודל מורין

הערכת היעילות של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מודל גידול Murine Orthotopic שלפוחית ​​השתן סרטן מערכת איתור

שלפוחית ​​השתן עכבר וול Injection

דגם orthotopic של סרטן שלפוחית ​​השתן Murine

שלפוחית ​​השתן Orthotopic גידול דגם ואת הערכת טיפול סרנה השלפוחית

סרטן שלפוחית ​​השתן לדגם orthotopic ג'ין משלוח לימודים

אינדוקציה של קרצינומה של תאי מעבר שלפוחית ​​השתן פולשנית בMUC1 עכברים הטרנסגניים חיסוניים אנושיים שלמים: מודל לפיתוח חיסוני

פולשנית הקמת Murine Orthotopic שלפוחית ​​השתן xenografts

צעד אחד טיהור זיהוי תכונות חומרים שלילית של

ביסוס מודל שטחי של סרטן שלפוחית השתן בעכברים באמצעות טכניקת ניהול תאים תוך-שלפוחית

הערכת היעילות האנטי-סרטנית של חלבון אימונומודולטורי חיידקי במודל מורין

מודל גידול Murine Orthotopic שלפוחית השתן סרטן מערכת איתור

שלפוחית השתן עכבר וול Injection

דגם orthotopic של סרטן שלפוחית השתן Murine

שלפוחית השתן Orthotopic גידול דגם ואת הערכת טיפול סרנה השלפוחית

סרטן שלפוחית השתן לדגם orthotopic ג'ין משלוח לימודים

אינדוקציה של קרצינומה של תאי מעבר שלפוחית השתן פולשנית בMUC1 עכברים הטרנסגניים חיסוניים אנושיים שלמים: מודל לפיתוח חיסוני

פולשנית הקמת Murine Orthotopic שלפוחית השתן xenografts