עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענקי NIH, R44 GM087784 וR01 HL109505. מחברים מודים לצוות הטכני וOEM בGilson, INC לתמיכה טכנית מורחבת.

המחברים MKC, MJG, EEB, NJD וRO הם או היו בזמנם של עובדי פיתוח של InvivoSciences, INC שהגו ופיתחו את הפרוטוקולים רובוטית שתוארו כאן. TW הוא CSO לInvivoSciences INC. SH הנו עובד Gilson INC.

<html> במחקר הנוכחי פיתחנו שיטה של ​​תרבות רובוטיות לייצור iPSC שממזערת וממכן האכלה והמעבר בפורמט צלחת 96-היטב גם בעת מאפשרת קנה מידה עד יעילה. רובוט טיפול נוזלי שימש להאכיל באופן שגרתי מושבות iPSC ומעברם במרווחים זמן קבועים על ידי ניתוק האנזימטית. הרובוט גם לתכנת לייצר צלחות מצופים ג&#39;ל מטריקס ולבצע שיפוע צפיפות זריעה. כאשר פיברובלסטים וiPSCs שומן נגזר היו בתרבית במערכת זו ליותר מ -20 קטעים, כ -3 חודשים, pluripotency נשמר, כמו היו karyotypes היציב. שני שורות התאים היו מסוגלים בידול לשריר לב. יחד, האוסף של פרוטוקולים שתואר כאן מאפשר למשתמשים עם ניסיון מועט מאוד בתאי גזע תרבות, או גישה מוגבלת לציוד תרבות מיוחד, לתאי גזע תרבות ולהשיג ייצור תאים גבוה או רב-קו טיפול עם מינימאלית עבודה ועלות. s = &quot;jove_content&quot;&gt; הפרוטוקולים רובוטית המפורטים כאן מספקים שיטה לקנה מידה עד חסכוני של ייצור וטיפול iPSC. יתרון אחד הוא התרבות של תאי גזע להרחבה בפורמט המבוסס צלחת הוקמה הפגין כאן והעבר 44,47 - 49 כדי לשמור על pluripotency. בעוד פורמטים אחרים של תאי pluripotent תשואת תרבות תאי גזע מדרגי 20,23,29 שיטה מבוססת צלחת זה דורש בעצם לא חל שינוי בפורמט התרבות, כמו adaption להשעיה, שימוש בכימיקלים או antifoaming שימוש ממושך של מעכבי Rho-kinase 20. שיטה מבוססת צלחת זו ולכן במהירות, וצפויה יכולה, להכיל קווים חדשים, כי תנאי התרבות דומים. ככל שהשימוש בiPSCs לדוגמנות מחלה מגביר 4,6,19,50, קווי iPSC חדשים נוצרים באופן רציף. הטכניקות המתוארות כאן הן מתאימות ביותר לקווי תרבות חדשה במדיום לעוצמת שמע גבוה ותפוקה בגלל המחסום למעבר אל הפורמט הוא lאוו. זה נכון גם לעבודה והציוד הדרוש כדי לשמור על המושבות. לבסוף, בגלל הפורמט והטיפול דומים לסביבה המשמשת לחישוב ולאמת קווי iPSC, ביצועי תרבות, כגון בידול מכוון, עשוי להיות צפויים יותר. איור 8 ממחיש אסטרטגיה אחת לקנה מידה מייצור תאי גזע ב96-גם צלחות. צלחת אחת (מחזור 0) משמשת לזרע רובוט 12 צלחות חדשות, גידול של פי 12 (מחזור 0-1). אחרי כמה ימים של האכלה, אחד משנים עשר הצלחות הוא passaged זרע קבוצה נוספת של שנים עשר צלחות (מחזור 1 למחזור 2). הצלחות עשר שנותרו זמינות כעת לשימושים אחרים ומייצגות את רכיב הייצור של המערכת. בקצב הזה, מעבר של צלחת אחת יספק 11 צלחות בכל מחזור, או כל 3-4 ימים. מתודולוגיה זו וניתן לשנותם יותר כאשר צלחות מרובות passaged כפי שמוצגות במעבר מהמחזור 2 למחזור 3. במחזור 3, שתי צלחותתמיד נהג לשמור על המושבה והזרע 24 צלחות חדשות. 22 צלחות הנותרות אז זמינות לשימוש לאחר כל מחזור מעבר. בכל נקודה במחזור תחזוקת המשתמש יכול זרע יותר צלחות להגדיל את הייצור. דוגמא אחת תהיה מעבר לכל עמודה לשני מחזורי צמיחה. המעבר הראשון ממיר צלחת אחת לשנתי עשר צלחות, וכל אחד מעשר הצלחות משמש לזרע 144 צלחות. במקרה זה, משתמש מתחיל עם צלחת אחת ואחרי שני מעברים, או על 1.5-2 שבועות של תרבות, יש 144 צלחות. לדוגמא, קווי iPSC פיברובלסטים ושומן להניב כ 25-75,000,000 תאים לכל צלחת 96-היטב כאשר מוכנים למעבר. 144 צלחות לכן יכולות לייצג על 4-7 x 10 9 תאים. מהו נטל העבודה לביצוע 144 96-גם צלחות רובוט? אחת המטרות לעבודה זו הייתה הפקת תאי גזע להרחבה שצמצמה עבודה בהשוואה ל( צלחת כלומר, 6 היטב) מסורתית נובע תרבית תאים. ACC הרובוטomplishes זה על ידי הקלה בצורך להתמודד מבחינה פיזית כל צלחת במהלך ההאכלה וpassaging. בעוד קשקשי ייצור צלחת 96-היטב באופן ליניארי כמו שזה יהיה ב6-גם צלחות מסורתיות, זמן טכנאי מבלה בעבודה עם הצלחות הוא פחות משמעותי באמצעות תרבות רובוטית. יעילות הייצור של תרבות רובוטית נגזרת מהבדל זה (איור 9). נמצא טכנאים יכולים להסיר 6-גם צלחת מן החממה, לבדוק את זה במיקרוסקופ, אז לשאוב ולהאכיל את הצלחת בכ -3.5 דקות. לשם השוואה, טכנאים לבלות כ -30 שניות הסרת צלחת 96-היטב מהחממה ובודקים אותו במיקרוסקופ לצפיפות וזיהום לפני הצבתו על הרובוט. עם פרוטוקול האכלה מורחב דומה לזה שתואר לעיל, ניתן לטעון שש 96-גם צלחות והפד, אשר לוקחת כ -21 דקות, או 3.5 דקות לכל צלחת. סה&quot;כ הזמן שחלף כדי להאכיל את הצלחת הוא השוואה בין הרובוטIC ושיטות ידניות, אלא יד להאכיל 6 צלחות טכנאי נדרש לכל 21 דקות ואילו הטכנאי מבלה רק 3 דקות טיפול שש הצלחות לרובוט (בדיקת 30 שניות לכל צלחת). כאיור 9 מופעים, זמן טכנאי מבלה טיפול 144 צלחות באמצעות הרובוט הוא כ -1.2 שעות לעומת 8 שעות באופן ידני והרובוט לעולם לא יעשה טעות טיפול הצלחות או העברת נוזלים. שיטות תרבות iPSC 96-היטב המתוארות כאן לספק פלטפורמה צייתנית למשימות הקרנה מורכבות. מכיוון שכל גם הוא זהה מבחינה גנטית וזרע באותו צפיפות מאותו המאגר הראשוני, יכול להיות מופץ משתנה בין הצלחת ומתוחזק על ידי הרובוט עם מאגרים זמינים מסחרי להפריד תנאים. זה יהיה שימושי עבור ניסויים כגון פיתוח צמיחת תאי גזע תקשורת 34,35,47, בדיקות מצע או מצב התרבות ומחקרי רעילות ניצול תאי גזע51. מאז כל שורת תאי גזע היא ייחודית במונחים של דרישות גודל מושבה והמעבר אופטימליות, ניתן להשתמש במערכת זו לווסת צפיפות זריעה, תדירות האכלה וטיפול מעבר על ידי מניפולציה של העמודות שנקטפו, התסיסה המכנית במהלך מעבר ותדירות ההאכלה. Iterating דרך המשתנים הללו יאפשר למשתמש למצוא במהירות סט של תנאים מתאימים לתרבות של קו חדש או לפתח טכניקות תרבות חדשות. מערכת רובוטית היא גם מסוגלת לשמור על 96 מושבות תאי גזע מקבילות אך עצמאיות. כאשר iPSC נגזרים מהתאים סומטיים או משובט לאחר מניפולציה גנטית, רבים שיבוטים מקבילים מוקרנים להניב קווי iPSC פוטנציאליים. ברגע שתאים בודדים הם זורעים לתוך 96-גם צלחות, מערכת זו יכולה להאכיל ומעבר 96-גם צלחות שמירה כל מושבה הפרדה. זה מאפשר תפוקה גבוהה מאוד בעת בחירת שיבוטים פוטנציאל ומבטל את הקושי בculturing הפיזי 96 קווים מקבילים. שיטה זו גםllows בקנה המידה גדול ייצור של כל שיבוט כך חומר שכבר זמין לניתוח מקביל. לבסוף, אנו רואים שילוב טכניקות אלה התרבות עם מערכת סחר צלחת רובוטית המספקת צלחות ומהחממה מאפשרת תרבות אוטומטית לחלוטין. זה יכול להיות מושלם עם יותר רובוטיקה המורכבת המאפשרת להרחבה גדולה יותר מאז הפרוטוקולים הבסיסיים שתוארו כאן הם להעברה למערכות אחרות המבוססות צלחת. השלבים הקריטיים הראשונים כדי לטפל בפרוטוקולים הם אלה המונעים ולבדוק לזיהום כגון צעדים 1.5 ו -4.2. זיהום, כפי שפורט לעיל, ניתן להימנע בהצלחה אם טכניקה סטרילית טובה ושכל ישר מנוצלים. זה הכרחי, ללא קשר לפורמט תרבות תאי גזע, שצק המפעיל לזיהום ועושה זאת בפרוטוקול זה בצעדים שצוינו יהיה להפחית באופן משמעותי את הסיכון לזיהום. יישום ג&#39;ל מטריקס הנכון הוא ESS שניצעד ential להצלחה הכוללת של פרוטוקול זה. ללא ציפוי כראוי 96-גם הצלחות, תאי הגזע לא יגדלו. בעיה נפוצה אחת היא ציפוי גם לא שלם. ניסיון הוכיח כי בועות אוויר, משיכה אלקטרוסטטית ופעולת נימים לעכב ציפוי גם מלא. הצעד מראש ההרטבה (1.6) פותח כדי לשפר את הציפוי גם תחתון באופן משמעותי ולא צריך לדלג עליו. צעד ההרטבה מראש זה מופיע כדי להפחית את הידרופוביות לכאורה של צלחת 96-היטב פלסטיק כך שכאשר ציפוי ג&#39;ל מטריקס מיושם הוא מופץ באופן שווה על פני גם תחתי ודפנות. מומלץ גם לטפוח בעדינות 96-גם הצלחות נגד יד נקייה מצופה פעם אחת כדי להבטיח הפצת פתרון ג&#39;ל מטריקס אפילו תאית. הפרמטרים הניתוק הם גם חשובים כדי לייעל. דגירה ממושכת עם אנזים או מגיב ניתוק מבוסס EDTA תגרום תאים בודדים שיכולה או לא יכולה להיות המטרה במעבר. לכן, המפעילצריך להקדיש תשומת לב מיוחדת לאופן שזמן ניתוק, כוח טחינה דקה, וחזר שוב ושוב לשטוף להשפיע מורפולוגיה מושבה ובריאות ולהתאים בהתאם. הבנת המגבלות לטכניקות המתוארות כאן הן בעל חשיבות עליונה לפעולה מוצלחת. כמו בכל הגדרת תרבות תאים אחרת, השימוש בלוחות 96-גם מהווה סיכון לזיהום גבוה יחסית. כפי שתואר לעיל, טכנאי הוא טיפול בכל צלחת במהלך ההאכלה וpassaging; לדוגמא, בעת פתיחת המכסה, לשים את הצלחת על מיטת הרובוט, ולבדוק את הצלחת על המיקרוסקופ. לכן, כאמור, לאחר שלב 1.5, זה הכרחי שלא לגעת בחלק הפנימי של כל מכסה צלחת או לחשוף את החלק הזה לכל משטח מזוהם כמו בלוקים המשופעים חימום או סיכות אנכיות על המיטה. במהלך פיתוח פרוטוקול מגבלה זו התגלתה והייתה המניע לפיתוח מתלה להחזיק מכסים בצלחת כדי לשמור על סטריליות. כמו כן, מאגרי השוקת, טיפים pipet וoאספקת יס על מיטת רובוט טיפול הנוזלית הן מקורות פוטנציאליים לזיהום, כי הם פתוחים לסביבה ומטופלים על ידי הטכנאי. לכן, טכניקה סטרילית טובה צריכה להיות מיושמת כמו צמצום תנועות על פני חומרי תרבות חשופים או נוזלים פתוחים. מגבלה נוספת היא שכאשר הפרוטוקול בקנה מידה גדול, מבחינה ויזואלית בודק כל גם של&gt; 100 96-גם צלחות היא מסורבל. זה יכול להיות מטופלים על ידי חזותי בודק את כל הצלחת לסימנים של זיהום, כגון תקשורת עכורה, לזהות בארות חשודות. לקנה מידה עד עתיד, שימוש במיקרוסקופ ומחוון של צמיחת תאים וזיהום פוטנציאלי אוטומטיים ישולב. לסיכום, 96-גם הפלטפורמה מבוססת התפוקה גבוהה שתוארה כאן מציעה שיטה לשחזור, איכות גבוהה לתרבות תאי גזע והפקה בפורמט צלחת. שיטה זו מקטינה את הניסיון הנדרש, זמן דרוש ועבודת ציוד הייעודי לגזע תוך תרבית תאיםשמירה על היתרונות של תרבות חסיד מסורתית.

השימוש בתאים אנושיים הנגרם pluripotent גזע (iPSCs) גדל באופן משמעותי מאז גזירתם בשינה 2007 1 לבדיקת מתחם, רפואת רגנרטיבית ומודלים מחלה 2-6. דרישה זו מגיעה מהיכולת של iPSC להניב מספר גדול של תאי pluripotent שיכול להיות מובחן לתוך תאים סומטיים בכמות שאין כמותו. טכניקות בידול מכוונים לשפר 7-10 ופיתוח של תאים אנושיים או דוגמנות רקמה וטיפול בתאים מגביר 11-14, כך גם הדרישה לייצור המוני של iPSCs באיכות גבוהה. הוא ציטט נרחב שבין מחלות אחרות, אוטם שריר לב או החלפה פונקציונלית ב-תא ידרוש מאות מיליון למליארד iPSC נגזר תאים סומטיים 15-18. דוגמנות רקמת 3D יתר על כן, מורכבת יותר ויותר לגילוי תרופות ולאherapy ידרוש מספר גדול של תאים 9,13,19. בכל דוגמאות הללו, מוגדרים, אחידים וiPSCs לשחזור חייב להיות זמין ופשוט כדי לייצר. על מנת לייצר גזע biopharmaceutics תא נגזר ותאים להנדסה והשתלת רקמות, טכנולוגיית תא-ייצור חסכוני היא חיונית. ייצור בקנה מידה של iPSCs התמקד בתרבות השעיה 20 - 25 או השעיה עם השימוש במצעי microcarrier 26-28 גם בגלל טכניקות אלה פרוסות בהצלחה בקנה מידה גדולה שאינו iPSC ייצור מבוסס,, האיקריוטים. מספר קבוצות הפגינו מערכות תרבות השעיה שתנבנה תאי גזע pluripotent 20,21,23,24,29. עם זאת, גישות אלה לנצל מערכות יקרות ומורכבות לא זמינות לחוקרים לפתח תוכניות בידול רומן, נהיגה הנדסת רקמות ועושה Laboratמחקר בקנה מידה אורי. יתר על כן, תרבויות iPSC השעיה וmicrocarrier דורשות הסתגלות וטכניקות או כימיקלים לא מצאו בתרבות iPSC חסיד מסורתית כגון שימוש רצוף של מעכבי Rho-קינאז, סוכני antifoaming וסינון להסדיר צבירה. לחץ פיזי לתאים שכיח יותר בתרבות השעיה, שהוצג על ידי תסיסה מכאנית, כמו גם במהלך התנגשות microcarrier. נושאים אלה מגבילים את יכולת החיזוי והמהירות שבה נוצר זה עתה נובע יכול להיות מתורבת שורות תאים בתרחיף. אחרים פיתחו מערכות טיפול צלחת רובוטית המחקות טכניקות תרבות צלחת 30,31 אבל פלטפורמות אלה דורשים השקעות משמעותיות לציוד ומומחיות לפעול בנוסף לאתגרים הבסיסיים הקשורים לתרבות תאי גזע. העבודה הבאה מתארת ​​את הפיתוח ותרגול של מערכת תרבות iPSC מדרגי שמנצל נוזל עצמאי, סטנדרטי ערוץ 8-רובוטיתצלחות מטפל ו96-היטב. שיטה זו נועדה לגשר בקנה מידה המעבדה תרבות iPSC וייצור iPSC בנפח גבוה (למשל, 10 7-1.5 x 10 9 תאים לכל שבוע לטכנאי) המאפשרים פיתוח טכנולוגיות אלה iPSC חדשים בקנה מידה בקלות את הייצור ללא השקעות בחומרה או בעבודה גדולה. שיטה זו היא זולה יחסית להגדיר, דורשת לא מעט ניסיון תרבות תאי גזע, תכנות או הנדסה, יש לו טביעת ציוד קטנה ללא הצורך במכסת מנוע תרבית תאים ייעודי, ומשתמשת בציוד תרבית תאים סטנדרטי כדי לאפשר בינוני עד גבוהה תפוקה האוטומטית ייצור תאים. המטרה הייתה לפתח מערכת מסוגלת תרבות תאי גזע להרחבה שיכולה להיות מנוצלת על ידי מעבדות חדשות לבלום תרבית תאים, אלה שימצאו במדריך טיפוח מחסום לפיתוח הרעיונות שלהם או אלה שרוצים אמצעי חסכוני לייצר מספר גדול של תאי גזע. הפלטפורמה שהוצגה כאן מסירה השפעת טכנאי בגזע תרבות תא ומנרמל את נהלי האכלה ומעבר כדי לאפשר ייצור תאי גזע עולה בקנה אחד.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>96-well; Well volume: 360uL; Cell growth area: 0.32cm2; Individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Trough</td>
			<td>SeahorseBio</td>
			<td>201308-100</td>
			<td>Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167023</td>
			<td>10 racks gilson 96tips D200 tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12500062</td>
			<td>DMEM/F12 powder.&#160; Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factor Reduced Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Referred to as, &#34;extracellular matrix gel&#34; in the text.&#160; Matrigel GFR, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5857</td>
			<td>mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 Media</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>AdooQ BioScience</td>
			<td>A11001-50</td>
			<td>Rock inhinitor Y-27632 2HCI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>ACCUTASE</td>
			<td>Referred to as, &#34;proteolytic and collagenolytic dissociation reagent&#34; in the text.&#160; Accutase 500 mL sterile cell solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH30256FS</td>
			<td>PBS w/o CA MG 500 mL, 6/pk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson PIPETMAX</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>PIPETMAX</td>
			<td>http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable 96-well plate based ipsc culture and production using a robotic liquid handling system

קידום המשיך בתרבית תאי גזע pluripotent סוגר את הפער בין הספסל והמיטה לשימוש בתאים אלה ברפואת רגנרטיבית, גילוי תרופות ובדיקות בטיחות. על מנת לייצר גזע biopharmaceutics תא נגזר ותאים להנדסה והשתלת רקמות, טכנולוגיית תא-ייצור חסכוני היא חיונית. תחזוקה של pluripotency וביצועים יציבים של תאים ביישומים במורד הזרם (לדוגמא, התמיינות תאים) לאורך הזמן היא בעל חשיבות עליונה לייצור תאים בקנה מידה גדול. עם זאת, זה יכול להיות קשה להשגה במיוחד אם הם תאים בתרבית באופן ידני שבו המפעיל יכול להציג את ההשתנות משמעותית, כמו גם להיות יקר בקנה המידה-עד. כדי לאפשר תפוקה גבוהה, ייצור תאי גזע בקנה מידה גדולה ולהסיר פרוטוקולי תרבות תאי גזע רומן השפעת המפעיל באמצעות ספסל העליון רב-ערוצי נוזל טיפול רובוט פותחו הדורשים מעורבות טכנאי מינימאלית או ניסיון. עםתאים אלה אנושי פרוטוקולים מושרה גזע pluripotent (iPSCs) היו בתרבית בתנאים ללא מזין ישירות ממניות קפוא ונשמרו ב96-גם צלחות. בהתאם לשורת תאים ושיעור בהיקף של עד רצויה, המפעיל יכול בקלות לקבוע מתי מעבר מבוסס על סדרה של תמונות המראות את צפיפות המושבה האופטימלית לפיצול. אז ריאגנטים הצורך מוכנים לבצע פיצול מושבה לצלחות חדשות בלי צעד צנטריפוגה. אחרי 20 קטעים (~ 3 חודשים), שני קווי iPSC נשמרו karyotypes היציב, הביעו סמנים של תאי גזע, ומובחנים לשריר לב עם יעילות גבוהה. המערכת יכולה לבצע הקרנת תפוקה גבוהה הבאה של פרוטוקולים חדשים בידול או מניפולציה גנטית נועדו ל96-גם צלחות. טכנולוגיה זו תפחית את נטל העבודה וטכני לייצר מספר גדול של תאי גזע זהים למספר עצום של יישומים.

Watch this Scientific Journal Video about Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System at JoVE.com

Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes.

פלייט מדרגי 96-גם בהתבסס iPSC תרבות וייצור באמצעות מערכת רובוטית טיפול נוזל

Continued advancement in pluripotent stem cell culture is closing the gap between bench and bedside for using these cells in regenerative medicine, drug ...

scalable-96-well-plate-based-ipsc-culture-production-using-robotic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

31.4K Views.  InvivoSciences, Inc.. The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes. 

Video: Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Encapsulation אלגינט של תאי גזע pluripotent שימוש נחיר Co-הצירית

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that adheres to form the midline epithelial seam (MES). The theories suggest that MES cells follow an epithelial to mesenchymal transition (EMT), apoptosis and migration, making a fused palate 1. Complete disintegration of the MES is the final essential phase of palatal confluence with surrounding mesenchymal cells. We provide a method for palate organ culture. The developed in vitro protocol allows the study of the biological and molecular processes during fusion. The applications of this technique are numerous, including evaluating responses to exogenous chemical agents, effects of regulatory and growth factors and specific proteins. Palatal organ culture has a number of advantages including manipulation at different stages of development that is not possible using in vivo studies.

Studies of palate development are motivated by the incidence of cleft palate, a birth defect that imposes a tremendous health burden and can leave lasting disfigurement. We demonstrate here a technique to culture palatal shelves that can be used to study different signaling pathways involved in palatal development and fusion.

שיטה של ​​לימוד Palatal היתוך באמצעות סטטי איברים תרבות

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

שיבוט פונקציונלי שימוש<em&gt; Xenopus</emמערכת ביטוי ביצית&gt;

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

מעקב תאים דג הזברה GFP מהונדס שימוש במערכת photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

ייצור בקנה מידה גדולה של cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם באמצעות פרוטוקול בידול מולקולה קטן המבוססת לשחזור ביותר

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

את ייצור תאי גזע פלוריפוטנטיים מתאי מי שפירים עכבר באמצעות מערכת transposon

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

מכשיר לביצוע נדידת תאים / ריפוי פצעים צלחת 96-ובכן

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) is particularly attractive for neurodegenerative disease studies, including retinal dystrophies, where iPSC-derived retinal cell models mark a major step forward to understand and fight blindness. In this paper, we describe a simple and scalable protocol to generate, mature, and cryopreserve retinal organoids. Based on medium changing, the main advantage of this method is to avoid multiple and time-consuming steps commonly required in a guided differentiation of iPSCs. Mimicking the early phases of retinal development by successive changes of defined media on adherent human iPSC cultures, this protocol allows the simultaneous generation of self-forming neuroretinal structures and retinal pigmented epithelial (RPE) cells in a reproducible and efficient manner in 4 weeks. These structures containing retinal progenitor cells (RPCs) can be easily isolated for further maturation in a floating culture condition enabling the differentiation of RPCs into the seven retinal cell types present in the adult human retina. Additionally, we describe quick methods for the cryopreservation of retinal organoids and RPE cells for long-term storage. Combined together, the methods described here will be useful to produce and bank human iPSC-derived retinal cells or tissues for both basic and clinical research.

The production of specialized retinal cells from pluripotent stem cells is a turning point in the development of stem cell-based therapy for retinal diseases. The present paper describes a simple method for an efficient generation of retinal organoids and retinal pigmented epithelium for basic, translational, and clinical research.

קסנו נטולת מוגדר ותנאים מזין ללא תרבות לדגמי הדור של האדם נגזר iPSC רשתית תא

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart disease. When using prosthetic materials however, these grafts are susceptible to bacterial infections and various host responses.
Identification of bacterial and host factors that play a vital role in endovascular adherence of microorganisms is of importance to better understand the pathophysiology of the onset of infections such as infective endocarditis (IE) and to develop preventive strategies. Therefore, the development of competent models to investigate bacterial adhesion under physiological shear conditions is necessary. Here, we describe the use of a newly designed in vitro perfusion chamber based on parallel plates that allows the study of bacterial adherence to different components of graft tissues such as exposed extracellular matrix, endothelial cells and inert areas. This method combined with colony-forming unit (CFU) counting is adequate to evaluate the propensity of graft materials towards bacterial adhesion under flow. Further on, the flow chamber system might be used to investigate the role of blood components in bacterial adhesion under shear conditions. We demonstrated that the source of tissue, their surface morphology and bacterial species specificity are not the major determining factors in bacterial adherence to graft tissues by using our in-house designed in vitro perfusion model.

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

We describe an in-house designed in vitro flow chamber model, which allows the investigation of bacterial adherence to graft tissues.

מודל במבחנה של מערכת מקבילה-Plate זלוף ללמוד חיידקי ההקפדה להשתיל רקמות

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

3-מימדי אנגיוגנזה שיטת מערכת באמצעות Spheroids שיתוף תרבות נוצר על ידי ויוצרים מושבת המושבה תאים ותאי גזע Mesenchymal

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...