Bu çalışma NIH hibe, R44 GM087784 ve R01 HL109505 tarafından kısmen desteklenmiştir. Yazarlar genişletilmiş teknik destek için, Gilson de INC teknik ve OEM ekibine teşekkür ediyorum.

96 gözlü plaka formatında geleneksel yapışkan kültür koşullarını korurken Aşağıdaki protokoller için Gilson en pipetmaX olan robot sıvı taşıma sistemi, ölçeklenebilir kök hücre kültürü ve otomatik kolaylaştırır. Geleneksel 6-çukurlu plaka kültürü gibi, iPSCs ayrı koloniler, bir tek tabaka olarak değil, 96 oyuklu bir plaka biçiminde, bu protokol ile yetiştirilmektedir. Her oyuk izogenik ya da ayrı olabilir ve robot her bir oyuğa ayrılmış devam çünkü yapılandırma da paralel kültürlenebilir. kültürler özelleştirilebilir bir zamanlama ve kullanıcı böylelikle ekim yoğunluğu ve ölçek oranını kontrol ayrışma yöntemi ve bölme oranını seçer bir geçit programı beslenen bir beslenme programı: Tipik robotik iPSC kültür rutin iki aşaması vardır. Aşağıdaki protokoller yeni bir kültür besleme ve geçit gerçekleştirilir nasıl başladı ve iPSC kültürünü kolaylaştıran ek programlar nasıl açıklar. 1. Hazırlama Ekstrasellüler matris jel kaplı 96 oyuklu levhalar <ol><li> Altı yeni RT 96 oyuklu plakalar ambalajını çıkartın ve pozisyonlar 2, 3, 5, 7, 8, 9 (yatak pozisyonları Şekil 1A bakınız) robot yatak taşıma sıvısı üzerine yerleştirin. </li><li> Yatak konum 6&#39;da bir önceden soğutulmuş, 4 ° C 4-çukurlu çukur yerleştirin. </li><li> Önceden soğutulmuş, 4 ° C 200 ul pipet uçları ile yatak pozisyonunda 1 ucu rafın yük sütunu 12. </li><li> Steril tekniği kullanarak bir kısım dökerek 25 ml 4 ° C DMEM / F12 ile yatak pozisyonunda 6 iyi ilk (sol çoğu) çukur doldurun. Alternatif olarak, transferi tamamlamak için pipet kullanın. </li><li> (PLHR, Şekil 1A bakınız) 96-plaka kapaklarını çıkarın ve özel olarak tasarlanmış plaka kapağı tutan rafın içine her kaydırın. Temastan kaçınınplaka kapakları iç ile. Not: Bir tabak kapağın içini Taşıma veya bir kapağın içinde başka dışında bulaşma için mükemmel bir yoldur dokunan plaka kapakları istifleme. </li><li> Robotik kontrolü dokunmatik tabletin kullanılması, iyi ön ıslatma işlemini başlatmak için düğmeler aşağıdaki dizi basın: <ol><li> &quot;Bir Protokol çalıştır&quot; düğmesine dokunun. </li><li> &quot;Hücre dışı matris jel ön ıslatılmış&quot; seçin ve sonraki dokunun. </li><li> Kullanıcı kararı: Seçilen program önceden test etmek için adım-adım sihirbazı kullanmak için &quot;deneme&quot; dokunun. Not: robot çalışmaz ziyade yazılım yazılım sorunları için protokol sınar. &quot;Kur atlamak&quot; dokunarak kurulan protokolleri ile kabul edilebilir. </li><li> &quot;Run Protokolü&quot; düğmesine dokunun. </li></ol></li><li> Ön ıslatma işlemi (adım 1.6) sırasında 1.8 adıma geçin. </li><li> Büyüme faktörü buz bir 4 mg kısım üzerine çözülme 50 ml içinde bulunan hücre dışı matris jel (GFRM) azalırkonik tüp -80 ° C&#39;de saklandı. Kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde kısım tutun. Not: oda sıcaklığına gelmeye bırakılmış ve yararlı olmayacak eğer GFRM katılaşmaktadır. </li><li> 25 ml&#39;lik bir cam pipet ile 24 ml 4 ° C DMEM / F12 içinde 4 mg GFRM kısım yeniden süspanse edin. DMEM / F12 aktarırken, pipet GFRM kısım resuspending önce soğuması için 2-3 saniye duraklama. </li><li> Ön-ıslatma işlemi (adım 1.6) tamamlandığında, 1.11 adıma devam eder. </li><li> Yatakta pozisyonunda 6 çukur dördüncü kuyusuna DMEM / F12 GFRM karışımı 24 ml aktarın. </li><li> Robotik kontrol touch pad kullanarak, hücre dışı matris jel kaplama işlemini başlatmak için düğmeler aşağıdaki dizi basın: <ol><li> &quot;Bir Protokol çalıştır&quot; düğmesine dokunun. </li><li> &quot;Hücre dışı matriks jel kısım&quot; seçin ve sonraki dokunun. </li><li> Kullanıcı kararı: Seçilen program önceden test etmek için adım-adım sihirbazı kullanmak için &quot;deneme&quot; dokunun. Not: robot çalıştırmak ancak rathe değilr yazılım yazılım sorunları için protokol sınar. &quot;Kur atlamak&quot; dokunarak kurulan protokolleri ile kabul edilebilir. </li><li> &quot;Run Protokolü&quot; düğmesine dokunun. </li></ol></li><li> Adım 1.12 tamamlandığında, plaka kapaklarını değiştirin. </li><li> 37 ° C,% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör hücre dışı matris jel kaplı 96 oyuklu plakalar transfer ve plakalar kullanmak veya hafızaya hazır olacak bu noktada 24 saat orada tutun. Not: hafifletici koşullar altında, yeni kaplanmış hücre dışı matris jel plakaları önerilir inkübasyon, ancak 24 saatlik inkübasyon için O / N, 15-30 dakika sonra kullanılabilir. </li><li> Tekrarlama protokol 1.1, 1.3, GFRM ile DMEM / F12 tüm kadar 1,5-1,6, 1.10 ve 1,12-14 kullanılır adımları. </li></ol> 2. Saklama Ekstrasellüler matris jel kaplı 96 oyuklu levhalar <ol><li> 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör hücre dışı matris jel kaplı 96 oyuklu plakalar. </li><li> İsteğe bağlı: Ahücre-dışı matrisin llow jel kaplı 96 oyuklu plakalar 2.3 adımına devam etmeden önce, oda sıcaklığına gelmesi. Not: Bu isteğe bağlı bir adımdır plakaları 4 ° C&#39;de konulduğunda yoğunlaşma kurmak azaltacaktır. </li><li> Pozisyonlar 2, 3, 5, 7, 8, 9 (yatak pozisyonları Şekil 1A bakınız) sıvı kotarma robotu yatak plakaları yerleştirin. </li><li> RT 200 ul pipet uçları ile yatak pozisyonunda 1 ucu rafın yük sütunu 12. </li><li> Yatak konum 6&#39;da dört çukur rezervuar yerleştirin. </li><li> (En sağdaki) RT DMEM / F12 ile rezervuarın kuyusunu 4 doldurun. </li><li> 96-plaka kapaklarını çıkarın ve PLHR içine her kaydırın. </li><li> Robotik kontrol touch pad kullanarak, düğmelerin aşağıdaki kombinasyonuna basın: <ol><li> &quot;Bir Protokol çalıştır&quot; düğmesine dokunun. </li><li> &quot;Hücre dışı matriks jel kısım&quot; seçin ve sonraki dokunun. </li><li> Kullanıcı kararı: Seçilen program önceden test etmek için adım-adım sihirbazı kullanmak için &quot;deneme&quot; dokunun. Not: Robot çalışmaz ziyade yazılım yazılım sorunları için protokol sınar. &quot;Kur atlamak&quot; dokunarak kurulan protokolleri ile kabul edilebilir. </li><li> &quot;Run Protokolü&quot; düğmesine dokunun. </li></ol></li><li> Tamamlandığında, plaka kapaklarını değiştirmek ve makine yataktan plakaları çıkarın. </li><li> 6 inç parafın film şeridi ile bir inç her hücre dışı matris jel (kapak plakası karşılayan) kaplı 96 oyuklu plakanın tüm yan etrafında sarılır. Hava geçirmez bir mühür oluşturmak için parafin filmi germek emin olun. </li><li> İsteğe bağlı: tamamlanan hücre dışı matriks jel kaplama tarih plakaları Etiket, hücre dışı matris jel lot numarası, kullanıcı adı ve diğer bilgiler. </li><li> Onlar kadar iki hafta boyunca kullanmak için iyi olacaktır 4 ° C&#39;de plakaları saklayın. Not: Tabaklar başarıyla ancak bu tavsiye edilmez, iki haftalık sınırın ötesine kullanılmıştır. </li></ol> 3. Kök Hücre Colony Yayımlama Yoğunluk SahneCanlı veya dondurulmuş Kültür 96-kuyu Plate Formatında Gradyan: Nasıl başlatın veya bir Kök Hücre Hattı Normal Passage Aralıkları Geri Yükleme <ol><li> Donmuş bir kültür ile başlayan varsa, 3.2 adıma geçin. Zaten bir plaka üzerinde canlı kök hücre kültürü ile başlayan, adım 3.5 başlar. </li><li> Buz sadece küçük bir yığın kalana kadar 37 ° C su banyosu içinde tüp dönen donmuş kültür çözülme. </li><li> İsteğe bağlı: 10 uM Y27632 ihtiva eden taze SCGM süpernatan ortamı aspire ve 7 ml kök hücre pelletini, 300 x g&#39;de 2 dakika süre ile hücre büyüme ortamı (SCGM), santrifüj kök R, 10 ml eritilmiş hücreleri ile seyreltilir. Not: Bu adım donma medya taşınmasını ortadan kaldırır. </li><li> 3.6 Adım geçin. </li><li> Canlı ile başlayan varsa, zaten kök hücreleri kaplama: geçit hücreleri normal olarak enzimatik veya non-enzimatik ayrışma kullanarak. 1,5-3000000 hücrelerinin toplam hasat etmeye çalışın; Genellikle, altı oyuklu plakanın bir de. Hasat hücreler santrifüj2 dk 300 xg&#39;de, süpernatant medya aspire ve 10 mM Y27632 içeren 7 ml taze SCGM kök hücre pelletini. 3.6 Adım geçin. </li><li> Hücreler sağlamak ya donmuş bir ya da canlı kültürden, 10 uM Y27632 7 mi RT SCGM içerisinde süspanse edilir. </li><li> RT 200 ul pipet uçları ile yatak pozisyonunda tek uç rafın yük sütunu 12. </li><li> Yatak 2 konumunda bir dört çukur rezervuar yerleştirin. </li><li> Yerleştirin yeni bir hücre dışı matris jel kaplı 96 oyuklu plaka yatağı 5 konumundaki 37 ° C&#39;ye kadar ön-ısıtılır ve PLHR yerleştirerek kapağı çıkarın. </li><li> Pipetlemeyin ile rezervuarın kuyuya 3 yeniden süspanse hücrelerin 7 ml aktarın veya steril dökün. <ol><li> Robotik kontrol touch pad kullanarak, düğmelerin aşağıdaki kombinasyonuna basın: </li><li> &quot;Bir Protokol çalıştır&quot; düğmesine dokunun. </li><li> &quot;Tohum Yoğunluk Gradient&quot; i seçin ve yanındaki dokunun. </li><li> Kullanıcı kararı: select önceden test etmek için adım-adım sihirbazı kullanmak için &quot;deneme&quot; dokununed programı. Not: robot çalışmaz ziyade yazılım yazılım sorunları için protokol sınar. &quot;Kur atlamak&quot; dokunarak kurulan protokolleri ile kabul edilebilir. </li></ol></li><li> &quot;Run Protokolü&quot; düğmesine dokunun. </li><li> Seyreltme serisi tamamlandığında, aşağıdaki besleme kadar 37 ° C,% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör plaka ve yeri yeniden kapsamaktadır. </li><li> İsteğe bağlı: Tarihe, gerilme bilgileri, kullanıcı adı, medya türü ve diğer ilgili bilgileri ile plaka etiketleyin. </li><li> Aşağıdaki Protokolü 4 kullanılarak gerektiği gibi önümüzdeki birkaç gün içinde, 96-plaka besleyin. Not: Tipik bir kök hücre plakası tam bir medya değiştireceğim kez her 24 saat gerektirir ve SCGM beslenmesi için Y27632 içermez; Sadece geçtikten sonra ilk tohumlama sırasında. Beslenme öncesinde, kirlenme ve koloni yoğunluğu plaka kontrol edin. Koloni yoğunluğu izleme konusunda daha fazla adım için 3.16 bakın. </li><li> C yakın Önümüzdeki birkaç gün içinde, çeşitli sütunlarplaka girmek (genellikle sütunlar 5-8) geçiş için ideal bir yoğunluk yaklaşım olacaktır; Bu yoğunluk tanımlamak için, akılda aşağıdaki bilgilerle Şekil 3B&#39;de gösterilen yoğunluk aralığında 96-plaka karşılaştırmak: <ol><li> Passage kolonilerin çoğunluk arasındaki boşluk bitişik koloni çapı yaklaşık% 25 olduğu zaman. Not: mantığı geçiş zamanı tanımlamak için beslenme ve büyüme başka bir döngü kaçınılmalıdır temas, yapım kolonilerde neden olduğunu ifade etti. </li></ol></li><li> Üniform seyreltilmiş plaka başlatmak ve düzenli kültürünü başlamak için ideal bir yoğunluk ve geçit olan bir sütun seçin. Geçişine Protokol 5&#39;e bakınız. </li></ol> 4. Besleme 96 oyuklu plaka Kök Hücre kolonileri Not: Aşağıdaki protokol, bir 96 oyuklu kök hücre koloni plakanın besleme tarif etmektedir. teknik, paralel toplam 6 plakaları barındıracak kadar ölçeklendirilebilir. <ol><li> 96-kuyu s kaldır37 ° C ile tem hücre kolonisi levha,% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör. </li><li> Kirlenme ve hücre yoğunluğu için plaka kontrol edin. Beslemek için, koloni yoğunluğu ideal bir kanalı yoğunluğunun altında olduğundan emin olun. Yoğunluk hakkında bilgi için Şekil 3B bakın. Not: Kirlilik olarak bulanık ortamı sunabilir ve hoş olmayan bir koku eşlik. Küçük, tabii ki sigara iPSC agrega da mikroskobik denetimi altında görülebilir. Hücre yoğunluğu değerlendirmek için yukarıdaki adım 3.16.1 bakın. </li><li> Bir eğimli, 37 ° C rampa yatakta 3 pozisyonunda 96 oyuklu kök hücre koloni plaka koyun. </li><li> RT 200 ul pipet uçları ile yatak pozisyonunda 1 ucu rafın yük sütunu 12. </li><li> Yatakta 2 pozisyonunda 4-iyi bir çukur yerleştirin. </li><li> Steril dökmek veya pipet transferi yoluyla Y27632 olmadan 2 8 ml taze yatak pozisyonu, RT SCGM içinde çukur kuyusunu 3 doldurun. </li><li> PLHR yerleştirerek 96-iyi kök hücre koloni plakası kapağını çıkarın. </li><li> KullanmaRobotik kontrol touch pad, düğmeler aşağıdaki kombinasyonuna basın: <ol><li> &quot;Bir Protokol çalıştır&quot; düğmesine dokunun. </li><li> &quot;Koloni Bir Plaka Yem&quot; ve yanındaki dokunun seçin. </li><li> Kullanıcı kararı: Seçilen program önceden test etmek için adım-adım sihirbazı kullanmak için &quot;deneme&quot; düğmesine dokunun. Not robot çalışmaz ziyade yazılım yazılım sorunları için protokol sınar. &quot;Kur atlamak&quot; dokunarak kurulan protokolleri ile kabul edilebilir. </li><li> &quot;Run Protokolü&quot; düğmesine dokunun. </li></ol></li><li> Besleme protokolü tamamlandığında, 96 oyuklu kök hücre koloni plaka yeniden kapak ve 37 ° C&#39;de geri dönmek için,% 5 CO2, aşağıdaki besleme ya da geçiş kadar nemlendirilmiş bir kuluçka cihazı gereklidir. Bu, genellikle, 24 saat sonra, gereklidir. Not: Tarih, ortam türü, kullanıcı adı ve diğer ilgili bilgilerle plaka kapağında besleme olayı kaydetmek için tavsiye edilir. </li></ol> 5. Pasajlanması 96 oyuklu PlHücre Koloni Kök yedik <ol><li> Birkaç beslenme döngüsünden sonra 96 ​​de kök hücre koloni plaka geçişi için hazır olacaktır. Bu protokol, 01:12 bölme oranını temsil eden, tek bir 96 oyuklu plakaya bir sütun geçişini tarif etmektedir. Kullanıcı bölünmüş oranını tanımlar ve komşu olmayabilir kuyuları seçerek dahil, split kuyular veya sütun herhangi bir sayı seçebilirsiniz. </li><li> Olup kanalı belirlemek için 3B Şekil 96 oyuklu kök hücre koloni plakası yoğunluğu Karşılaştırması. kolonilerin çoğunda arasındaki boşluk, bitişik koloni çapı yaklaşık olarak% 25 ya da daha sonraki bir besleme birbirlerine büyüyen koloniler ile sonuçlanacaktır idealdir geçit yoğunluğudur. </li><li> Hiçbir kirlenme olmadığından emin olmak için mikroskop altında 96-iyi kök hücre koloni plakasını inceleyin. </li><li> Bir eğimli, 37 ° C rampa yatakta 3 pozisyonunda 96 oyuklu kök hücre koloni plaka koyun. </li><li> RT 200 ul pipet ile yatak pozisyonunda 1 ucu yükleme rafa Yük kolonlar 8-12ipuçları. </li><li> Yatakta 2 pozisyonunda 4-iyi bir çukur yerleştirin. </li><li> Boş çukur kuyu 1 bırakın, kuyunun 2 8.5 ml SCGM + 10 uM Y27632 koymak kuyuya 3 3.5 ml 30% proteolitik ve kolajenolitik ayrışma ayıracı (veya EDTA bazlı ayrılma ayıracı) koymak, kuyunun 4 4.5 ml PBS koydu. Not: Bütün reaktifler oda sıcaklığında veya 37 ° C de olabilir. PBS ile seyreltildi% 30 RT proteolitik ve kolajenolitik ayrışma reaktifi adipoz kullanıldı ve fibroblast iPSC kültürü burada tarif edilen. </li><li> Yatak 5 konumundaki yeni bir önceden ısıtılmış 37 ° C hücre dışı matris jel kaplı 96 oyuklu plaka koyun. </li><li> 96 oyuklu kök hücre koloni plakası kapağı, hem de yeni bir 96 oyuklu plaka kapağı çıkarın ve PLHR onları hem yerleştirin. </li><li> Robotik kontrol touch pad kullanarak, düğmelerin aşağıdaki kombinasyonuna basın: <ol><li> &quot;Bir Protokol çalıştır&quot; düğmesine dokunun. </li><li> &quot;Koloni Bölünmüş 01:12 sütun 1&quot; seçin ve sonraki dokunun. </li><li> Kullanıcı kararı: dokunun &quot;test sürüşü&quot; kullanmak içinadım-adım sihirbaz seçilen programı önceden test etmek için. Not: robot çalışmaz ziyade yazılım yazılım sorunları için protokol sınar. &quot;Kur atlamak&quot; dokunarak kurulan protokolleri ile kabul edilebilir. </li><li> &quot;Run Protokolü&quot; düğmesine dokunun. </li></ol></li><li> Geçit protokolü bittikten sonra, her iki plakaları yeniden kapsamaktadır. </li><li> İsteğe bağlı: Gerekli bilgilerle yeni plaka etiketleyin (örneğin, tarih, hücre hattı, geçit sayısı, ortam türü, kullanıcı adı, vb). </li><li> 37 ° C, her iki plakaları Dönüş,% 5 CO2, aşağıdaki besleme ya da geçiş kadar nemlendirilmiş bir kuluçka cihazı gereklidir. Not: Bir sonraki beslenme 24 saat sonra tipik olarak. Not: Hücreler ve koloniler bölme 2-3 saat içinde plaka takmak ve çok yayılmış bakmak gerekir. Bu, Rho-kinaz inhibitörünün varlığı nedeniyle ve hücreleri (örneğin, parke taşı paketlendi koloniler wi karakteristik kök hücre morfolojisi yoğunlaştırmak ve sergileyecekİlk Rho-kinaz inhibitörü ücretsiz beslenme sonrası büyük çekirdek oranı küçük hücreli hacmi) th. </li></ol> Üretim 6. Hasat 96 gözlü levhalar Kök Hücreler Not: Hücre kolonileri kültürü sırasında herhangi bir noktada kullanım için hasat edilebilir Stem. Hücreler geçit hazır olduğunuzda Genellikle bu gerçekleşir (protokolü 5). Bu protokol, 96 oyuklu bir kök hücre koloni plaka on sütun hasat açıklamaktadır. <ol><li> Hiçbir kirlenme olmadığından emin olmak için mikroskop altında 96-iyi kök hücre koloni plakasını inceleyin. </li><li> Bir eğimli, 37 ° C rampa yatakta 3 pozisyonunda 96 oyuklu kök hücre koloni plaka koyun. </li><li> Yük sütunlar RT 200 ul pipet uçları ile yatak pozisyonunda 1 ucu yükleme raf 11 ve 12. </li><li> Yatakta 2 pozisyonunda 4-iyi bir çukur yerleştirin. </li><li> Bırakın yalak kuyu 1 boş, kuyunun 2 8.5 ml SCGM put 3.5 ml% 30 proteolitik ve kolajenolitik ayrışma reaktif (veya EDTA bazlı ayrılma reaktif) kuyuda3, kuyunun 4 4.5 ml PBS koydu. Not: Bütün reaktifler oda sıcaklığında veya 37 ° C de olabilir. </li><li> PLHR 96-de kök hücre koloni plaka kapağı ve yer çıkarın. </li><li> Robotik kontrol touch pad kullanarak, düğmelerin aşağıdaki kombinasyonuna basın: <ol><li> &quot;Bir Protokol çalıştır&quot; düğmesine dokunun. </li><li> &quot;Koloni Hasat Sütunları 2-12&quot; seçin ve sonraki dokunun. </li><li> Kullanıcı kararı: Seçilen program önceden test etmek için adım-adım sihirbazı kullanmak için &quot;deneme&quot; dokunun. Not: robot çalışmaz ziyade yazılım yazılım sorunları için protokol sınar. &quot;Kur atlamak&quot; dokunarak kurulan protokolleri ile kabul edilebilir. </li><li> &quot;Run Protokolü&quot; düğmesine dokunun. Not: toplama işlemi tamamlandıktan sonra, hücreler yalak kuyuya 2 olması ve toplama için hazır olacaktır. </li></ol></li></ol>

Yazarlar MKC, MJG, EEB, NJD ve RO ya da burada açıklanan robotik protokolleri tasavvur ve gelişmiş InvivoSciences geliştirme çalışanlarının, INC zamanında idi. TW InvivoSciences INC CSO olduğunu. SH Gilson INC bir çalışanıdır.

Bu çalışmada küçültüyor ve aynı zamanda verimli ölçek yukarı sağlarken bir 96-plaka biçiminde beslenme ve geçit otomatik iPSC üretimi için robotik kültürün bir yöntem geliştirdi. Bir sıvı kotarma robotu rutin enzimatik ayrılma düzenli aralıklarla iPSC koloniler ve geçiş onları beslemek için kullanılmıştır. Robot, aynı zamanda hücre dışı matris jel kaplanmış plakalar üretilmesi ve tohum yoğunluğu gradyanı gerçekleştirmek için programlanmıştır. Fibroblast ve adipoz türetilmiş iPSCs daha büyük 20 pasajlar, yaklaşık 3 ay boyunca bu sistemde kültürlendi zaman stabil karyotipleri gibi, pluripotense, muhafaza edilmiştir. Her iki hücre dizisi kardiyomiyositlerde farklılaşma sahip idi. Birlikte, burada açıklanan protokollerin koleksiyon kültür kök hücrelere çok az kök hücre kültürü deneyimi veya özel kültür ekipmanına sınırlı erişimi olan kullanıcılar sağlar ve yüksek hücre üretimini ya da çok az emek ve maliyetle taşıma çoklu çizgi elde. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; burada ayrıntılı robot protokoller iPSC üretim ve kullanım, ekonomik olarak üretim için bir yöntem sağlar. Bir avantajı burada ortaya kurulmuş bir plaka bazlı biçimde ölçeklenebilir kök hücre kültürü ve önceden 44,47 - 49 pluripotensini korumak için. Ölçeklenebilir kök hücre kültürü verimi pluripotent hücrelerin diğer formatlar 20,23,29 bu plaka bazlı yöntem adaptasyonu gibi süspansiyon kültür biçiminde esasen hiçbir değişiklik, kimyasal madde veya Rho-kinaz inhibitörü 20 uzun süreli kullanımı köpük önleyici kullanımını gerektirir iken. Kültür koşulları benzer çünkü bu plaka bazlı yöntem, bu nedenle hızlı bir şekilde ve tahmin edilebileceği gibi, yeni çizgiler ağırlayacak. Hastalık modelleme iPSCs kullanımı 4,6,19,50 arttıkça, yeni iPSC çizgileri sürekli olarak üretilir. biçimine üzerine geçiş bariyer l çünkü burada açıklanan teknikler yüksek hacimli ve verimlilik orta kültür yeni hatlar için en uygunah. Bu aynı zamanda sömürgeleri korumak için gerekli emek ve ekipman için de geçerlidir. Biçimi ve taşıma elde ve yönlendirilmiş farklılaşma iPSC hatları, kültür performansını doğrulamak için kullanılan ortam benzer çünkü Son olarak, tahmin edilebilir olması muhtemeldir. Şekil 8, 96 oyuklu plakalar içinde kök hücre üretiminin olarak üretim için bir strateji göstermektedir. Bir tabak (Döngü 0) robot 12 yeni tabaklar, 12 kat artış (1 Çevrim 0) tohum kullanılır. Beslenmenin birkaç gün sonra, oniki plakaları on iki tabak (Döngü 2 Döngü 1) başka bir dizi tohum geçişli olduğunu. Geriye kalan on plakalar diğer kullanımlar için şimdi mevcuttur ve sistemin üretim bileşenini temsil etmektedir. Bu gidişle, bir plaka geçişi 11 tabak her döngü veya 3-4 günde sağlayacaktır. Döngü 3&#39;te Döngü 3. Döngü 2 geçişte görüldüğü gibi birden fazla plakalar geçişli Bu yöntem daha ölçeklendirilebilir, iki tabak vardırHer zaman koloniyi korumak ve 24 yeni plakaları tohum kullanılır. Geri kalan 22 plakaları, her geçiş çevriminden sonra kullanım için daha sonra kullanılabilir. Bakım döngüsü içinde herhangi bir noktada kullanıcı üretimini artırmak için daha fazla tabak tohum yapabilirsiniz. Bir örnek geçişine iki büyüme döngüleri için her sütun olacaktır. birinci geçit on iki plakalara bir plaka dönüştürür, ve on iki plakalarının her biri 144 plakaları tohum için kullanılır. Bu durumda, bir kullanıcı, bir plaka ile başlar ve iki geçit veya kültür yaklaşık 1.5-2 hafta sonra, 144 plakaları yer alır. Örneğin, fibroblast ve adipoz iPSC hatları geçide 96 oyuklu plaka başına yaklaşık 25-75.000.000 hücre hazır olduğunda verim. 144 tabak nedenle yaklaşık 4-7 x 10 9 hücre temsil edebilir. Robotik 144, 96 gözlü levhalar taşıyan iş yükü nedir? Bu iş için amaçlarından biri hücre kültürü kök geleneksel (yani, 6 plaka) ile karşılaştırıldığında emek azaltılmış ölçeklenebilir kök hücre üretimi oldu. Robot accomplishes bu fiziksel beslenme ve Pasajlanması boyunca her plaka ele ihtiyacını azaltarak. Doğrusal bunun gibi 96-plaka üretim ölçekleri, geleneksel 6-kuyucuğu, bir teknisyen plakaları ile çalışan geçirdiği zaman robotik kültürü kullanarak önemli ölçüde daha az olduğu isterken. Robotik kültürünün üretim verimliliği bu fark (Şekil 9) elde edilir. Bu teknisyenler plaka yaklaşık 3.5 dakika, inkübatör 6 plaka çıkarmak mikroskop üzerinde kontrol, daha sonra aspire ve yem olabilir bulundu. Buna karşılık, teknisyenler yaklaşık 30 sn inkübatör 96 çukurlu bir plaka kaldırma ve robot üzerinde yerleştirmeden önce yoğunluğu ve kirlenme mikroskop üzerinde teftiş geçirirler. Yukarıda tarif edilene benzer genişletilmiş bir besleme protokolü ile, altı 96-yuvalı plakalar, yaklaşık 21 dakika ya da plaka başına 3.5 dakika sürer, yüklenip beslenebilir. Bir tabak beslemek için toplam geçen süre robot arasındaki karşılaştırılabilirTeknisyen robot için altı tabak (plaka başına 30 saniye muayene) işleme sadece 3 dakika harcıyor oysa ic ve manuel yöntemler, ancak elle beslemesine 6 tabak, bir teknisyen 21 dakika için gereklidir. Manuel 8 saat karşı ve robot bir hata plakaları kullanırken veya sıvı transferi yapmak asla Şekil 9 görüldüğü gibi, bir teknisyen robot kullanılarak 144 tabak taşıma geçirdiği zamanı yaklaşık 1.2 saattir. Burada açıklanan 96-kuyu iPSC kültür yöntemleri karmaşık tarama görevleri için uysal bir platform sağlamaktadır. Her bir göze, genetik olarak aynı ve aynı başlangıç ​​havuzu, aynı yoğunlukta ekildi olduğu için, değişken plaka boyunca dağıtılmış ve koşulları ayrılmasına ilişkin ticari olarak temin edilebilen rezervuarlı robot tarafından korunabilir. Bu gibi kök hücre büyüme ortamı gelişim 34,35,47, alt-tabaka ya da kültür durumu test ve kök hücreleri kullanılarak toksisite çalışmaları gibi deneyler için faydalı olacaktırHer kök hücre çizgisi optimum koloni büyüklüğü ve geçiş şartları açısından benzersiz olduğu için 51. Bir hasat sütunlar, geçişi sırasında mekanik ajitasyon ve besleme frekansı manipüle ederek ekim yoğunluğu, beslenme sıklığı ve geçit işleme modüle bu sistemi kullanabilirsiniz. Bu değişkenler yineleme kullanıcı hızlı bir şekilde yeni hat kültürü için uygun koşullar bir dizi bulmak ya da yeni kültür teknikleri geliştirmek için izin verecektir. Robotik sistem ayrıca 96 paralel ancak bağımsız kök hücre kolonileri korumak yeteneğine sahiptir. IPSC somatik hücrelerden köken veya genetik manipülasyon sonrasında klonlanmış zaman, birçok paralel klonlar potansiyel iPSC hatları elde etmek için taranır. Tek hücre 96 oyuklu plakalar içerisine ekilir sonra bu sistem besler ve her bir koloni tutma kanalı 96 oyuklu plakalar ayrılmış. Bu potansiyel klonları seçerken çok yüksek verim sağlayan ve fiziksel olarak 96 paralel çizgiler kültürleme zorluk ortadan kaldırır. Bu yöntem, aynı zamanda, birbu materyal paralel analiz için hazır böylece llows her klon üretimini büyütülüyor. Son olarak, biz ve tam otomatik kültürün sağlayan inkübatör plakaları sunan robotik plaka kaçakçılığı sistemi ile bu kültürü teknikleri entegre öngörülüyor. Bu, burada açıklanan temel protokoller diğer levha tabanlı sistemlere devredilemez beri büyük genişleme için izin daha karmaşık robotik ile gerçekleştirilebilir. protokollerde ele ilk kritik adımlar önlemek ve 1.5 ve 4.2 adımları gibi kirlenme kontrol olanlardır. Yukarıda ele alındığı gibi iyi steril bir teknik, genel anlamda kullanılmaktadır Eğer kirlilik, başarılı bir şekilde önlenebilir. Bu belirtilen adımlarda kirlenme ve bu protokolde bunu yapmak için operatör kontrol belirgin kirlenme riskini azaltacağını, ne olursa olsun kök hücre kültürü biçimi, zorunludur. Uygun hücre dışı matris jel uygulaması, ikinci bir ess olduğunuBu protokolün genel başarısı için ential adım. Düzgün 96-iyi plakaları kaplanması olmadan, kök hücreler büyüme olmaz. Bir ortak sorunu eksik kuyu kaplamadır. Deneyim hava kabarcıkları, elektrostatik çekim ve kılcal eylem tam kuyu kaplama engel olduğunu göstermiştir. Ön-ıslatma aşama (1.6) önemli ölçüde de alt kaplama arttırmak için geliştirilen ve atlanır olmamalıdır. Hücre dışı matris jel kaplama eşit şekilde iyi bir tabana ve kenarlara dağıtılmıştır uygulandığında bu ön ıslatma aşaması örneğin, plastik, 96 oyuklu plakanın belirgin hidrofobikliğini indirgemektedir. Ayrıca, bir kez yavaşça da hücre dışı matris jel çözeltisi dağılımını sağlamak için kaplanabilir temiz bir yandan karşı, 96 gözlü levhalar dokunun önerilir. ayrışma parametreleri de optimize etmek için önemlidir. Enzim veya EDTA göre ayrıştırma reaktifi ile genişletilmiş inkübasyon veya geçişi esnasında hedef olabilir de olmayabilir de tek hücreler ile sonuçlanacaktır. Bu nedenle operatörayrışma zamanı, öğütme gücü ve yıkama tekrarı koloni morfolojisi ve sağlığını etkileyebilecek ve buna göre ayarlamak nasıl özel dikkat etmelidir. Burada anlatılan teknikleri sınırlamaları anlamak başarılı çalışması için büyük önem taşımaktadır. Başka bir hücre kültürü ortamında olduğu gibi, 96 oyuklu plakaların kullanımı, nispeten yüksek bir kirlenme riski sunulur. Yukarıda tarif edildiği gibi, bir teknisyenin besleme ve pasajlama boyunca her plaka taşıma olduğu; Örneğin, kapağını açarken robot yatakta plaka koyarak ve mikroskop plaka kontrol ederken. Adım 1.5 sonra belirtildiği gibi, bu nedenle, bu tür yatakta eğimli ısıtma blok veya dikey pimleri gibi herhangi bir plaka kapağın içini dokunmayın veya herhangi bir potansiyel kontamine yüzeye bu bölümü maruz değil zorunludur. Protokol gelişimi sırasında bu sınırlama keşfetti ve sterilite korumak için plaka kapakları tutmak için bir raf geliştirmek için itici güç oldu. Aynı şekilde, oluk rezervuarlar, pipet uçları ve oçevreye açık ve teknisyen tarafından ele çünkü sıvı taşıma robotu yatakta ther malzemeleri kontaminasyon potansiyel kaynaklarıdır. Bu nedenle, iyi steril bir teknik, maruz kalan kültür malzemeler veya açık sıvılar içinde hareketlerini azaltır gibi uygulanmalıdır. Diğer bir kısıtlama protokolü görsel&gt; 100 96-gözlü plakalar, her kuyu kontrol, şekilde ölçeklendirilir hantal olmasıdır. Bu şüpheli kuyu tespit etmek, görsel gibi bulanık medya gibi kontaminasyon belirtileri için bütün plaka incelenerek ele alınabilir. Gelecekteki olarak üretim için, otomatik bir mikroskop ve hücre büyümesi ve potansiyel kirlenme göstergesinin kullanımı dahil edilecektir. Özetle, burada açıklanan yüksek verimli 96-gözlü tabanlı platform bir tabak biçiminde kök hücre kültürü ve üretimi için tekrarlanabilir, yüksek sadakat yöntem sunmaktadır. Bu yöntem, hücre kültürü süre kök adanmış gerekli deneyim, ekipman gerekli ve emek süresini azaltırGeleneksel yapışkan kültür avantajlarını muhafaza.

6 - İnsan uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) kullanımı bileşiği test rejeneratif tıp ve hastalık modelleme 2 2007 1 kendi türetme beri önemli ölçüde artmıştır. Bu talep, benzersiz bir miktarda somatik hücrelere ayırt edilebilir pluripotent hücreler, çok sayıda elde etmek için IPSC kapasitesi gelir. Yönlendirilmiş farklılaşma teknikleri 7 geliştirmek gibi - çok kaliteli iPSCs kitlesel üretim için gereksinimi yok, 14 - 10 ve insan hücre veya doku modelleme ve hücre tedavisinin geliştirilmesi 11 artar. 18 - Bu yaygın diğer hastalıklarda arasında, miyokard infarktüsü veya b-hücresi işlevsel değiştirme IPSC milyarlarca yüz milyonlarca gerektiren bedensel hücreleri 15 türetilmiş olacağı çağırılır. Ilaç keşfi ve t Dahası, giderek daha karmaşık 3D modelleme dokuherapy hücrelerin 9,13,19 çok sayıda talep edecek. Bu örneklerin tamamında, tanımlanan tek tip ve yeniden üretilebilir iPSCs mevcuttur ve üretilmesi kolay olması gerekir. Doku mühendisliği ve nakli için, hücre kaynaklı Biopharmaceutics ve kök hücreleri üretmek için, uygun maliyetli bir hücre üretim teknolojisi gereklidir. Bu teknikler, başarılı bir şekilde büyük ölçekli olmayan IPSC ökaryotik göre üretim için dağıtılan kısmen 28 - mikrotaşıyıcı alt tabakalar 26 kullanımı ile 25 veya süspansiyon - iPSCs ölçeklendirilmiş üretimi, süspansiyon kültüründe 20 odaklanmıştır. Çeşitli gruplar, pluripotent kök hücreleri 20,21,23,24,29 verim süspansiyon kültürü sistemleri göstermiştir. Ancak, bu yaklaşım, doku mühendisliği ve sürüş Laborat yapıyor, yeni farklılaşma programlarının geliştirilmesi araştırmacıların hazır değil pahalı ve karmaşık sistemleri kullananORY çaplı araştırma. Ayrıca, süspansiyon ve mikrotaşıyıcı iPSC kültürleri toplanmasını düzenleyen adaptasyon ve teknikleri ya da Rho-kinaz inhibitörü sürekli kullanımı gibi geleneksel yapışık iPSC kültüründe bulunmayan kimyasallar, köpük önleyici maddeler ve filtrasyon gerektirir. Hücrelere fiziksel stres mekanik ajitasyon yanı sıra mikrotaşıyıcı çarpışma sırasında tanıtıldı, süspansiyon kültüründe daha yaygındır. Bu sorunlar, hücre çizgileri süspansiyon içinde kültürlenebilir yeni kök üretilen hangi öngörülebilirlik ve hızını sınırlar. Diğerleri plaka kültürü teknikleri 30,31 taklit robotik plaka taşıma sistemlerini geliştirdik ama bu platformlar ekipman ve kök hücre kültürü ile ilişkili temel zorlukları yanında faaliyet uzmanlık için önemli yatırımlar talep ediyoruz. Aşağıdaki çalışma kendi kendine yeten, standart 8-kanal robot sıvıyı kullanan geliştirme ve ölçeklenebilir iPSC kültür sisteminin pratiğiişleyici 96 oyuklu plakalar. Bu yöntem laboratuar ölçekli iPSC kültürü ve yüksek hacimli iPSC üretimini köprü için tasarlanmıştır (örneğin, 10 7 - teknisyeni Haftada 1.5 x 10 9 hücre) yeni iPSC teknolojilerin geliştirilmesi olanlar sağlayan kolayca büyük donanım veya işçilik yatırımlar olmadan üretim büyütmek için. Bu yöntem, ayarlamak için nispeten pahalı olmayan bir kök hücre kültürü, bir programlama veya mühendislik deneyimi çok az gerektiren, özel bir hücre kültürü kaputu gerek kalmadan küçük bir ekipman alanına sahiptir, ve otomatik yüksek verimlilik orta sağlamak için standart hücre kültür teçhizatı kullanmaktadır Hücre üretimi. Amaç hücre kültürü kök yeni laboratuvarlar tarafından kullanılabilir ölçeklenebilir kök hücre kültürü yapabilen bir sistem geliştirmekti, manuel ekimi fikirlerini geliştirerek ya da kök hücrelerin çok sayıda üretmek için ekonomik bir vasıta isteyenler için bir engel bulanlar. Burada sunulan platform teknisyen etkisi kaldırırhücre kültürü kök ve tutarlı kök hücre üretimini sağlamak için besleme ve geçiş prosedürlerini normalleştirir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>96-well; Well volume: 360uL; Cell growth area: 0.32cm2; Individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Trough</td>
			<td>SeahorseBio</td>
			<td>201308-100</td>
			<td>Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167023</td>
			<td>10 racks gilson 96tips D200 tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12500062</td>
			<td>DMEM/F12 powder.&#160; Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factor Reduced Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Referred to as, &#34;extracellular matrix gel&#34; in the text.&#160; Matrigel GFR, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5857</td>
			<td>mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 Media</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>AdooQ BioScience</td>
			<td>A11001-50</td>
			<td>Rock inhinitor Y-27632 2HCI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>ACCUTASE</td>
			<td>Referred to as, &#34;proteolytic and collagenolytic dissociation reagent&#34; in the text.&#160; Accutase 500 mL sterile cell solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH30256FS</td>
			<td>PBS w/o CA MG 500 mL, 6/pk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson PIPETMAX</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>PIPETMAX</td>
			<td>http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable 96-well plate based ipsc culture and production using a robotic liquid handling system

Pluripotent kök hücre kültüründe Devam ilerleme rejeneratif tıp, ilaç keşfi ve güvenlik testleri, bu hücrelerin kullanımı için tezgah ve Yatağımın arasındaki uçurumu kapatıyor. Doku mühendisliği ve nakli için, hücre kaynaklı Biopharmaceutics ve kök hücreleri üretmek için, uygun maliyetli bir hücre üretim teknolojisi gereklidir. Pluripotensin ve zamanla downstream uygulamalar (örneğin, hücre farklılaşması) hücrelerin istikrarlı performans Bakım büyük ölçekli hücresi üretimi için her şeyden önemlidir. Oysa o operatörün ciddi değişkenlik tanıtmak yanı sıra ölçek-up pahalı olabilir nerede hücrelerin elle kültüre, özellikle elde etmek zor olabilir. Minimal teknisyen katılımını veya deneyim gerektiren sıvı robot taşıma geliştirilen çok kanallı bir tezgah üstü kullanılarak operatör etkisi roman kök hücre kültürü protokolleri yüksek verimlilik, büyük ölçekli kök hücre üretimini etkinleştirmek ve kaldırmak için. IleBu protokoller, insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) doğrudan donmuş stoktan besleyici içermeyen koşullar kültürlendi ve 96 oyuklu plakalar içinde muhafaza. Ne zaman geçişine hücre hattı ve istenen ölçek büyütme oranına bağlı olarak, operatörün kolayca bölme için optimal koloni yoğunlukları gösteren görüntülerin bir dizi dayalı belirleyebilirsiniz. Sonra gerekli reaktifler, bir santrifüj aşaması olmadan yeni plakalara bir koloni bölünmüş gerçekleştirmek için hazırız. 20 pasajlar (~ 3 ay) sonra, iki iPSC hatları, kararlı karyotip tutulan kök hücre belirteçleri ifade ve yüksek verimlilik ile kardiyomiyositlere ayrışmıştır. Sistem 96 oyuklu plakalar için tasarlanmış yeni bir farklılaşma protokolleri veya genetik manipülasyon daha sonra, yüksek veri akışı taramasını gerçekleştirmek olabilir. Bu teknoloji uygulamaları sayısız için aynı kök hücrelerin çok sayıda üretmek için emek ve teknik yükünü azaltacaktır.

Watch this Scientific Journal Video about Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System at JoVE.com

Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes.

Bir Robotik Sıvı İşleme Sisteminin Kullanılması Ölçeklenebilir 96-iyi iPSC Kültür Bazlı Plaka ve Üretim

Continued advancement in pluripotent stem cell culture is closing the gap between bench and bedside for using these cells in regenerative medicine, drug ...

scalable-96-well-plate-based-ipsc-culture-production-using-robotic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

31.5K Görüntüleme.  InvivoSciences, Inc.. The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes. 

Video: Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Bir Koaksiyel Memesini kullanma Pluripotent Kök Hücre Aljinat Encapsulation

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Gelişim Biyolojisi

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that adheres to form the midline epithelial seam (MES). The theories suggest that MES cells follow an epithelial to mesenchymal transition (EMT), apoptosis and migration, making a fused palate 1. Complete disintegration of the MES is the final essential phase of palatal confluence with surrounding mesenchymal cells. We provide a method for palate organ culture. The developed in vitro protocol allows the study of the biological and molecular processes during fusion. The applications of this technique are numerous, including evaluating responses to exogenous chemical agents, effects of regulatory and growth factors and specific proteins. Palatal organ culture has a number of advantages including manipulation at different stages of development that is not possible using in vivo studies.

Studies of palate development are motivated by the incidence of cleft palate, a birth defect that imposes a tremendous health burden and can leave lasting disfigurement. We demonstrate here a technique to culture palatal shelves that can be used to study different signaling pathways involved in palatal development and fusion.

Statik Organ Kültürü kullanarak Palatal Fusion incelenmesi yöntemi

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Photoconvertible PSmOrange Sistemi kullanılarak GFP transgenik zebrafish hücreleri izleme

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Oldukça Tekrarlanabilir Küçük Molekül Tabanlı Farklılaşma Protokolü kullanarak insan pluripotent kök hücreleri gelen kardiyomiyositlerde Büyük Ölçekli Üretim

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

Bir Transpozon Sistemi Kullanılarak Fare Amniyotik Sıvı Hücreleri pluripotent kök hücrelerin üretimi

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

96 oyuklu bir plaka içerisinde hücre gücü / yara iyileşme gerçekleştirmek için bir cihaz

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) is particularly attractive for neurodegenerative disease studies, including retinal dystrophies, where iPSC-derived retinal cell models mark a major step forward to understand and fight blindness. In this paper, we describe a simple and scalable protocol to generate, mature, and cryopreserve retinal organoids. Based on medium changing, the main advantage of this method is to avoid multiple and time-consuming steps commonly required in a guided differentiation of iPSCs. Mimicking the early phases of retinal development by successive changes of defined media on adherent human iPSC cultures, this protocol allows the simultaneous generation of self-forming neuroretinal structures and retinal pigmented epithelial (RPE) cells in a reproducible and efficient manner in 4 weeks. These structures containing retinal progenitor cells (RPCs) can be easily isolated for further maturation in a floating culture condition enabling the differentiation of RPCs into the seven retinal cell types present in the adult human retina. Additionally, we describe quick methods for the cryopreservation of retinal organoids and RPE cells for long-term storage. Combined together, the methods described here will be useful to produce and bank human iPSC-derived retinal cells or tissues for both basic and clinical research.

The production of specialized retinal cells from pluripotent stem cells is a turning point in the development of stem cell-based therapy for retinal diseases. The present paper describes a simple method for an efficient generation of retinal organoids and retinal pigmented epithelium for basic, translational, and clinical research.

Tanımlanmış Xeno-alerjik ve besleyici-Alerjik kültür koşulları üretimi insan IPSC kaynaklı Retina hücre modelleri için

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart disease. When using prosthetic materials however, these grafts are susceptible to bacterial infections and various host responses.
Identification of bacterial and host factors that play a vital role in endovascular adherence of microorganisms is of importance to better understand the pathophysiology of the onset of infections such as infective endocarditis (IE) and to develop preventive strategies. Therefore, the development of competent models to investigate bacterial adhesion under physiological shear conditions is necessary. Here, we describe the use of a newly designed in vitro perfusion chamber based on parallel plates that allows the study of bacterial adherence to different components of graft tissues such as exposed extracellular matrix, endothelial cells and inert areas. This method combined with colony-forming unit (CFU) counting is adequate to evaluate the propensity of graft materials towards bacterial adhesion under flow. Further on, the flow chamber system might be used to investigate the role of blood components in bacterial adhesion under shear conditions. We demonstrated that the source of tissue, their surface morphology and bacterial species specificity are not the major determining factors in bacterial adherence to graft tissues by using our in-house designed in vitro perfusion model.

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

We describe an in-house designed in vitro flow chamber model, which allows the investigation of bacterial adherence to graft tissues.

Vitro modeli doku grefti bakteriyel bağlılık çalışmaya paralel-plaka perfüzyon sistemi

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

Endotel Kolonisi Oluşturan Hücreler ve Mezenkimal Kök Hücreler tarafından Oluşturulan Eş Kültür Sfaoidler Kullanılarak Üç Boyutlu Anjiyogenez Tsay Sistemi

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the blood that can disrupt delicate brain function. As such, the BBB is a major obstacle to the delivery of therapeutics to the CNS. Accumulating evidence suggests that the BBB plays a key role in the onset and progression of neurological diseases. Thus, there is a tremendous need for a BBB model that can predict penetration of CNS-targeted drugs as well as elucidate the BBB&#39;s role in health and disease.
We have recently combined organ-on-chip and induced pluripotent stem cell (iPSC) technologies to generate a BBB chip fully personalized to humans. This novel platform displays cellular, molecular, and physiological properties that are suitable for the prediction of drug and molecule transport across the human BBB. Furthermore, using patient-specific BBB chips, we have generated models of neurological disease and demonstrated the potential for personalized predictive medicine applications. Provided here is a detailed protocol demonstrating how to generate iPSC-derived BBB chips, beginning with differentiation of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells (iBMECs) and resulting in mixed neural cultures containing neural progenitors, differentiated neurons, and astrocytes. Also described is a procedure for seeding cells into the organ chip and culturing of the BBB chips under controlled laminar flow. Lastly, detailed descriptions of BBB chip analyses are provided, including paracellular permeability assays for assessing drug and molecule permeability as well as immunocytochemical methods for determining the composition of cell types within the chip.

The blood-brain barrier (BBB) is a multicellular neurovascular unit tightly regulating brain homeostasis. By combining human iPSCs and organ-on-chip technologies, we have generated a personalized BBB chip, suitable for disease modeling and CNS drug penetrability predictions. A detailed protocol is described for the generation and operation of the BBB chip.

İnsan iPSC Tabanlı Kan-Beyin Bariyer Chip Üretimi

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...