Diese Arbeit wurde teilweise wurde durch NIH Zuschüsse, R44 und R01 HL109505 GM087784 unterstützt. Autoren danken der technischen und OEM-Team von Gilson, INC für erweiterte technische Unterstützung.

Die Autoren MKC, MJG, EEB, NJD und RO sind oder waren zum Zeitpunkt der Entwicklung Mitarbeiter InvivoSciences, INC, die die hier beschriebenen Roboter-Protokolle konzipiert und entwickelt. TW ist der CSO für InvivoSciences INC. SH ist Mitarbeiter von Gilson INC.

In der vorliegenden Studie ein Verfahren zur Roboterkultur für iPSC Produktion, die miniaturisiert und automatisiert die Fütterung und Durchgang in eine 96-Well-Plattenformat und gleichzeitig eine effiziente Scale-up haben wir. Ein Flüssigkeitshandhabungsroboter wurde verwendet, um routinemäßig zu füttern iPSC Kolonien und Gang sie in regelmäßigen Abständen durch enzymatische Spaltung. Der Roboter wurde so programmiert, dass der extrazellulären Matrix-Gel-beschichteten Platten produzieren und führen Sie eine Aussaat Dichtegradienten. Wenn Fibroblasten und Fettgewebe abgeleiteten iPSCs wurden in diesem System für mehr als 20 Passagen, etwa 3 Monate lang kultiviert wurde Pluripotenz aufrechterhalten, wie auch stabilen Karyotyp. Beide Zelllinien wurden in der Lage Differenzierung zu Kardiomyozyten. Zusammen, die Sammlung von Protokollen hier beschriebenen können Anwender mit sehr wenig Stammzellkultur Erfahrung oder nur begrenzten Zugang zu spezialisierten Kulturanlagen, die Kultur Stammzellen und eine hohe Zellproduktion oder mehreren Leitungen Umgang mit minimaler Arbeit und Kosten. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Die Roboter-Protokolle hier detailliert ein Verfahren zum wirtschaftlichen Maßstab aus iPSC Herstellung und Handhabung. Ein Vorteil ist, skalierbaren Stammzellkultur in einem etablierten Platten basiertes Format hier gezeigt und zuvor 44,47 - 49, um Pluripotenz aufrechterhalten. Während andere Formate von skalierbaren Stammzellkultur Ausbeute pluripotenten Zellen 20,23,29 diese Platte basierte Methode erfordert im wesentlichen keine Veränderung der Kultur-Format, wie die Anpassung an Suspension, die Verwendung von Antischaum Chemikalien oder längerer Verwendung von Rho-Kinase-Inhibitor 20. Diese Platte basierend Verfahren kann daher schnell und vorherzusehen war, unterzubringen neuen Linien, weil die Kulturbedingungen sind ähnlich. Da der Einsatz von iPS für Krankheit Modellierung erhöht 4,6,19,50 werden neue iPSC Linien kontinuierlich erzeugt. Die hier beschriebenen Techniken sind am besten geeignet zur Kultur neue Zeilen in mittleren bis hohen Volumen und den Durchsatz, da die Schranke auf dem Format Übergang low. Dies gilt auch für die Arbeit und Ausrüstung notwendig, um die Kolonien zu erhalten. Schließlich, da das Format und Handhabung ähnlich der zur Ableitung und Validierung iPSC Leitungen Kultur Leistung, wie eine gerichtete Differenzierung Umwelt sind, ist wahrscheinlich mehr vorhersagbar. Figur 8 veranschaulicht eine Strategie zur Maßstabsvergrößerung der Herstellung von Stammzellen in 96-Well-Platten. Eine Platte (Zyklus 0) wird verwendet, um Roboter Saatgut 12 neue Platten, eine 12-fache Erhöhung (Zyklus 0-1). Nach einigen Tagen der Fütterung, eine der zwölf Platten agiert, um einen weiteren Satz von zwölf Platten (Zyklus 1 Zyklus 2) Samen. Die verbleibenden elf Platten sind nun für andere Verwendungen verfügbar sind und für die Herstellung Komponente des Systems. Bei diesem Tempo wird Gang von einer Platte bieten 11 Platten pro Zyklus oder alle 3-4 Tage. Diese Methodik kann mehr skaliert, wenn mehrere Platten werden passagiert, wie in dem Übergang von Zyklus 2 Zyklus 3 gezeigten Zyklus 3 ist, sind zwei Plattenimmer dann verwendet, um die Kolonie zu erhalten und Saatgut 24 neue Platten. Die verbleibenden 22 Platten werden dann zur Verwendung nach jedem Durchgang Zyklus zur Verfügung. An irgendeiner Stelle in der Wartungszyklus kann der Benutzer mehrere Platten zur Steigerung der Produktion Samen. Ein Beispiel wäre, um Durchgang jede Spalte für zwei Wachstumsperioden betragen. Der erste Durchgang wandelt einen Platte in zwölf Platten und jeder der zwölf Platten verwendet wird, um Platten 144 Samen. In diesem Fall beginnt ein Benutzer mit einer Platte und nach zwei Durchgängen oder etwa 1,5-2 Wochen Kultur mit 144 Platten. Beispielsweise ergeben die Fibroblasten und Fett iPSC Linien etwa 25 bis 75.000.000 Zellen pro Platte mit 96 Vertiefungen, wenn bereit, Durchgang. 144 Platten könnte daher repräsentieren etwa 4-7 x 10 9 Zellen. Was ist der Arbeitsaufwand für die 144 Platten mit 96 Vertiefungen Roboter trägt? Eines der Ziele für diese Arbeit war skalierbaren Stammzellproduktion, die Arbeit reduziert im Vergleich zu herkömmlichen (dh 6-Well-Platte) Stammzellkultur. Der Roboter accomplishes dies durch die Linderung der Notwendigkeit, jede Platte physisch hand während Fütterung und Passagieren. Während 96-Well-Platte Produktion Skalen linear, wie es wäre in der traditionellen 6-Well-Platten, ist die Zeit, ein Techniker verbringt die Arbeit mit den Platten deutlich weniger mit Roboter-Kultur. Die Produktionseffizienz von Roboterkultur aus dieser Differenz (Figur 9) abgeleitet wird. Es wurde festgestellt Techniker konnten eine 6-Well-Platte aus dem Inkubator der Platte in etwa 3,5 Minuten zu entfernen, überprüfen Sie es auf dem Mikroskop, dann absaugen und zu füttern. Demgegenüber verbringen Techniker etwa 30 sec eine 96-Well-Platte aus dem Inkubator entfernt und deren Prüfung unter dem Mikroskop auf Dichte und Verunreinigungen vor der Platzierung auf den Roboter. Mit einem erweiterten Fütterungsprotokoll ähnlich dem oben beschriebenen können sechs Platten mit 96 Vertiefungen geladen und zugeführt werden, was in etwa 21 min, bzw. 3,5 min pro Platte erfolgt. Die Gesamtzeit, um eine Platte zu ernähren ist vergleichbar zwischen Roboteric und manuellen Methoden, sondern auf Handanlage 6 Platten ein Techniker wird für alle 21 min benötigt, während die Techniker nur 3 min Umgang mit den sechs Platten für den Roboter (30 sec Inspektion pro Platte) verbringt. Wie Abbildung 9 zeigt, ist die Zeit ein Techniker verbringt Handhabung 144 Platten mit dem Roboter ist etwa 1,2 Stunden, im Gegensatz zu 8 Stunden von Hand und der Roboter werden nie einen Fehler machen, die Handhabung der Platten oder Überleiten von Flüssigkeiten. Die hier beschriebenen 96-well iPSC Kulturmethoden eine tractable Plattform für komplexe Screening-Aufgaben. Weil jede Vertiefung genetisch identisch und mit der gleichen Dichte aus der gleichen Ausgangspool ausgesät können Variablen über die Platte verteilt sind und durch den Roboter mit handelsüblichen Behältern, um Bedingungen zu trennen aufrechterhalten werden. Dies wäre nützlich für Experimente wie Stammzellenwachstumsmedien Entwicklung 34,35,47, Substrat oder Kulturbedingung Prüfung und Toxizitätsstudien unter Verwendung von Stammzellen51. Da jede Stammzelllinie ist in Bezug auf die optimale Koloniegröße und Durchgang Anforderungen einzigartig, kann man dieses System nutzen, um Aussaatdichte, Fütterung Frequenzgang und Handhabung durch die Manipulation der Spalten geerntet, die mechanische Bewegung während des Durchgangs und die Fütterung Frequenz zu modulieren. Durchlaufen dieser Variablen ermöglicht es dem Benutzer, eine Reihe von Bedingungen, die zur Kultur einer neuen Linie schnell zu finden oder neue Kulturtechniken. Das Robotersystem ist auch in der Lage ist die Aufrechterhaltung 96 parallel aber unabhängig Stammzellenkolonien. Wenn iPSC aus somatischen Zellen abgeleitet oder nach genetischer Manipulation kloniert werden viele parallel Klone gescreent, um potenzielle iPSC Linien ergeben. Sobald einzelne Zellen werden in 96-Well-Platten ausgesät, kann dieses System zu füttern und Durchgang der 96-Well-Platten halten jede Kolonie getrennt. Dies ermöglicht einen sehr hohen Durchsatz bei der Auswahl der potentiellen Klonen und beseitigt die Schwierigkeiten bei der Kultivierung von 96 körperlich parallelen Linien. Diese Methode auch einellows Produktion jedes Klons so skaliert, dass Material für die parallele Analyse ohne weiteres verfügbar ist. Schließlich stellen wir uns Integration dieser Kulturtechniken mit einer Roboter-Plattensystem, das Handels Platten zu und von den Inkubator ermöglicht vollautomatische Kultur liefert. Dies könnte mit komplexeren Robotik, die für eine größere Ausdehnung zu ermöglichen, da die hier beschriebenen grundlegenden Protokolle sind auf andere Platte basierte Systeme übertragbar erreicht werden. Die ersten wichtigen Schritte, die in den Protokollen zu adressieren sind diejenigen, die verhindern, und überprüfen Sie die Verunreinigungen wie die Schritte 1.5 und 4.2. Verunreinigungen, wie oben erörtert, kann erfolgreich vermieden werden, wenn gute steriler Technik und gesundem Menschenverstand eingesetzt werden wird. Es ist zwingend notwendig, unabhängig von Stammzellkultur-Format, dass der Betreiber-Check für Kontamination und damit in diesem Protokoll an den angegebenen Schritte wird deutlich das Risiko für die Kontamination zu verringern. Proper extrazellulären Matrix-Gel-Anwendung ist eine zweite esszielle Schritt zum Erfolg dieses Protokolls. Ohne den 96-Well-Platten richtig Beschichten werden die Stammzellen nicht wachsen. Ein häufiges Problem ist unvollständig und Beschichtung. Die Erfahrung hat gezeigt, dass Luftblasen, elektrostatische Anziehung und Kapillarwirkung behindern auch komplette Beschichtung. Das Vornässen Schritt (1,6) entwickelt, um auch Seitenbeschichtung deutlich verbessern und sollte nicht übersprungen werden. Diese Vorbenetzung Schritt erscheint, um die scheinbare Hydrophobie des Kunststoff 96-Well-Platte, so daß zu reduzieren, wenn die extrazelluläre Matrix-Gel-Beschichtung aufgebracht wird gleichmäßig über den Boden und die Seiten gut verteilt. Es wird auch empfohlen, um leicht auf die 96-Lochplatten gegen eine saubere Hand einmal beschichtet, um auch extrazelluläre Matrix-Gel-Lösung Verteilung zu gewährleisten. Die Dissoziation Parameter sind auch wichtig, um zu optimieren. Erweiterte Inkubation mit Enzym oder EDTA basiert Dissoziation Reagenz wird in einzelnen Zellen, die möglicherweise nicht das Ziel während des Durchgangs werden die Folge sein. Daher der Betreibersollte besonderes Augenmerk auf wie Dissoziation Zeit, Verreiben Kraft und Wasch Wiederholungen beeinflussen Koloniemorphologie und Gesundheit und passen zu zahlen. Das Verständnis der Beschränkungen in Bezug auf den hier beschriebenen Techniken sind ausschlaggebend für die erfolgreiche Operation. Wie in irgendeinem anderen Zellkultur-Einstellung, die Verwendung von 96-Well-Platten zeigt eine relativ hohe Kontaminationsgefahr. Wie oben beschrieben, ist ein Techniker Handhabungs jede Platte während der Zuführung und die Passage; beispielsweise beim Öffnen des Deckels, indem die Platte auf dem Roboter-Bett, und Prüfen der Platte auf dem Mikroskop. Daher ist, wie nach dem Schritt 1.5 erwähnt, ist es unerlässlich, die Innenseite jeder Platte Deckel nicht zu berühren oder aussetzen, diesen Teil zu einer potenziell kontaminierten Fläche wie die geneigte Heizblöcke oder vertikale Stifte auf dem Bett. Während der Protokollentwicklung wurde diese Einschränkung entdeckt und war der Anstoß, um eine Zahnstange, um Platte Deckel zu halten, um die Sterilität zu erhalten entwickeln. Ebenso sind die Trog Stauseen, Pipettenspitzen und other Lieferungen auf der Liquid-Handling-Roboter Bett sind potentielle Kontaminationsquellen, da sie offen für Umwelt und durch den Techniker behandelt sind. Daher sollten gute sterile Technik, die als Reduktionsbewegungen über ausgesetzt Kultur Materialien oder Flüssigkeiten offen angelegt, so werden. Eine weitere Einschränkung ist, dass, wenn das Protokoll skaliert, visuelles Prüfen jedes gut&gt; 100 96-Well-Platten ist umständlich. Dies kann mit durch Sichtkontrolle die ganze Platte auf Anzeichen von Kontamination, wie trüben Medien behandelt werden, um verdächtige Brunnen zu identifizieren. Für zukünftige Maßstab up wird die Verwendung eines automatisierten Mikroskop und Indikator für Zellwachstum und mögliche Verunreinigungen eingebracht werden. Zusammenfassend ist die hier beschriebene Hochdurchsatz-96-Well-basierte Plattform bietet eine reproduzierbare, hohe Wiedergabetreue Verfahren zur Stammzellkultur und Produktion in einem Plattenformat. Dieses Verfahren reduziert die erforderliche Erfahrung, Ausrüstung notwendig und Arbeitszeit gewidmet Stammzellkultur, währenddie Aufrechterhaltung der Vorteile der traditionellen adhärenten Kultur.

6 - Die Verwendung von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) hat sich seit ihrer Ableitung im Jahr 2007 für 1 Verbindung Test, der regenerativen Medizin und Krankheit Modellierung 2 erhöht. Dieser Forderung kommt von iPSC die Fähigkeit, eine große Zahl von pluripotenten Zellen, die in somatische Zellen bei einer beispiellosen Quantität differenziert werden kann ergeben. Wie verwiesen Differenzierung Techniken zu verbessern 7-10 und Entwicklung der menschlichen Zell- oder Gewebemodellierung und Zelltherapie erhöht 11-14, nimmt auch die Voraussetzung für die Massenproduktion von hochwertigen iPSCs. Es ist weithin zitiert, dass unter anderen Krankheiten, Herzinfarkt oder B-Zell-Funktions Ersatz wird hunderte Millionen erforderlich, um Milliarden von iPSC abgeleiteten somatischen Zellen 15-18. Außerdem immer komplexer 3D-Gewebemodelle für Wirkstoffforschung und therapy wird eine große Zahl von Zellen 9,13,19 verlangen. In all diesen Beispielen, definierte, gleichmäßige und reproduzierbare iPSCs müssen verfügbar sein und einfach herzustellen sein. Zur Herstellung der Stammzell abgeleitet Biopharmazie und Zellen für Tissue Engineering und der Transplantation ist eine kostengünstige Zellfertigungstechnik unerlässlich. 25 oder Suspension mit dem Einsatz von Mikroträgersubstrate 26 - - 28 zum Teil, weil diese Techniken erfolgreich für große, nicht-iPSC, eukaryotischen basierte Produktion eingesetzt skaliert Herstellung von iPS-Zellen wurde auf Suspensionskultur 20 konzentriert. Mehrere Gruppen haben Suspensionskultur-Systeme, die pluripotenten Stammzellen 20,21,23,24,29 ergeben demonstriert. Allerdings sind diese Ansätze verwenden teure und komplexe Systeme nicht ohne weiteres verfügbar, um Forschern die Entwicklung neuer Differenzierungsprogramme, Fahr Tissue Engineering und tut laboratory Skala Forschung. Außerdem Federung und Mikro iPSC Kulturen erfordern Anpassung und Techniken oder Chemikalien nicht in traditionellen haft iPSC Kultur gefunden, wie kontinuierliche Verwendung von Rho-Kinase-Inhibitor, Antischaummittel und Filtration, um die Aggregation zu regulieren. Körperliche Belastung für die Zellen häufiger in Suspensionskultur, durch mechanische Bewegung als auch bei Mikro Zusammenstoß eingeleitet. Diese Probleme begrenzen die Berechenbarkeit und Geschwindigkeit, mit der neu generierten Stammzelllinien können in Suspension kultiviert werden. Andere haben Roboter-Plattenhandling-Systeme, die Platte Kultur Techniken 30,31 nachahmen entwickelt, aber diese Plattformen verlangen erhebliche Investitionen für Ausrüstung und Know-how, um zusätzlich zu den grundlegenden Herausforderungen mit Stammzellkultur assoziiert zu betreiben. Die folgende Arbeit beschreibt die Entwicklung und Praxis einer skalierbaren iPSC Kultursystem, das eine in sich geschlossene, Standard-8-Kanal-Roboter-Flüssigkeit verwendetHandler und 96-Well-Platten. Diese Methode wurde entwickelt, um Labormaßstab iPSC Kultur und High-Volume-Produktion iPSC brücken (zB 10 7 bis 1,5 x 10 9 Zellen pro Woche pro Techniker) es denjenigen die Entwicklung neuer Technologien, um iPSC leicht skalieren Produktion ohne große Hardware oder Arbeits Investitionen. Diese Methode ist relativ kostengünstig einzurichten, erfordert wenig bis gar keine Stammzellkultur, Programmierung oder Engineering-Erfahrung, hat eine kleine Stellfläche Ausrüstung, ohne die Notwendigkeit für einen dedizierten Zellkultur Kapuze und nutzt Standard-Zellkulturanlagen zu mittleren bis hohen Durchsatz ermöglichen automatisierte Zellproduktion. Ziel war es, ein System, das skalierbare Stammzellkultur, die von Labors neue Zellkultur Stammzellen verwendet werden können zu entwickeln, die, die manuelle Pflege ein Hindernis für die Entwicklung ihrer Ideen oder diejenigen, die eine wirtschaftliche Möglichkeit, eine große Anzahl von Stammzellen zu produzieren finden. Die hier vorgestellte Plattform entfernt Techniker Einfluss aufStammzellkultur und normalisiert die Fütterung und Passage, um die kontinuierlich Stammzellproduktion zu ermöglichen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>96-well; Well volume: 360uL; Cell growth area: 0.32cm2; Individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Trough</td>
			<td>SeahorseBio</td>
			<td>201308-100</td>
			<td>Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167023</td>
			<td>10 racks gilson 96tips D200 tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12500062</td>
			<td>DMEM/F12 powder.&#160; Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factor Reduced Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Referred to as, &#34;extracellular matrix gel&#34; in the text.&#160; Matrigel GFR, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5857</td>
			<td>mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 Media</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>AdooQ BioScience</td>
			<td>A11001-50</td>
			<td>Rock inhinitor Y-27632 2HCI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>ACCUTASE</td>
			<td>Referred to as, &#34;proteolytic and collagenolytic dissociation reagent&#34; in the text.&#160; Accutase 500 mL sterile cell solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH30256FS</td>
			<td>PBS w/o CA MG 500 mL, 6/pk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson PIPETMAX</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>PIPETMAX</td>
			<td>http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable 96-well plate based ipsc culture and production using a robotic liquid handling system

Kontinuierliche Weiterentwicklung in pluripotente Stammzellkultur ist, die Lücke zwischen Labor und Krankenbett für die Verwendung dieser Zellen in der regenerativen Medizin, Arzneimittelforschung und Sicherheitsprüfung. Zur Herstellung der Stammzell abgeleitet Biopharmazie und Zellen für Tissue Engineering und der Transplantation ist eine kostengünstige Zellfertigungstechnik unerlässlich. Aufrechterhaltung der Pluripotenz und stabile Leistung von Zellen in Downstream-Anwendungen (beispielsweise Zelldifferenzierung) über die Zeit ist von größter Bedeutung, um im großen Maßstab Zellproduktion. Noch so schwer sein kann, zu erreichen insbesondere wenn Zellen kultiviert werden manuell in dem der Betreiber kann erhebliche Variabilität einführen sowie prohibitiv teuer Maßstab übertragbar ist. Hochdurchsatz, groß angelegte Stammzellproduktion zu ermöglichen und zu entfernen Bedienereinfluss neuartigen Stammzellkultur-Protokolle mit einem Tischmultikanal Flüssigkeitshandhabungsroboter entwickelt wurden, die eine minimale Beteiligung Techniker oder Erfahrung erfordern. MitDiese Protokolle menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) wurden in Feeder-freien Bedingungen kultiviert direkt von einem gefrorenen Lager und in 96-Well-Platten gehalten. Abhängig von der Zelllinie und gewünschten Maßstab Aufnahmegeschwindigkeit, kann der Bediener leicht bestimmen, wann die Passage auf der Basis einer Reihe von Bildern, die optimalen Kolonie Dichten zur Aufspaltung. Dann werden die notwendigen Reagenzien sind bereit, eine Kolonie Split auf neue Platten ohne einen Zentrifugationsschritt durchzuführen. Nach 20 Durchgängen (ca. 3 Monate) aufrechterhalten zwei iPSC Linien stabil Karyotypen, ausgedrückt Stammzellmarkern und differenziert zu Kardiomyozyten mit hohem Wirkungsgrad. Das System kann anschließende Hochdurchsatz-Screening neuer Differenzierungsprotokollen oder genetische Manipulation für 96-Well-Platten entwickelt auszuführen. Diese Technologie wird den Arbeitsaufwand zu verringern und technische, eine große Anzahl von identischen Stammzellen für eine Vielzahl von Anwendungen.

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Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes.

Scalable Platte mit 96 Vertiefungen Basierend iPSC Kultur und Produktion Mit einem Robotic Flüssigkeitshandhabungssystem

Continued advancement in pluripotent stem cell culture is closing the gap between bench and bedside for using these cells in regenerative medicine, drug ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

31.5K Aufrufe.  InvivoSciences, Inc.. The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes. 

Serie: Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Alginat Encapsulation pluripotenter Stammzellen Mit einer Co-Axial Düsen

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that adheres to form the midline epithelial seam (MES). The theories suggest that MES cells follow an epithelial to mesenchymal transition (EMT), apoptosis and migration, making a fused palate 1. Complete disintegration of the MES is the final essential phase of palatal confluence with surrounding mesenchymal cells. We provide a method for palate organ culture. The developed in vitro protocol allows the study of the biological and molecular processes during fusion. The applications of this technique are numerous, including evaluating responses to exogenous chemical agents, effects of regulatory and growth factors and specific proteins. Palatal organ culture has a number of advantages including manipulation at different stages of development that is not possible using in vivo studies.

Studies of palate development are motivated by the incidence of cleft palate, a birth defect that imposes a tremendous health burden and can leave lasting disfigurement. We demonstrate here a technique to culture palatal shelves that can be used to study different signaling pathways involved in palatal development and fusion.

Methode der Untersuchung Palatal Fusion mit statischen Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Tracking-Zellen in GFP-transgenen Zebrafisch Mit dem Photokonvertierbare PSmOrange-System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Die Großproduktion von Kardiomyozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen hochreproduzierbarer Kleinmolekül-basierte Differenzierung Protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

Die Herstellung von pluripotenten Stammzellen aus Maus Fruchtwasserzellen ein Transposon-System verwenden

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

Eine Vorrichtung zur Durchführung Zellmigration / Wundheilung in einer 96-Well-Platte

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) is particularly attractive for neurodegenerative disease studies, including retinal dystrophies, where iPSC-derived retinal cell models mark a major step forward to understand and fight blindness. In this paper, we describe a simple and scalable protocol to generate, mature, and cryopreserve retinal organoids. Based on medium changing, the main advantage of this method is to avoid multiple and time-consuming steps commonly required in a guided differentiation of iPSCs. Mimicking the early phases of retinal development by successive changes of defined media on adherent human iPSC cultures, this protocol allows the simultaneous generation of self-forming neuroretinal structures and retinal pigmented epithelial (RPE) cells in a reproducible and efficient manner in 4 weeks. These structures containing retinal progenitor cells (RPCs) can be easily isolated for further maturation in a floating culture condition enabling the differentiation of RPCs into the seven retinal cell types present in the adult human retina. Additionally, we describe quick methods for the cryopreservation of retinal organoids and RPE cells for long-term storage. Combined together, the methods described here will be useful to produce and bank human iPSC-derived retinal cells or tissues for both basic and clinical research.

The production of specialized retinal cells from pluripotent stem cells is a turning point in the development of stem cell-based therapy for retinal diseases. The present paper describes a simple method for an efficient generation of retinal organoids and retinal pigmented epithelium for basic, translational, and clinical research.

Definierten Xeno-frei und Feeder-freie Kulturbedingungen für die Generation der menschlichen iPSC-abgeleitete Retinal Zellmodellen

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart disease. When using prosthetic materials however, these grafts are susceptible to bacterial infections and various host responses.
Identification of bacterial and host factors that play a vital role in endovascular adherence of microorganisms is of importance to better understand the pathophysiology of the onset of infections such as infective endocarditis (IE) and to develop preventive strategies. Therefore, the development of competent models to investigate bacterial adhesion under physiological shear conditions is necessary. Here, we describe the use of a newly designed in vitro perfusion chamber based on parallel plates that allows the study of bacterial adherence to different components of graft tissues such as exposed extracellular matrix, endothelial cells and inert areas. This method combined with colony-forming unit (CFU) counting is adequate to evaluate the propensity of graft materials towards bacterial adhesion under flow. Further on, the flow chamber system might be used to investigate the role of blood components in bacterial adhesion under shear conditions. We demonstrated that the source of tissue, their surface morphology and bacterial species specificity are not the major determining factors in bacterial adherence to graft tissues by using our in-house designed in vitro perfusion model.

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

We describe an in-house designed in vitro flow chamber model, which allows the investigation of bacterial adherence to graft tissues.

Ein In-vitro- Modell eines Systems Parallel-Platte Perfusion, bakteriellen Einhaltung der Gewebe Transplantat zu studieren

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

Dreidimensionales Angiogenese-Assay-System mit Co-Culture-Spheroiden, die von endotheliaalen Koloniebildenden Zellen und mesenchymalen Stammzellen gebildet werden

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the blood that can disrupt delicate brain function. As such, the BBB is a major obstacle to the delivery of therapeutics to the CNS. Accumulating evidence suggests that the BBB plays a key role in the onset and progression of neurological diseases. Thus, there is a tremendous need for a BBB model that can predict penetration of CNS-targeted drugs as well as elucidate the BBB&#39;s role in health and disease.
We have recently combined organ-on-chip and induced pluripotent stem cell (iPSC) technologies to generate a BBB chip fully personalized to humans. This novel platform displays cellular, molecular, and physiological properties that are suitable for the prediction of drug and molecule transport across the human BBB. Furthermore, using patient-specific BBB chips, we have generated models of neurological disease and demonstrated the potential for personalized predictive medicine applications. Provided here is a detailed protocol demonstrating how to generate iPSC-derived BBB chips, beginning with differentiation of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells (iBMECs) and resulting in mixed neural cultures containing neural progenitors, differentiated neurons, and astrocytes. Also described is a procedure for seeding cells into the organ chip and culturing of the BBB chips under controlled laminar flow. Lastly, detailed descriptions of BBB chip analyses are provided, including paracellular permeability assays for assessing drug and molecule permeability as well as immunocytochemical methods for determining the composition of cell types within the chip.

The blood-brain barrier (BBB) is a multicellular neurovascular unit tightly regulating brain homeostasis. By combining human iPSCs and organ-on-chip technologies, we have generated a personalized BBB chip, suitable for disease modeling and CNS drug penetrability predictions. A detailed protocol is described for the generation and operation of the BBB chip.

Generierung eines humanen iPSC-basierten Blut-Hirn-Barriere-Chips

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...