وقد تم دعم هذا العمل في جزء من المنح NIH، R44 GM087784 وR01 HL109505. الكتاب أشكر الفريق الفني وOEM في جيلسون، INC للدعم التقني الموسع.

الكتاب MKC، MJG، EEB، NJD وRO هي أو كانت في ذلك الوقت من الموظفين تطوير InvivoSciences، INC التي تصور وتطوير بروتوكولات الروبوتية هو موضح هنا. TW هي منظمات المجتمع المدني لInvivoSciences INC. SH هو موظف من جيلسون INC.

<html> في هذه الدراسة قمنا بتطوير طريقة لثقافة الروبوتية لإنتاج التوجيهية التي miniaturizes وبأتمتة التغذية والمرور في شكل لوحة 96-جيدا في حين تمكن أيضا كفاءة تصعيد. تم استخدام الروبوت التعامل مع السائل لإطعام بشكل روتيني المستعمرات التوجيهية والمرور لهم على فترات منتظمة من قبل تفارق الأنزيمية. تمت برمجة الروبوت أيضا لإنتاج الخلية هلام مصفوفة لوحات المغلفة وإجراء التدرج كثافة البذر. عندما مثقف الخلايا الليفية والدهنية المشتقة iPSCs في هذا النظام لأكثر من 20 الممرات، حوالي 3 أشهر، واستمر تعدد القدرات، وكذلك كروتب] مستقرة. وكانت كل من خطوط الخلايا قادرة على التمايز إلى العضلية. معا، وجمع من البروتوكولات المذكورة هنا يمكن للمستخدمين مع القليل جدا من تجربة زراعة الخلايا الجذعية، أو محدودية فرص الحصول على المعدات الثقافة المتخصصة، إلى الخلايا الجذعية الثقافة وتحقيق إنتاج خلايا عالية أو التعامل مع مع الحد الأدنى من العمل والتكلفة متعدد الخطوط. الصورة = &quot;jove_content&quot;&gt; البروتوكولات الروبوتية مفصلة هنا توفر طريقة لاقتصادية على نطاق ويصل الإنتاج التوجيهية والتعامل معها. ميزة واحدة هي ثقافة الخلايا الجذعية قابلة للفي شكل لوحة أنشئت على أساس تظاهر هنا وسابقا 44،47 - 49 للحفاظ على تعدد القدرات. بينما الأشكال الأخرى من الخلايا المحفزة للتحجيم الخلايا الجذعية الثقافة العائد يتطلب 20،23،29 طريقة هذا الطبق يقوم أساسا أي تغيير في شكل ثقافة، مثل التأقلم مع تعليق، واستخدام رغوة المواد الكيميائية أو استخدامها لفترات طويلة من رو-كيناز 20. يمكن لهذا الأسلوب لوحة مقرها ولبسرعة، وكما هو متوقع، تستوعب خطوط جديدة لأن الظروف ثقافة متشابهة. كما استخدام iPSCs لنمذجة المرض يزيد 4،6،19،50، يتم إنشاء خطوط التوجيهية الجديدة بشكل مستمر. الأساليب المذكورة هنا هي الأنسب لخطوط ثقافة جديدة في المتوسط ​​إلى ارتفاع حجم وسرعة لأن حاجز للانتقال على الشكل هو لآه. هذا ينطبق على العمالة والمعدات اللازمة للحفاظ على المستعمرات أيضا. وأخيرا، لأن شكل والتعامل معها تشبه البيئة المستخدمة لاستخلاص والتحقق من صحة الخطوط التوجيهية، والأداء الثقافة، مثل التمييز الموجه، ومن المرجح أن يكون أكثر قابلية للتنبؤ. ويوضح الشكل 8 استراتيجية واحدة للتصعيد من إنتاج خلايا جذعية في لوحات 96-جيدا. واحد وتستخدم لوحة (دورة 0) البذور آليا 12 لوحات جديدة، أي بزيادة 12 أضعاف (دورة 0-1). بعد عدة أيام من التغذية، واحد من الاثني عشر لوحات غير passaged البذور مجموعة أخرى من اثني عشر لوحات (دورة 1 إلى دورة 2). هي ما تبقى من لوحات إحدى عشرة متاحة الآن للاستخدامات الأخرى، وتمثل عنصر إنتاج النظام. على هذا المعدل، سوف مرور لوحة واحدة توفر 11 لوحات في كل دورة، أو كل 3-4 أيام. هذه المنهجية يمكن زيادتها أكثر عندما و passaged لوحات متعددة كما هو مبين في الانتقال من دورة 2 إلى دورة 3. في دورة 3، اثنين من لوحات هيتستخدم دائما للحفاظ على مستعمرة والبذور 24 لوحات جديدة. ثم يتم المتاحة للاستخدام بعد مرور كل دورة ال 22 لوحات المتبقية. في أي نقطة في دورة صيانة يمكن للمستخدم البذور لوحات أكثر لزيادة الإنتاج. ومن الأمثلة على ذلك لمرور كل عمود لدورات نمو اثنين. مرور أول تحويل لوحة واحدة إلى اثني عشر لوحات، ولكل من اثني عشر لوحات تستخدم البذور 144 لوحات. في هذه الحالة، يبدأ مستخدم مع لوحة واحدة، وبعد اثنين من الممرات، أو حول 1،5-2 أسابيع من الثقافة، لديها 144 لوحات. على سبيل المثال، الخلايا الليفية والدهنية خطوط التوجيهية تسفر حوالي 25 حتي 75000000 خلايا لكل لوحة 96-جيدا عندما تصبح جاهزة للمرور. وبالتالي يمكن أن 144 لوحات تمثل حوالي 4-7 × 10 9 خلايا. ما هو عبء العمل لتنفيذ 144 لوحات 96-جيدا آليا؟ كان واحدا من الأهداف لهذا العمل قابلة للإنتاج الخلايا الجذعية التي خفضت العمل مقارنة مع التقليدية (لوحة أي 6 جيدا) وقف زراعة الخلايا. لجنة التنسيق الإدارية الروبوتomplishes ذلك عن طريق تخفيف الحاجة إلى التعامل مع جسديا كل لوحة خلال التغذية والركض. في حين 96-جيدا موازين إنتاج لوحة خطيا ان الامر سيكون في 6 لوحات جيدة التقليدية، وهي المرة فني تنفق العمل مع لوحات أقل بكثير استخدام الثقافة الروبوتية. مشتق كفاءة إنتاج الثقافة الروبوتية من هذه الفرق (الشكل 9). تبين الفنيين يمكن إزالة لوحة 6 جيدا من الحاضنة، التحقق من ذلك على المجهر، ثم نضح والأعلاف لوحة في ما يقرب من 3.5 دقيقة. في المقابل، الفنيين تنفق ما يقرب من 30 ثانية إزالة لوحة 96-جيدا من الحاضنة والتفتيش على المجهر لكثافة والتلوث قبل وضعه على الروبوت. مع بروتوكول التغذية موسعة مماثلة لتلك المذكورة أعلاه، ست لوحات 96-جيدا يمكن تحميلها وبنك الاحتياطي الفيدرالي، والذي يستغرق حوالي 21 دقيقة، أو 3.5 دقيقة لكل لوحة. مجموع الوقت المنقضي لتغذية لوحة غير قابلة للمقارنة بين الروبوتمطلوب جيم والأساليب اليدوية، ولكن لتغذية اليد 6 لوحات فني للجميع 21 دقيقة في حين فني تنفق التعامل مع ستة لوحات للروبوت (تفتيش 30 ثانية لكل لوحة) 3 دقيقة فقط. كما يبين الشكل 9، وهي المرة فني تنفق التعامل مع 144 لوحات باستخدام الروبوت هو حوالي 1.2 ساعة بدلا من 8 ساعات يدويا والروبوت سوف تجعل أبدا من الخطأ التعامل مع لوحات أو نقل السوائل. 96-جيدا أساليب الثقافة التوجيهية وصفها هنا توفر منصة الانقياد للمهام الفحص المعقدة. لأن كل بئر غير متطابقة وراثيا والمصنف في نفس الكثافة من نفس المجموعة الأولي، والمتغيرات يمكن توزيعها عبر لوحة والتي تحتفظ بها الروبوت مع الخزانات المتاحة تجاريا لفصل الظروف. وهذا من شأنه أن يكون مفيدا للتجارب مثل تطوير نمو الخلايا الجذعية وسائل الإعلام 34،35،47، الركيزة أو شرط الثقافة الاختبار ودراسات السمية باستخدام الخلايا الجذعية51. وبما أن كل خط الخلايا الجذعية هي فريدة من نوعها من حيث حجم مستعمرة والمرور متطلبات المثلى، يمكن للمرء أن استخدام هذا النظام لتعديل كثافة البذر، وتردد التغذية ومعالجة مرور عن طريق التلاعب في الأعمدة التي تحصد، والإثارة الميكانيكية أثناء مرور وتواتر التغذية. سوف بالتكرار عبر هذه المتغيرات تسمح للمستخدم العثور بسرعة على مجموعة من الظروف المناسبة لثقافة خط جديد أو تطوير تقنيات ثقافة جديدة. النظام الآلي هو أيضا قادرة على الحفاظ على 96 موازية ولكن مستقلة مستعمرات الخلايا الجذعية. عندما يتم اشتقاق التوجيهية من الخلايا الجسدية أو المستنسخة بعد التلاعب الجيني، يتم فحص العديد من الحيوانات المستنسخة موازية لانتاج خطوط التوجيهية المحتملة. بمجرد المصنف الخلايا وحيدة في لوحات 96-جيدا، ويمكن هذا النظام إطعام والمرور لوحات 96-جيدا حفظ كل مستعمرة منفصلة. وهذا يتيح سرعة عالية جدا عند اختيار الحيوانات المستنسخة المحتملة ويلغي صعوبة في زراعة جسديا 96 خطوط متوازية. هذه الطريقة أيضاllows تحجيمها يصل إنتاج كل استنساخ بحيث المواد متاحة بسهولة لتحليل الموازي. أخيرا، نحن نتصور دمج هذه التقنيات الثقافة مع لوحة نظام الاتجار الروبوتية من شأنها أن توفر لوحات من وإلى حاضنة تمكين ثقافة مؤتمتة بالكامل. ويمكن تحقيق ذلك مع المزيد من الروبوتات المعقدة التي تسمح لمزيد من التوسع منذ البروتوكولات الأساسية المبينة هنا هي قابلة للتحويل إلى أنظمة وحة أخرى مقرها. الخطوات الحاسمة الأولى للتصدي لفي البروتوكولات هي تلك التي تمنع وتحقق للتلوث مثل الخطوات 1.5 و 4.2. تلوث، كما ذكرنا آنفا، يمكن تجنب بنجاح إذا تم استخدام تقنية معقمة جيدة والحس السليم. ومن الضروري، بغض النظر عن شكل ثقافة الخلايا الجذعية، أن الاختيار مشغل للتلوث وذلك في هذا البروتوكول في الخطوات المشار إليها سوف تقلل إلى حد كبير من خطر التلوث. الصحيح خارج الخلية تطبيق هلام مصفوفة هو وفاق سطيف الثانيخطوة ential لنجاح هذا البروتوكول. دون طلاء صحيح لوحات 96-جيدا، فإن الخلايا الجذعية لا تنمو. قضية واحدة مشتركة هي ناقصة طلاء جيدا. فقد أثبتت التجربة أن فقاعات الهواء، والجذب الكهربائي وعمل شعري تعيق إكمال الطلاء بشكل جيد. وقد وضعت الخطوة ما قبل التبول (1،6) إلى تحسن ملحوظ طلاء القاع جيدا ويجب أن لا يتم تخطي. ويبدو أن هذه الخطوة ترطيب مسبقا للحد من للا مائية واضح من البلاستيك لوحة 96 جيدا بحيث أنه عندما يتم تطبيق هلام خارج الخلية مصفوفة طلاء يتم توزيعه بالتساوي على القاع جيدا والجانبين. ويوصى أيضا للاستفادة بلطف لوحات 96-جيدا ضد يد نظيفة مرة واحدة المغلفة لضمان حتى خارج الخلية توزيع حل جل المصفوفة. المعلمات التفكك مهمة لتحسين أيضا. ومدد الحضانة مع انزيم أو EDTA أساس التفكك كاشف يؤدي في زنازين انفرادية التي قد تكون أو لا تكون هدفا خلال مرور. ولذلك، فإن المشغلوينبغي إيلاء اهتمام خاص لكم من الوقت التفكك، قوة سحن، والتكرار غسل تؤثر مورفولوجيا مستعمرة والصحة وضبط وفقا لذلك. فهم القيود المفروضة على الأساليب المذكورة هنا بالغ الأهمية لنجاح العملية. كما هو الحال في أي مكان زراعة الخلايا الأخرى، واستخدام لوحات 96-جيدا يمثل خطرا تلوث عالية نسبيا. كما هو موضح أعلاه، فني هو التعامل مع كل لوحة أثناء الرضاعة والركض. على سبيل المثال، عند فتح الغطاء، وضع لوحة على السرير الروبوت، وفحص لوحة على المجهر. لذلك، كما لوحظ بعد الخطوة 1.5، فمن الضروري عدم لمس داخل أي لوحة غطاء أو فضح هذا الجزء على أي سطح يحتمل أن تكون ملوثة مثل كتل التدفئة منحدر أو دبابيس العمودية على السرير. خلال تطوير بروتوكول تم اكتشاف هذا القيد، وكان الدافع لتطوير رف لعقد أغطية لوحة للحفاظ على عقم. وبالمثل، فإن الخزانات الحوض الصغير، نصائح الماصة وسإمدادات ذر على السرير التعامل مع الروبوت السائلة هي المصادر المحتملة للتلوث لأنهم منفتحون على البيئة والتعامل معها من قبل فني. ولذلك، ينبغي أن تطبق تقنية معقمة جيدة مثل الحد من تحركات على المواد الثقافة تتعرض أو السوائل المفتوحة. قيود آخر هو أنه عندما يتم تحجيم بروتوكول يصل، والتحقق بصريا كل جانب من&gt; 100 لوحات 96-جيدا مرهقة. هذا يمكن التعامل معها عن طريق التفتيش بصريا لوحة كاملة بحثا عن علامات على التلوث، مثل وسائل الإعلام العكرة، لتحديد الآبار المشبوهة. على نطاق والمستقبل، وسوف تدرج استخدام المجهر الآلي ومؤشر على نمو الخلايا والتلوث المحتمل. وباختصار، فإن الإنتاجية العالية 96-جيدا منطلقا الموصوفة هنا تقدم استنساخه أو أسلوب الدقة العالية لزراعة الخلايا الجذعية والإنتاج في شكل لوحة. هذا الأسلوب يقلل من الخبرة المطلوبة، والمعدات الوقت اللازم والعمل مكرسة لوقف زراعة الخلايا في حينالحفاظ على فوائد ثقافة ملتصقة التقليدية.

وقد ازداد استخدام الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان (iPSCs) بشكل ملحوظ منذ اشتقاقها في عام 2007 1 لاختبار مركب، الطب التجديدي والنمذجة المرض 2-6. هذا الطلب يأتي من القدرة التوجيهية لتسفر عن أعداد كبيرة من الخلايا المحفزة التي يمكن أن تكون متباينة في الخلايا الجسدية في كمية لم يسبق لها مثيل. كما تقنيات التمايز الموجهة تحسين 7-10 وتطوير الخلايا البشرية أو النمذجة الأنسجة والعلاج بالخلايا يزيد 11-14، لذلك لا شرط الانتاج الكبير للiPSCs جودة عالية. ويستشهد على نطاق واسع أن من بين أمراض أخرى، احتشاء عضلة القلب أو ب خلايا استبدال وظيفية سيتطلب مئات الملايين إلى المليارات من IPSC اشتقاق الخلايا الجسدية 15-18. وعلاوة على ذلك، معقدة بشكل متزايد نمذجة الأنسجة 3D لاكتشاف الأدوية ورherapy سيطالب أعداد كبيرة من الخلايا 9،13،19. في كل هذه الأمثلة، تعريف وموحدة ويجب أن يكون iPSCs استنساخه المتاحة واضحة لإنتاج. من أجل إنتاج الخلايا الجذعية المستمدة الصيدلة الحيوية والخلايا لهندسة الأنسجة وزراعة الأعضاء، وتكنولوجيا خلايا تصنيع فعالة من حيث التكلفة ضرورية. وقد ركزت إنتاج تحجيم iPSCs على ثقافة تعليق 20-25 أو تعليق مع استخدام ركائز microcarrier 26-28 ويرجع ذلك جزئيا تنتشر هذه التقنيات بنجاح على نطاق واسع، وعدم التوجيهية، الإنتاج القائمة حقيقية النواة. وقد أثبتت العديد من المجموعات نظم الاستزراع تعليق أن تسفر عن الخلايا الجذعية المحفزة 20،21،23،24،29. ومع ذلك، هذه الأساليب تستخدم أنظمة مكلفة ومعقدة ليست متاحة بسهولة للباحثين تطوير برامج التمايز جديدة، والقيادة هندسة الأنسجة والقيام laboratبحث نطاق وأوري. وعلاوة على ذلك، تعليق وmicrocarrier الثقافات التوجيهية تتطلب التكيف والتقنيات والمواد الكيميائية التي لا توجد في ثقافة التوجيهية ملتصقة التقليدية مثل الاستخدام المتواصل رو-كيناز المانع، وكلاء رغوة والترشيح لتنظيم التجميع. الاجهاد البدني للخلايا هو أكثر انتشارا في الثقافة تعليق، الذي عرضته الإثارة الميكانيكية وكذلك خلال microcarrier الاصطدام. هذه القضايا تحد من القدرة على التنبؤ والسرعة التي تم إنشاؤها حديثا الخلايا الجذعية يمكن تربيتها في تعليق. وقد وضعت آخرين أنظمة مناولة لوحة الروبوتية التي تحاكي تقنيات زراعة لوحة 30،31 ولكن هذه المنصات يطالب استثمارات كبيرة لمعدات وخبرات للعمل بالإضافة إلى التحديات الأساسية المرتبطة زراعة الخلايا الجذعية. ويصف العمل وفقا للتنمية وممارسة نظام الثقافة التوجيهية للتحجيم التي تستخدم بذاتها، ومعيار السائل الروبوتية 8 قنواتمعالج و96-جيدا لوحات. وقد تم تصميم هذا الأسلوب لرأب الثقافة التوجيهية نطاق المختبر وارتفاع حجم الإنتاج التوجيهية (على سبيل المثال، 10 7-1،5 × 10 9 خلايا أسبوعيا في كل فني) تمكين تلك تطوير تقنيات جديدة التوجيهية يسهل على مقياس يصل الانتاج دون أجهزة أو العمل استثمارات كبيرة. هذه الطريقة غير مكلفة نسبيا لإعداد، يتطلب قليل من دون زراعة الخلايا الجذعية والبرمجة والهندسة الخبرة، لديه بصمة المعدات الصغيرة دون الحاجة إلى متخصص غطاء زراعة الخلايا، ويستخدم معيار المعدات زراعة الخلايا لتمكين متوسطة إلى عالية الإنتاجية الآلي إنتاج خلايا. وكان الهدف هو تطوير نظام قادر على تحجيم زراعة الخلايا الجذعية التي يمكن استخدامها من قبل مختبرات جديدة للحد من زراعة الخلايا، أولئك الذين يجدون زراعة اليدوية عائقا أمام تطوير أفكارهم أو أولئك الذين يريدون وسيلة اقتصادية لإنتاج أعداد كبيرة من الخلايا الجذعية. منصة المعروضة هنا يزيل تأثير فني علىوقف زراعة الخلايا وتطبيع الإجراءات التغذية والمرور لتمكين إنتاج الخلايا الجذعية ثابت.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>96-well; Well volume: 360uL; Cell growth area: 0.32cm2; Individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Trough</td>
			<td>SeahorseBio</td>
			<td>201308-100</td>
			<td>Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167023</td>
			<td>10 racks gilson 96tips D200 tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12500062</td>
			<td>DMEM/F12 powder.&#160; Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factor Reduced Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Referred to as, &#34;extracellular matrix gel&#34; in the text.&#160; Matrigel GFR, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5857</td>
			<td>mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 Media</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>AdooQ BioScience</td>
			<td>A11001-50</td>
			<td>Rock inhinitor Y-27632 2HCI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>ACCUTASE</td>
			<td>Referred to as, &#34;proteolytic and collagenolytic dissociation reagent&#34; in the text.&#160; Accutase 500 mL sterile cell solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH30256FS</td>
			<td>PBS w/o CA MG 500 mL, 6/pk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson PIPETMAX</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>PIPETMAX</td>
			<td>http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable 96-well plate based ipsc culture and production using a robotic liquid handling system

استمرار التقدم في زراعة الخلايا الجذعية المحفزة تضيق الفجوة بين مقاعد البدلاء، والسرير لاستخدام هذه الخلايا في الطب التجديدي، واكتشاف المخدرات واختبار الأمان. من أجل إنتاج الخلايا الجذعية المستمدة الصيدلة الحيوية والخلايا لهندسة الأنسجة وزراعة الأعضاء، وتكنولوجيا خلايا تصنيع فعالة من حيث التكلفة ضرورية. الحفاظ على تعدد القدرات والأداء المستقر من الخلايا في التطبيقات المصب (على سبيل المثال، تمايز الخلايا) مع مرور الوقت أمر بالغ الأهمية لإنتاج خلايا نطاق واسع. بعد التي يمكن أن يكون من الصعب تحقيق خاصة إذا مثقف الخلايا يدويا حيث يمكن للمشغل إدخال تقلب كبير وكذلك يكون مكلفا للغاية لتوسيع نطاق المتابعة. لتمكين الإنتاجية العالية، وإنتاج الخلايا الجذعية على نطاق واسع، وإزالة نفوذ مشغل بروتوكولات زراعة الخلايا الجذعية رواية باستخدام مقعد بين كبار متعدد القنوات وضعت التعامل مع الروبوت السائلة التي تتطلب الحد الأدنى من تورط فني أو الخبرة. معوكانت هذه يسببها الخلايا الجذعية المحفزة بروتوكولات البشرية (iPSCs) مثقف في ظروف خالية من تغذية مباشرة من الأسهم المجمدة وحافظت في لوحات 96-جيدا. اعتمادا على خط الخلية ومعدل تصعيد المطلوب، يمكن للمشغل تحدد بسهولة عندما بالمرور على أساس سلسلة من الصور التي تبين كثافة مستعمرة المثلى للتقسيم. ثم الكواشف اللازمة مستعدة لإجراء تقسيم مستعمرة لوحات جديدة دون خطوة الطرد المركزي. بعد 20 الممرات (~ 3 أشهر)، حافظت على خطين التوجيهية [كروتب مستقرة، أعربت علامات الخلايا الجذعية، ومتميزة في العضلية ذات كفاءة عالية. النظام يمكن أن تؤدي لاحقا فحص عالية الإنتاجية من البروتوكولات تمايز جديدة أو التلاعب الجيني مصممة لوحات 96-جيدا. وهذه التقنية تقلل من عبء العمل والتقني لإنتاج أعداد كبيرة من الخلايا الجذعية متطابقة لعدد لا يحصى من التطبيقات.

Watch this Scientific Journal Video about Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System at JoVE.com

Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes.

قابلة لوحة 96-جيدا وبناء التوجيهية الثقافة والإنتاج باستخدام نظام الروبوتية معالجة السائل

Continued advancement in pluripotent stem cell culture is closing the gap between bench and bedside for using these cells in regenerative medicine, drug ...

scalable-96-well-plate-based-ipsc-culture-production-using-robotic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

31.4K Views.  InvivoSciences, Inc.. The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes. 

Video: Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

تغليف الجينات المحفزة للخلايا الجذعية باستخدام فوهة المشارك المحوري

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that adheres to form the midline epithelial seam (MES). The theories suggest that MES cells follow an epithelial to mesenchymal transition (EMT), apoptosis and migration, making a fused palate 1. Complete disintegration of the MES is the final essential phase of palatal confluence with surrounding mesenchymal cells. We provide a method for palate organ culture. The developed in vitro protocol allows the study of the biological and molecular processes during fusion. The applications of this technique are numerous, including evaluating responses to exogenous chemical agents, effects of regulatory and growth factors and specific proteins. Palatal organ culture has a number of advantages including manipulation at different stages of development that is not possible using in vivo studies.

Studies of palate development are motivated by the incidence of cleft palate, a birth defect that imposes a tremendous health burden and can leave lasting disfigurement. We demonstrate here a technique to culture palatal shelves that can be used to study different signaling pathways involved in palatal development and fusion.

طريقة دراسة حلقي فيوجن باستخدام ثابت الجهاز الثقافة

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

الاستنساخ وظيفية باستخدام<em&gt; القيطم</em&gt; نظام التعبير البويضة

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

تتبع الخلايا في الزرد-GFP المعدلة وراثيا باستخدام نظام Photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

إنتاج واسع النطاق العضلية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية باستخدام تكرار للغاية الصغيرة وبناء جزيء بروتوكول التمايز

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

إنتاج الخلايا الجذعية المحفزة من الفأر الأمنيوسي الخلايا السوائل عن طريق نظام ينقول

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

جهاز لأداء الهجرة خلية / شفاء الجروح في لوحة 96-حسنا

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) is particularly attractive for neurodegenerative disease studies, including retinal dystrophies, where iPSC-derived retinal cell models mark a major step forward to understand and fight blindness. In this paper, we describe a simple and scalable protocol to generate, mature, and cryopreserve retinal organoids. Based on medium changing, the main advantage of this method is to avoid multiple and time-consuming steps commonly required in a guided differentiation of iPSCs. Mimicking the early phases of retinal development by successive changes of defined media on adherent human iPSC cultures, this protocol allows the simultaneous generation of self-forming neuroretinal structures and retinal pigmented epithelial (RPE) cells in a reproducible and efficient manner in 4 weeks. These structures containing retinal progenitor cells (RPCs) can be easily isolated for further maturation in a floating culture condition enabling the differentiation of RPCs into the seven retinal cell types present in the adult human retina. Additionally, we describe quick methods for the cryopreservation of retinal organoids and RPE cells for long-term storage. Combined together, the methods described here will be useful to produce and bank human iPSC-derived retinal cells or tissues for both basic and clinical research.

The production of specialized retinal cells from pluripotent stem cells is a turning point in the development of stem cell-based therapy for retinal diseases. The present paper describes a simple method for an efficient generation of retinal organoids and retinal pigmented epithelium for basic, translational, and clinical research.

خالية كرة محددة وشروط الثقافة خالية من علبة التغذية بالورق "نماذج الخلية الشبكية" المستمدة من اللجنة التوجيهية جيل من البشر

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart disease. When using prosthetic materials however, these grafts are susceptible to bacterial infections and various host responses.
Identification of bacterial and host factors that play a vital role in endovascular adherence of microorganisms is of importance to better understand the pathophysiology of the onset of infections such as infective endocarditis (IE) and to develop preventive strategies. Therefore, the development of competent models to investigate bacterial adhesion under physiological shear conditions is necessary. Here, we describe the use of a newly designed in vitro perfusion chamber based on parallel plates that allows the study of bacterial adherence to different components of graft tissues such as exposed extracellular matrix, endothelial cells and inert areas. This method combined with colony-forming unit (CFU) counting is adequate to evaluate the propensity of graft materials towards bacterial adhesion under flow. Further on, the flow chamber system might be used to investigate the role of blood components in bacterial adhesion under shear conditions. We demonstrated that the source of tissue, their surface morphology and bacterial species specificity are not the major determining factors in bacterial adherence to graft tissues by using our in-house designed in vitro perfusion model.

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

We describe an in-house designed in vitro flow chamber model, which allows the investigation of bacterial adherence to graft tissues.

نموذج في المختبر نظام التروية التوازي-لوحة لدراسة البكتيريا التمسك Graft الأنسجة

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

نظام فحص تكوين الأوعية ثلاثي الأبعاد باستخدام Spheroids الثقافة المشتركة التي شكلتها الخلايا المكونة للمستعمرة البطانية والخلايا الجذعية Mesenchymal

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...