נתמך על ידי המכון פסטר, INSERM, סוכנות הידיעות הלאומית דה משוכלל ונדיר ANR (&#39;Lymphopoiesis&#39; גרנט), להחיות עתיד תכנית השקעות ו&quot; לה ליגת העל contre le הסרטן &quot;.

הצהרת אתיקה: כל הניסויים בוצעו על פי המכון פסטר אתיקת האמנה, שאושרה על ידי משרד החקלאות הצרפתי, ולהנחיות של האיחוד האירופי. מניפולטור עם הכשרה בניתוח מכרסם קטן, מאושר על ידי משרד החקלאות הצרפתי, מבצע את כל ההתערבות כירורגית. הערה: ראה בטבלה נספח 1 המציגה את הליך תכנית 5 שלבים. 1. בחירה של העוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 36 נקבות / 6 CD45.2 C57BL, CD45.1 נקבות 12, 12 C57BL / 6 זכרים CD45.1 ו -12 C57BL / 6 זכרים CD45.2. חוצה את הנקבות עם או גנוטיפ הזכר לייצר עוברי CD45.1 / 2 וCD45.1 משמשים כמקור לכפית או CD45.2 משמש כמקור לאונות הרתי נמען. בית כל הגברים בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג עובר לבידוד E18 TSP, מקום 2 נקבות בכלוב עם CD45.1 אחד גברים בשעה 6, 21 ימים לפני ניסוי ההשתלה. בדוק את הנוכחות של תוסף נרתיק למחרת, לפני הצהריים. SEPAלדרג את הנקבות מחוברות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג עוברי E14 שהתיישב בו כפית, לחזור על התהליך לעיל (1.2), באמצעות CD45.2 גברים, 17 ימים לפני ניסוי ההשתלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג עוברים לבודד E13 TSP, לחזור על התהליך לעיל (1.2), תוך שימוש בזכרים C57BL / 6 CD45.1, 16 ימים לפני ניסוי ההשתלה. </li></ol> 2. Dissection של העוברים תחת אופקי זרימה למינרית הוד הערה: יומיים לפני ניסוי ההשתלה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את הנשים בהריון על ידי נקע בצוואר הרחם או על ידי ממשל מתקדם של גז CO 2 בלפחות 5 דקות, בתא סגור להרוות. ודא מוות על ידי מעצר מוחלט של תנועות אירובית-נשימתי. להרטיב את הבטן עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך אורכי בעור בבטן קו האמצע ולפתוח אותו על ידי משיכת העור לגזרים. פתח את הצפק עם מלקחיים ומספריים בלי לגעת במערכת העיכול. משוך את uter bifidשלנו ולהפריד אותו מהנרתיק עם המספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הרחם ב90 x 15 מ&quot;מ צלחת פטרי המכילה 40-50 מיליליטר DPBS ולחתוך transversally בין decidua של כל עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג מספריים טיפ נאה ומלקחיים בסדר להסיר את קרום שריר הרחם, להוציא את העוברים על ידי חיתוך בין השליה וצק החלמון, ולהסיר את amnios, ששמירה על העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העוברים בצלחת פטרי 90 x 15 מ&quot;מ המכיל HBSS + 1% בסרום עגל עוברי (FCS). לעוברים מבוגרים מE15, להסיר את הראשים עם זוג המספריים לפני כל נתיחה נוספת. </li></ol> 3. בידוד של קורנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת זכוכית המגדלת המשקפת, למקם את העובר, שוכב במצב שכיבה (צפה בגחון), על מצע גזה רטוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס אחד מלקחיים longitudinally לאורך הסחוס של עצם החזה, לצבוט ולפתוח את רשת בית החזה. עם מלקחיים מעוקלים, למשוך את קיר בית החזה בצד כדי להמחיש את tאונות hymic בכל צד של קנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיק בזהירות כל אונה ידי צובט מתחת עם מלקחיים עדינים ומניח אותם בצלחת פטרי המכילה FCS 1 מיליליטר HBSS + 1%. לבודד את האונות ולהסיר רקמת חיבור המקיפה עם שני מזרקים 1 מיליליטר + 26 G ⅜ &quot;מחטים, מבלי לפגוע בכמוסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את האונות ב 3 מיליליטר של FCS + 1% HBSS לחסל תאי דם. הערה: לפני E15, אונות הרתי נמצאות בכל צד של קנה הנשימה והנתיך מאוחר יותר באמצע להוות איבר דו-אוֹנִי. </li></ol> 4. השעיות תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפריד אונות תחת זכוכית המגדלת המשקפת, עם שתי 26 מחטי G רכובים על 1 מיליליטר מזרקים, בFCS + 1% HBSS. סנן את ההשעיה התא דרך רשת ניילון. </li></ol> מכתים 5. עם נוגדנים ניאון ומיון תא הערה: כל הנוגדנים טיטרציה בעבר להשיג הגדרה אופטימלית של האוכלוסיות (titratיון יכול להשתנות עם אצווה הנוגדן). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה thymocytes (E13 או E18) במשך 15-30 דקות ב 4 ° C עם של קוקטייל של נוגדני biotinylated להכתים תאים חיוביים שושלת 100 μl (אנטי-CD19, אנטי-Gr1, אנטי-Ter119, אנטי-NK1.1 , CD11c אנטי, אנטי-CD3, אנטי CD4, CD8 אנטי, אנטי CD25). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העודף של נוגדני ספין למטה הצינורות עם FCS 4 מיליליטר HBSS + 1% ב 280 XG במשך 7 דקות, לחסל את supernatant והגלול בFCS + 1% הטריים HBSS מתלים-מחדש. חזור על צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאי שכותרתו ביוטין E18 עם microbeads streptavidin במהלך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולשטוף את התאים פעמיים בFCS 1% HBSS. להשעות מחדש את התאים 2 מיליליטר HBSS + 1% FCS. רוב thymocytes E13 הוא שושלת שלילית ולכן לא צריך העשרת MACS לפני מיון תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התאים בעמודה LS, על פי הוראות היצרן. כאשר כל ההשעיה התא נכנסה לטור להוסיף FCS + 1% 2 מיליליטר HBSS. להתאושש4 מיליליטר של הטור לזרום דרך צנטריפוגות התאים ל7 דקות ב 280 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש להשעות את גלולה של שני E18 המדולדל או thymocytes E13 כולל בμl 50 של תערובת נוגדני TSP (אנטי-CD117 APC, אנטי-CD135 PE, אנטי-CD127 PECy7, אנטי CD24 FITC, אנטי CD44 APCCy7 ואוקיינוס ​​השקט הכחול streptavidin ) ו דגירה של 20 דקות ב 4 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם 4 מיליליטר HBSS + 1 FCS% ומחדש להשעות את התאים 1 מיליליטר HBSS FCS 1% + עם יודיד propidium. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין לין TSPs - CD127 הנמוך CD44 + CD117 + CD24 + CD135 + תאים בFACS (עם 4 לייזרים) על 1.5 מיליליטר צינורות המכילים 200 μl FCS + 20% בינוניים מלא. השער ראשון התאים בהתאם לגודלם והגרעיניות בFSC וערוצי SSC. לחסל את התאים מתים (צביעה עם יודיד propidium), שער החוצה כפילויות ולהבקיע את הקרינה בקשקשי מעריכי. ניתן להשיג בסביבות 100 או 600 TSPs מE13 אחד או אחת התימוס E18, respectivאיליי. </li></ol> 6. הרתי אונות עם אבות ההתיישבות של E14: טכניקת גלילת תליה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקרין (30 אפורים = 30 Gy) אונות הרתי E14 מעוברי CD45.2, 3 שעות לפני התרבות. הערה: אונות הרתי E14 או E15 שימשו בהצלחה כנמען של אבות תא T. שימוש באונות הרתי נמען של תוצאות ימי הריון מאוחר יותר בנימק מוקדם בשל הגודל גדול יותר של האיבר תוך אונות הרתי בימי הריון מוקדם יותר לפתח גרועה, ככל הנראה בשל פיתוח שלם של תאי האפיתל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מסודרים TSPs מחדש להשעות את התאים במדיום התרבות (בינוני מלא OPTI-ממ עם FCS 10%, פניצילין (50 יחידות / מיליליטר), סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) ו2β-mercaptoethanol (50 מיקרומטר)) באופן ש-35 μl מכיל 500 TSP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ירידת 35 μl של השעיה תא כל גם אחרים של צלחת גם Terasaki 60. הערה: 35 טיפות μl יכולות לאחות אם הם ממוקמים בבארות רציפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח אונה אחת מוקרנת על פני השטח של כל טיפה. סגור את צלחת Terasaki ולהפוך את הצלחת הפוכה לתת התאים להגיע לקוטב הפסגה של הירידה על ידי כוח הכבידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכה בעדינות בצד העליון של הצלחת ההפוכה כדי לאלץ את האונות להחליק לקצה הקודקוד של הירידה. דגירה את צלחת Terasaki ההפוכה בחממה humidified במשך 48 שעות על 37 מעלות צלזיוס + 5% CO 2. לאחר ההתיישבות, או תרבות thymi E14 ב -7 FTOC, או שתל תחת הקפסולה הכליות של עכבר בוגר נמען 8. </li></ol> 7. עוברי הרתי איברים תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 3 מיליליטר של מדיום שלם בצלחת פטרי 35 מ&quot;מ. מניחים מסנן קרום isopore צף על המדיום. מניחים את האונות מחדש על הקצה של הקרום עם מלקחיים (לא יותר מ -8 אונות על קרום אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחות פטרי המכילות את האונות הרתי בתוך צלחת פטרי 90 מ&quot;מ, יחד עם מנה 35 מ&quot;מ, ללא כיסוי, המכיל 2 מיליליטר של water, כדי להבטיח לחות אופטימלית. דגירה 12 ימים ב 37 ° C + 5% CO 2. </li></ol> 8. שתלי תחת הקפסולה הכליות בתנאים סטריליים הערה: parenchyma הכליות מוקף רקמת חיבור יוצרת כמוסה. האזור תת-קופסית הוא עשיר במיוחד בדם וכלי הלימפה ובכך לספק סביבה מתאימה לפיתוח שתלים (למשל אונות הרתי, איי לבלב או לבבות שזה עתה נולד). שתלי נעשים בדרך כלל על הכליה השמאלית משום שהוא נגיש יותר מהכליה הימנית. CD3 - / - עכברי זכרים שמשו כמקבלים וכך למנוע שתל לעומת תגובת מארח בשל אנטיגנים histocompatibility קטין הצמודים לכרומוזום Y, כי קביעת מין לפני E15 היא לא לעשות בקלות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את המכשירים וללבוש כפפות סטריליות לאורך הניתוח. להרדים את העכבר על ידי הזרקה תוך הצפק של פתרון של קטמין 10 מ&quot;ג / מיליליטר + 1 מ&quot;ג Xylazine /מיליליטר מדולל PBS: (50 עד 100 μl לכל 10 גרם משקל גוף), תוך שימוש במזרק 1 מיליליטר. ודא הרדמה על ידי בדיקת חוסר רפלקסים interdigital. מניחים ירידה של ג&#39;ל הידרו-Optimune על כל עין כדי למנוע יובש במהלך הרדמה. הערה: הפתרון צריך להיות מוכן מראש, חימם בטמפרטורת חדר לפני ההזרקה. ההרדמה נמשכת לפחות 20 דקות. התואר של הרדמה צריך להיות מבוקר לאורך כל הניתוח. ההרדמה יכולה להיות ממושכת על ידי הזרקה תוך הצפק של מחצית מנה בכל 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר בצד הימני שלה, תחת זרימת lamina מכסה המנוע אופקי. לעקר את שדה הניתוח עם 70% אתנול ו -10% פתרון dermic יודיד. עם חלק מלקחיים שיער העכבר לאורך אורך 2 סנטימטר מעל המשותף של הרגל האחורית. לגלח את אזור הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם אזמל, להפוך סנטימטר אורך חתך 1.5, הרקמה עורית הראשונה, ולאחר מכן עם מספריים לחתוך את רקמת השריר. החל לחץ קל לשני הצדדים של החתך, שיאלץ את הכליות מתוך חלל הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מלוח עם כותנה-ניצן לשמור הכליות לחות. אם יש לך קשיים בחשיפת האיבר, להשתמש במלקחיים שטוחים לשלוף את רקמת adipocyte מסביב שלכליות מחוברת. לשמור על הכליות מתוך חלל retroperitoneal ידי ניצן כותנה ממוקם מתחת לאיבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם שני מלקחיים עדינים, לעשות חור 2-3 מ&quot;מ בכמוסה (להימנע מלגעת parenchyma כדי למנוע דימום). במהלך ההליך הכירורגי כל לשמור על הקפסולה הכליות החשופה הטבולה ברציפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס בזהירות את האונות תחת הקפסולה הכליות, על ידי שמירה על הקיר של הקפסולה נפתחה והחלק את השתל מתחת לכמוסה לכיוון קוטב הקצה. הנח עד 6 אונות לכליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את הכליות בחלל רטרו הצפק. לתפור את aponeuroses השריר, אז עור עם קשרים מנתח בודדים. להרטיב את הפצע עם 10% פתרון povidone יודיד. מניחים את העכבר על הרשות הפלסטינית מחוממתד ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סקר העכבר המושתל עד להחלמה מלאה מן ההרדמה על ידי שליטה על תנועות לב, נשימה וזיף, צבעי רירית עד להחלמה מוחלטת נתפסה על ידי עצמי כלולה תנועות. הערה: אנו ממליצים הזרקה של פתרון כאבים שרירים פנים (Buprenorphin, 0.1 מ&quot;ג / קילוגרם) רק לאחר הניתוח ולאחר ניתוח 2 ימים כדי למנוע כאב שלאחר הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את החיה פעלה בבידוד עד התאושש לחלוטין. בדוק בכל יום אחר התפרים של הפצע כדי לוודא ולמנוע זיהום. מעולם לא נצפה זיהום פצע הבא בהליך זה. הערה: ניתוח שבועי של תאי דם היקפיים מCD3 - / - עכברים מורכבים מאפשרים לנו לזהות את הרתי אוכלוסיות נובעות מקור משני אבות E13 או E18 באמצעות סמן CD45 allotypic ושושלת תא T נוגדנים ספציפיים (איור 3). </li></ol> 9. ניתוח של צאצאי TSP על ידי cytometry הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; להקניט FTOCs בנפרד כדי להשיג השעיות תא בודדות (ראה סעיף פרוטוקול 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעיות תא כתם מאונות בודדות עם תערובת נוגדנים המכילה נוגדני הכרת CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4 APCCy7, CD8 APC, CD3 פסיפיק בלו, Vγ5 FITC, Vδ1 PE והדגירה כאמור בסעיף 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות מחדש את התאים בHBSS יודיד FCS + 1% + propidium ולנתח בcytometer זרימה (ראה תוצאות באיור 2). </li></ol>

<ol>
	<li>Rodewald, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymus+organogenesis.">Thymus organogenesis.</a> Annu Rev Immunol. 26, 355-388 (2008).</li><li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journey+through+the+thymus:+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection.">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).</li><li>Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+II-positive+epithelium+and+mesenchyme+cells+are+both+required+for+T-cell+development+in+the+thymus.">MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus.</a> Nature. 362, 70-73 (1993).</li><li>Douagi, I., Andre, I., Ferraz, J. C., Cumano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+T+cell+precursor+activity+in+the+murine+fetal+thymus:+evidence+for+an+input+of+T+cell+precursors+between+days+12+and+14+of+gestation.">Characterization of T cell precursor activity in the murine fetal thymus: evidence for an input of T cell precursors between days 12 and 14 of gestation.</a> Eur J Immunol. 30, 2201-2210 (2000).</li><li>Calderon, L., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic,+context-dependent,+and+hierarchical+functions+of+epithelial+components+in+thymic+microenvironments.">Synergistic, context-dependent, and hierarchical functions of epithelial components in thymic microenvironments.</a> Cell. 149, 159-172 (2012).</li><li>Adolfsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Flt3++lympho-myeloid+stem+cells+lacking+erythro-megakaryocytic+potential+a+revised+road+map+for+adult+blood+lineage+commitment.">Identification of Flt3+ lympho-myeloid stem cells lacking erythro-megakaryocytic potential a revised road map for adult blood lineage commitment.</a> Cell. 121, 295-306 (2005).</li><li>Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clonogenic+common+lymphoid+progenitors+in+mouse+bone+marrow.">Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow.</a> Cell. 91, 661-672 (1997).</li><li>Bhandoola, A., von Boehmer, H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commitment+and+developmental+potential+of+extrathymic+and+intrathymic+T+cell+precursors:+plenty+to+choose+from.">Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from.</a> Immunity. 26, 678-689 (2007).</li><li>Ramond, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+waves+of+distinct+hematopoietic+progenitor+cells+colonize+the+fetal+thymus.">Two waves of distinct hematopoietic progenitor cells colonize the fetal thymus.</a> Nat Immunol. 15, 27-35 (2014).</li><li>Allison, J. P., Havran, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunobiology+of+T+cells+with+invariant+gamma+delta+antigen+receptors.">The immunobiology of T cells with invariant gamma delta antigen receptors.</a> Annu Rev Immunol. 9, 679-705 (1991).</li><li>Anderson, G., Jenkinson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+thymus+organ+culture.">Fetal thymus organ culture.</a> CSH Protoc. , (2007).</li><li>Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+T+cell+development+from+hematopoietic+progenitor+cells+by+delta-like-1+in+vitro.">Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro.</a> Immunity. 17, 749-756 (2002).</li><li>Barbee, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skint-1+is+a+highly+specific,+unique+selecting+component+for+epidermal+T+cells.">Skint-1 is a highly specific, unique selecting component for epidermal T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 3330-3335 (2011).</li><li>Douagi, I., Colucci, F., Di Santo, J. P., Cumano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+earliest+prethymic+bipotent+T/NK+progenitor+in+murine+fetal+liver.">Identification of the earliest prethymic bipotent T/NK progenitor in murine fetal liver.</a> Blood. 99, 463-471 (2002).</li><li>Malissen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+T+cell+development+in+mice+with+a+targeted+mutation+of+the+CD3-epsilon+gene.">Altered T cell development in mice with a targeted mutation of the CD3-epsilon gene.</a> EMBO J. 14, 4641-4653 (1995).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

שני מבחני עיקריים ניתן להשתמש כדי לנתח התמיינות תאי T vivo לשעבר. דיווח לאחרונה היא התרבות המשותפת של אבות hematopoietic עם תאי סטרומה בע&quot;מ, OP9, המבטא את ligands של Noth1, דלתא כמו 1 או 4 12. Assay 2-D זה קל לביצוע, יעיל ורגיש מאוד, המאפשר ניתוח ב רמת התא הבודד. עם זאת, זה לא תומך בפ...

לימפוציטים מסוג T, הנושא את αβ או γδ קולט תא T (TCR), להבדיל באיבר מיוחד, התימוס. התימוס מפותח מאורגן בשני אזורים נפרדים: הקליפה, שבו אבות הרתי לפתח ובי thymocytes שפרודוקטיבית לסדר מחדש את β TCR וגני שרשרת α הם הצילו ממוות מתוכנת (תהליך המכונה סלקציה חיובית); והלשד, שבו נבחר thymocytes עם תגובתיות חזקה מדי לligands העצמי נמחקים (סלקציה שלילית) 1,2. התימוס מקור שכבת endodermal של כיס בלוע השלישי שהוא מוקף מאוחר יותר על ידי תאי mesenchymal 3. הוא יישב על ידי אבות hematopoietic מתחילים ביום עוברי E12 ו, לאחר מכן, גיוס רציף נדרש לפיתוח תא T הרגיל 4. עולים הרתי להתפתח דרך שלבי התפתחות רצופים, בניצוחו של תכנית בחוזקה מוסדרת, יזם ומאיntained על ידי ההפעלה של מסלול האיתות של Notch על thymocytes על אינטראקציה עם ליגנד, דלתא כמו 4, הביע בתאי אפיתל הרתי (Tecs) 5. פיתוח Thymocyte מתחיל בCD4 שנקרא - CD8 - שלילי כפול שלבים (DN). thymocytes DN ניתן מחולק חלוקה נוסף על פי הביטוי של CD25 וCD44 לDN1 (CD25 - CD44 +), DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) וDN4 (CD25 - CD44 -). CD24 (HSA) וCD117 (c-kit) subdivides נוסף תא DN1 ל -5 תת בי DN1a וב מתאים לאבות המוקדמים הרתי (ETP). Thymocytes לסדר מחדש את רשתות δ, β α וTCR בשלב DN ולעבור בחירה מראש TCR (שלבי DN3-DN4). הם עוד מעבר לCD4 + CD8 + התא החיובי כפול (DP) שבו שרשרת α TCR מארגנת מחדש לפני Sele גודל חיובי והשליליסיפורת. בשלב זה רוב thymocytes בוטלו ורק אחוז קטן (3-5%) להגיע + CD4 או CD8 + T תא בוגר תא. מסלול בידול הלימפה מתקדם בשלבים של HSCs שיוצרים אבות multipotent (MPP) ואבות-דרוך הלימפה multipotent (LMPP) שאיבדו כדורית אדומה וmegakaryocyte פוטנציאל 6. LMPP מוגדר phenotypically בהעדר סמנים של תאי דם מובחנים (שושלת שלילית, לין -), הביטוי של c-kit (CD117), SCA-1 וFLT3 / Flk2 (CD135) והעדר הרמות לזיהוי של אינטרלוקין ( IL) -7 קולט α שרשרת (IL-7rα או CD127). LMPPs נוסף להבדיל לאבות משותפים הלימפה (CLP) 7 כי על ידי השלב שאיבדו את היכולת לייצר תאי מיאלואידית. CLP לשמור הלימפוציטים (B ותאי T), תא NK, DC ותא הלימפה המולדת פוטנציאלי (ILC), ושונה מLMPP על ידי הביטוי של CD127 והעדר הרמות גבוהות של SCA-1. למרות שהטבע של אבות הרתי יישוב (TSP) כבר התווכח 8 בהרחבה, זה הפך לאחרונה ברור ששינוי TSP פנוטיפ, פוטנציאל התמיינות ותפקוד, בכל פיתוח 9. ביצענו במבחנה ובמבחני vivo לאפיין את כפית, מבודדת על ידי תא FACS מיון משני E13 (הגל הראשון) או E18 (גל שני). תרבויות עוברית הרתי איבר (FTOC) עם אונות הרתי מוקרנת יישבו על ידי מספר שווה של אבות E13 וE18, הנושאים סמני allotypic שונים, אפשרו הבא צאצאיהם בסביבת התפתחותית דומה וגילו מאפיינים פנימיים תא, שונים בין שני הסוגים של אבות. אונות הרתי יישבו גם על ידי E13 או E18 TSP אפשרו פיתוח ללא בחירה בשל תחרות בין שני האבות. השתלת vivo של האונות הרתי מתנחלות, הראתה עוד, כי גם לאיש לו צאצאים בוגרים של E13 וE18 TSP מאפיינים ביולוגיים שונים בגוף חי. TSPs מהגל הראשון במהירות לייצר תאי T אבל להצמיח מספרים נמוכים של αβ וγδ תאי T. בקרב האחרון זיהינו תאים דנדריטים Vγ5Vδ1 אפיתל T (DETC), שיש לי TCR משתנה, להגר לעור שבו הם מפעילים פונקציה בריפוי פצעים ומיוצרים רק במהלך התפתחות עוברית 10. לעומת זאת, כפית מהגל השני תיקח זמן רב יותר כדי ליצור מספרים גבוהים של תאי TCR + T ולא מצליחה ליצור DETC.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture petri dishes.</td>
			<td>TPP</td>
			<td>T93100/T9340</td>
			<td>Sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26GA 3/8 IN 0.45x10mm syringes with needles Beckton-Dickinson Plastipak.</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>300015</td>
			<td>Cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces.</td>
			<td>SEFAR NITEX</td>
			<td>03-100/32</td>
			<td>Filtration of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%.</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83801.36</td>
			<td>Sterility Actions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodide Povidone 10% (Betadine)&#160;</td>
			<td>MEDA Pharma</td>
			<td>314997.8</td>
			<td>Sterility Actions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine 100mg/ml (stock solution)</td>
			<td>MERIAL</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>Anesthesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 100mg/ml in PBS (stock solution)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X1251-1G</td>
			<td>Anesthesic and muscle relaxant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphin 0.3mg/ml stock solution</td>
			<td>AXIENCE</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>Morphinic analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin)</td>
			<td>Schering-Plough Animal Health</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>Eyes protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (+ CaCl2, MgCl2)</td>
			<td>GIBCO Life Technology</td>
			<td>14040-174</td>
			<td>to isolate embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS Hanks&#39; Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2)</td>
			<td>GIBCO Life Technology</td>
			<td>24020-091</td>
			<td>to wash out the blood and dissect the embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM I GlutaMAX I</td>
			<td>GIBCO Life Technology</td>
			<td>51985-026</td>
			<td>Medium for cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F&#339;tal Calf serum</td>
			<td>EUROBIO</td>
			<td>CVFSVF00-0U</td>
			<td>additive for cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin and Streptomycin</td>
			<td>GIBCO Life Technology</td>
			<td>15640-055</td>
			<td>Antibiotics for cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 b mercapto ethanol</td>
			<td>GIBCO Life Technology</td>
			<td>31350010</td>
			<td>additive for cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA MZ6 Dissection microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>MZ6 10445111</td>
			<td>Occular W-Pl10x/23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold lamp source</td>
			<td>SCHOTT VWR</td>
			<td>KL1500 compact</td>
			<td>Two goose neck fibers adapted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Dissecting Pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spoon, round and perforated</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-18</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Iris Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps : Dumont #5/45 Inox 11 cm</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11253-25</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two pairs of fine straight watchmakers&#8217; forceps Dumont #5 11 cm fine tips.</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-20</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyamid thread with needle 6-0&#160;&#160; C-3 3/8c</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>F2403</td>
			<td>for sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle-holder</td>
			<td>MORIA/F.S.T.</td>
			<td>12060-02</td>
			<td>for sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100229-100</td>
			<td>To maintain mouse temperature during anesthesy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Isopore RTTPO2500</td>
			<td>DUTSCHER</td>
			<td>44210</td>
			<td>For FTOC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terasaki 60 wells plates</td>
			<td>FISHER</td>
			<td>1x270 10318801</td>
			<td>For hanging drop technique</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze swabs steriles 7.5cmx7.5cm</td>
			<td>Hydrex</td>
			<td>11522</td>
			<td>To apply disinfecting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence or biotin labelled antibodies</td>
			<td>BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences&#160;</td>
			<td>Clone Number see table below</td>
			<td>Staining cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Columns/Streptavidin Microbeads&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401/130-048-101</td>
			<td>Cell depletion&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs&#160; (CD45.2)</td>
			<td>C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2</td>
			<td>Source of cells and thymic lobes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>CDTA Orl&#233;ans, France</td>
			<td>CD 3 epsilon Ko CD45.2</td>
			<td>&#160;Grafting experiment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of thymic settling progenitors in the mouse embryo using in vivo and in vitro assays

אפיון אבות הרתי יישוב חשוב להבין השלבים טרום-הרתי של פיתוח תאי T, חיוני לתכנן אסטרטגיות להחלפת תאי T בחולי lymphopenic. למדנו הרתי יישוב אבות מיום עכברי עוברי 13 ו -18 thymi ידי שני משלימים במבחנה ובטכניקות vivo, שני מבוססים על השיטה &quot;טיפה תלויה&quot;. שיטה זו אפשרה התיישבות אונות הרתי עובריות מוקרנת עם E13 ו / או E18 אבות הרתי המאופיין בסמני CD45 allotypic וכך הבאים צאצאיהם. התיישבות עם אוכלוסיות מעורבות מאפשרת ניתוח הבדלים אוטונומיים תא בנכסים ביולוגיים של האבות בעוד התישבות גם עם אוכלוסייה מסירה לחצים סלקטיביים תחרותיים אפשריים. יכולות גם להיות מורכבים אונות הרתי יישבו בעכברי immunodeficient זכר נמען מאפשרים הניתוח של צאצאי תא T הבוגרים in vivo, כגון דינמיקת אוכלוסייה של tהוא היקפי מערכת וקולוניזציה של רקמות ואיברים שונים חיסוניות. תרבויות איבר הרתי עוברית גילו כי אבות E13 התפתחו במהירות לכל בוגרים CD3 + תאים והולידו את קבוצת המשנה של תאי T γδ הקנונים, המכונה תאי T אפיתל הדנדריטים. לשם השוואה, יש לי אבות E18 בידול מושהה ולא הצליחו לייצר תאי T אפיתל הדנדריטים. הניטור של דם ההיקפי של CD3-מורכבים התימוס - / - עכברים הראה עוד, כי אבות הרתי E18 יישוב ליצור, עם זמן, מספר גדול יותר של תאים הבוגרים T מאשר עמיתיהם E13, תכונה שלא ניתן הייתה להערכה בהרתי העוברי לטווח הקצר תרבויות איברים.

כדי לבחור שיטה לרוקן אונות הרתי של thymocytes אנדוגני המאפשר הפיתוח הטוב ביותר של אבות התיישבות, השווינו את הרמות של הכינון מחדש של תאי T באונות הרתי יישבו לאחר הקרנה או deoxy-guanosine 5 ימים טיפול (ד-גואה). התוצאות מראות כי בעוד שאין הבדל ביום 9 של תרבות, אונות מוקרנים הכילו יותר ת?...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays at JoVE.com

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

אפיון של הרתי יישוב אבות בעובר העכבר באמצעות<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

characterization-thymic-settling-progenitors-mouse-embryo-using-vivo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

8.2K Views.  Institut Cochin. This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny. 

Video: Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

ביים הבידול של אבות Hematopoietic פרימיטיבי, מהווים הסופית מתאי גזע Pluripotent אנושי

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where they act as front line sentinels of infection and tissue damage. While other immune cells are continuously renewed from hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) located in the bone marrow, a lineage of macrophages, known as resident macrophages, have been shown to be self-maintained in tissues without input from bone marrow HSPCs. This lineage is exemplified by microglia in the brain, Kupffer cells in the liver and Langerhans cells in the epidermis among others. The intestinal and colon lamina propria are the only adult tissues devoid of HSPC-independent resident macrophages. Recent investigations have identified that resident macrophages originate from the extra-embryonic yolk sac hematopoiesis from progenitor(s) distinct from fetal hematopoietic stem cells (HSC). Among yolk sac definitive hematopoiesis, erythromyeloid progenitors (EMP) give rise both to erythroid and myeloid cells, in particular resident macrophages. EMP are only generated within the yolk sac between E8.5 and E10.5 days of development and they migrate to the fetal liver as early as circulation is connected, where they expand and differentiate until at least E16.5. Their progeny includes erythrocytes, macrophages, neutrophils and mast cells but only EMP-derived macrophages persist until adulthood in tissues. The transient nature of EMP emergence and the temporal overlap with HSC generation renders the analysis of these progenitors difficult. We have established a tamoxifen-inducible fate mapping protocol based on expression of the macrophage cytokine receptor Csf1r promoter to characterize EMP and EMP-derived cells in vivo by flow cytometry.

While infiltrating macrophages are continuously recruited to adult tissues from circulating precursors, resident macrophages seed their tissue during development, where they are maintained without further input from progenitors. The progenitors for resident macrophages were recently identified. Here, we present methods for the genetic fate mapping of the resident macrophage progenitors.

זיהוי של אבות אריתרומיאלואידים צאצאיהם בעובר עכבר על ידי זרימת cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג&#39;ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

תא מבחני צבירה כדי להעריך את הכריכה של החריץ דרוזופילה עם טרנס-ליגנדים וניגוד שלה על ידי חבר העמים-ליגנדים

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

דור של אינסולין נטולת לגרדום, תלת מימדי לבטא Pancreatoids העכבר אבות הלבלב במבחנה

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Microinjection-מערכת מבוססת עבור-Vivo השרשת Cardiomyocytes עובריים בתוך העובר העופות

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

בידול ואפיון של אבות עצביים ונוירונים מתאי גזע עובריים של עכבר

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. Traditional pharmacological disruption of the ubiquitous microtubule network using, for instance, nocodazole can have devastating consequences for any cell. Reversibly photoswitchable microtubule inhibitors have the potential to overcome the limitations by enabling drug effects to be implemented in a spatiotemporally-controlled manner. One such family of drugs is the azobenzene-based photostatins (PSTs). These compounds are inactive in dark conditions, and upon illumination with UV light, they bind to the colchicine-binding site of &#946;-tubulin and block microtubule polymerization and dynamic turnover. Here, the application of PSTs in the 3-dimensional (3D) live preimplantation mouse embryo is set out to disrupt the microtubule network on a subcellular level. This protocol provides instructions for the experimental setup, as well as light activation and deactivation parameters for PSTs using live-cell confocal microscopy. This ensures reproducibility and enables others to apply this procedure to their research questions. Innovative photoswitches like PSTs may evolve as powerful tools to advance the understanding of the dynamic intracellular microtubule network and to non-invasively manipulate the cytoskeleton in real-time. Furthermore, PSTs may prove useful in other 3D structures such as organoids, blastoids, or embryos of other species.

Typical microtubule inhibitors, used widely in basic and applied research, have far-reaching effects on cells. Recently, photostatins emerged as a class of photoswitchable microtubule inhibitors, capable of instantaneous, reversible, spatiotemporally precise manipulation of microtubules. This step-by-step protocol details the application of photostatins in a 3D live preimplantation mouse embryo.