Name: characterization of thymic settling progenitors in the mouse embryo using in vivo and in vitro assays
Uploaded: 2015-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays at JoVE.com

Unterstützt durch das Institut Pasteur, INSERM, Agence Nationale de Recherche ANR (Grant Lymphopoese &#39;), der REVIVE Zukunftsinvestitionsprogramm und &quot;La Ligue contre le Cancer&quot;.

Ethics Hinweise: Alle Experimente wurden nach dem Pasteur-Institut Ethik-Charta, von der Französisch Landwirtschaftsministerium genehmigt durchgeführt und an die EU-Richtlinien. Ein Manipulator mit Training am Kleintier-Chirurgie, von der Französisch Ministerium für Landwirtschaft zertifiziert, führt alle chirurgischen Eingriffen. HINWEIS: Siehe Anhang in Tabelle 1, die das 5-Stufen-Plan Verfahren. 1. Auswahl der Embryonen <ol><li> Verwenden Sie 36 C57BL / 6 CD45.2 Frauen, 12 Frauen CD45.1, 12 C57BL / 6 CD45.1 Männer und 12 C57BL / 6 CD45.2 Männer. Überschreiten der Weibchen mit entweder männlich Genotyp erzeugen Embryonen CD45.1 / 2 und CD45.1 als Quelle von TSP oder CD45.2 als Quelle des Empfängers Thymus Keulen verwendet. Haus alle Männer einzeln. </li><li> Embryonen für E18 TSP Isolation zu erhalten, setzen Sie 2 Hündinnen in einem Käfig mit einem Männchen CD45.1 um 6 Uhr, 21 Tage vor dem Pfropfen Experiment. Prüfen Sie das Vorhandensein einer vaginalen Stecker am nächsten Tag, vor Mittag. Sepabewerten die eingesteckt Weibchen. </li><li> Um E14 Embryonen zu erhalten, die von TSP besiedelt werden, wiederholen Sie den Vorgang oben (1.2), mit Männern CD45.2, 17 Tage vor dem Pfropfen Experiment. </li><li> Embryonen zu E13 TSP isolieren zu erhalten, wiederholen Sie den Vorgang oben (1.2), mit Männern C57BL / 6 CD45.1, 16 Tage vor dem Pfropfen Experiment. </li></ol> 2. Dissection des Embryos unter einem Horizontal Laminar Flow Hood Anmerkung: Zwei Tage vor der Transplantation Experiments. <ol><li> Opfern, die schwangeren Frauen durch Genickbruch oder durch fortschreitende Verwaltung von CO 2 -Gas während mindestens 5 min, in einem geschlossenen Raum zu sättigen. Achten Sie darauf, den Tod durch endgültige Festnahme von Herz-Kreislauf-Atembewegungen. Befeuchten Sie den Bauch mit 70% Ethanol. </li><li> Einen Längsschnitt in der Haut an der Mittellinie Bauch und öffnen Sie sie durch Ziehen der Haut auseinander. Öffnen Sie das Bauchfell mit einer Pinzette und Schere, ohne den Verdauungstrakt. Ziehen Sie das gespaltene uteruns und trennen es von der Vagina mit der Schere. </li><li> Legen Sie die Gebärmutter in einem 90 x 15 mm Petrischale mit 40-50 ml DPBS und schneiden quer zwischen jedem Embryo decidua. </li><li> Mit dem Paar von feinen Spitze Schere und einer feinen Pinzette entfernen Sie die Muskelmembran der Gebärmutter, nehmen Sie die Embryonen durch Schneiden zwischen der Plazenta und der Dottersack, und entfernen Sie die amnios, die Beibehaltung ist die Embryonen. </li><li> Zeigen die Embryonen in einer Petrischale 90 x 15 mm enthält HBSS + 1% fötales Kälberserum (FCS). Für Embryonen älter als E15, entfernen Sie die Köpfe mit einer Schere vor jeder weiteren Präparation. </li></ol> 3. Isolierung des Thymus <ol><li> Unter der binokularen Vergrößerungslinse, setzen Sie den Embryo, liegend in Rückenlage (ventral), auf einem nassen Gaze Betten. </li><li> Legen Sie eine Pinzette in Längsrichtung entlang der Knorpel des Brustbeins, kneifen und öffnen Sie die Brust-Netz. Mit einer gebogenen Pinzette, ziehen Sie den Brustwand zur Seite, um die t visualisierenhymic Nocken an jeder Seite der Luftröhre. </li><li> Sorgfältig halten jeder Lappen von unterhalb Kneifen mit einer feinen Pinzette und legen Sie sie in eine Petrischale mit 1 ml HBSS + 1% FCS. Isolieren Sie die Lappen und entfernen umgebende Bindegewebe mit zwei 1 ml-Spritzen + 26 G ⅜ &quot;Nadeln, ohne Beschädigung der Kapsel. </li><li> Waschen der Lappen in 3 ml HBSS + 1% FCS, um Blutzellen zu eliminieren. Hinweis: Vor dem E15 sind Thymus Nocken an jeder Seite der Luftröhre und später Sicherung in der Mitte angeordnet, um eine bi-lobar Organ bilden. </li></ol> 4. Zellsuspensionen <ol><li> Necken neben die Lappen unter der binokularen Vergrößerungslinse, mit zwei 26 G Nadeln auf 1 ml Spritzen montiert, in HBSS + 1% FCS. Filtern der Zellsuspension durch ein Nylonnetz. </li></ol> 5. Färbung mit fluoreszierenden Antikörpern und Zellsortierung HINWEIS: Alle Antikörper werden zuvor titriert, um eine optimale Definition der Bevölkerung (die titrat erhaltenIon kann mit dem Antikörper Charge variieren). <ol><li> Thymozyten (E13 oder E18) für 15-30 min Inkubation bei 4 ° C mit 100 &amp; mgr; l eines Cocktails von biotinyliertem Antikörper an Linie positive Zellen zu färben (anti-CD19, anti-Gr1, anti-Ter119, anti-NK1.1 , anti- CD11c, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25). </li><li> Abzuwaschen Überschuss an Antikörpern Spin-Down der Röhrchen mit 4 ml HBSS + 1% FCS bei 280 g für 7 min, Beseitigung des Überstandes und Resuspendieren des Pellets in frischem HBSS + 1% FCS. Wiederholen Sie die Zentrifugation. </li><li> E18 Biotin-markierten Zellen mit Streptavidin-Microbeads inkubiere 15 Minuten bei 4 ° C und wäscht die Zellen zweimal in HBSS 1% FCS. Wieder die Zellen in 2 ml HBSS + 1% FCS. Esten E13 Thymozyten Linie negativ und daher nicht MACS Anreicherung vor der Zellsortierung benötigen. </li><li> Leiten die Zellen auf dem LS-Säule gemäß den Anweisungen des Herstellers. Wenn alle die Zellsuspension eingegeben die Säule 2 ml HBSS + 1% FCS. Wiederherstellen der4 ml der Säule durchfließen und Zentrifuge die Zellen für 7 min bei 280 x g. </li><li> Re-suspendieren des Pellets entweder abgereichertes E18 oder E13 gesamten Thymozyten in 50 ul TSP Antikörper mix (anti-CD117 APC, Anti-CD135 PE, anti-CD127 PECy7, anti-CD24-FITC, anti-CD44 APCCy7 und Streptavidin Pacific Blue ) und Inkubation für 20 min bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Die Zellen werden mit 4 ml HBSS + 1% FCS und Wieder die Zellen in 1 ml HBSS + 1% FCS mit Propidiumiodid. </li><li> Sortieren Sie die TSPs Lin - CD44 + CD117 + CD24 + CD135 CD127 niedrigen + Zellen in einem FACS (mit 4-Laser) auf eine 1,5-ml-Röhrchen mit 200 ul Vollmedium + 20% FCS. Tor zunächst die Zellen entsprechend ihrer Größe und Granularität auf der FSC und SSC-Kanäle. Eliminieren abgestorbene Zellen (Färbung mit Propidiumjodid), Gate-out Dubletten und Ergebnis der Fluoreszenz in exponentiellen Skalen. Rund 100 oder 600 FDA kann von einem E13 oder E18 ein Thymus, JEWEILIGEN erhältlichEly. </li></ol> 6. Colonization von E14 Thymic Lobes mit Vorläufern: Hanging-Drop-Technik <ol><li> Bestrahlen (30 Grays = 30 Gy) E14 Thymus Lappen aus CD45.2 Embryonen, 3 Stunden, bevor Kultur. HINWEIS: E14 oder E15 Thymus Lappen wurden erfolgreich als Empfänger der T-Zell-Vorläuferzellen verwendet. Verwendung Empfänger Thymus Lappen später Schwangerschaftstagen führt zu vorzeitigem Nekrose aufgrund der größeren Größe der Orgel während Thymus-Lappen in früheren Schwangerschafts Tagen entwickeln schlecht, wahrscheinlich aufgrund der unvollständigen Entwicklung der Epithelzellen. </li><li> Zentrifuge nach FDA und wieder die Zellen in Kulturmedium (OPTI-MEM komplettes Medium mit 10% FCS, Penicillin (50 Einheiten / ml), Streptomycin (50 ug / ml) und 2β-Mercaptoethanol (50 uM)), so daß 35 ul enthalten 500 TSP. </li><li> Legen Sie eine 35 ul Tropfen Zellsuspension jedes zweite Well einer 60 gut Terasaki Platte. HINWEIS: 35 ul Tropfen können fusionieren, wenn sie in zusammenhängende Vertiefungen gegeben werden. </li><li> Legen Sie einen Lappen auf der bestrahlten Oberfläche jeder Tropfen. Schließen Sie das Terasaki Platte und drehen Sie die Platte auf den Kopf die Zellen des apikalen Pol der Tropfen durch die Schwerkraft erreichen zu lassen. </li><li> Schlagen Sie vorsichtig die Oberseite der umgedrehten Platte die Lappen zu zwingen, sich an der apikalen Rand des Drop verschieben. Inkubieren des invertierten Terasaki Platte in einem befeuchteten Inkubator für 48 h bei 37 ° C + 5% CO 2. Nach der Kolonisierung entweder Kultur E14 Thymi in FTOC 7 oder Transplantat unter die Nierenkapsel eines Empfänger erwachsenen Maus 8. </li></ol> 7. Fetal Thymic Organ Culture <ol><li> Zeigen 3 ml Vollmedium auf einer 35 mm Petrischale. Ein isoporösen Membranfilter schwimmend auf dem Medium. Platzieren Sie die rekonstituierte Lappen am Rand der Membran mit einer Pinzette (nicht mehr als 8 Keulen auf einer Membran). </li><li> Legen Sie die Petrischalen mit den Thymus-Lappen in einem 90 mm-Petrischale, zusammen mit einem 35-mm-Schale, ohne Deckel, mit 2 ml water, um eine optimale Luftfeuchtigkeit zu gewährleisten. Inkubiere 12 Tage bei 37 ° C + 5% CO 2. </li></ol> 8. Grafts unter die Nierenkapsel unter sterilen Bedingungen HINWEIS: Die Nierenparenchyms durch Ausbilden einer Kapsel Bindegewebe umgeben. Der Teilkapsel Region ist besonders reich an Blut- und Lymphgefäße, wodurch ein geeignetes Umfeld für die Entwicklung von Transplantaten (zB Thymus Lappen, Langerhans-Inseln oder Neugeborenen Herzen). Transplantate werden normalerweise auf der linken Niere gemacht, weil sie leichter zugänglich als die rechte Niere ist. CD3 - / - männliche Mäuse wurden als Empfänger wodurch Transplantat-Wirt-Reaktion aufgrund Nebenhistokompatibilitätsantigene auf dem Y-Chromosom verbunden, weil die Geschlechtsbestimmung vor E15 ist nicht leicht getan verwendet. <ol><li> Sterilisieren der Instrumente und tragen sterile Handschuhe an der Operation. Betäuben der Maus durch intraperitoneale Injektion einer Lösung von Ketamin 10 mg / ml + Xylazin 1 mg /ml in PBS verdünnt (50 bis 100 &amp; mgr; l pro 10 g Körpergewicht), unter Verwendung einer 1 ml-Spritze. Stellen Sie sicher, Anästhesie, indem fehlende Inter Reflexe. Geben Sie einen Tropfen Hydro Optimune Gel auf jedes Auge bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern. HINWEIS: Die Lösung sollte aus dem Stegreif vorbereitet und erwärmt bei Raumtemperatur vor der Injektion werden. Die Betäubung Dauer von mindestens 20 min. Der Grad der Anästhesie sollte entlang der Operation kontrolliert werden. Die Anästhesie kann durch intraperitoneale Injektion von halbe Dosis alle 20 Minuten verlängert werden. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf der rechten Seite, unter einer horizontalen Lamina-Flow-Haube. Sterilisation des Operationsfeldes mit 70% Ethanol und 10% Iodid dermic Lösung. Mit einem Zangenteil die Maus Haare entlang eines 2 cm Länge direkt über dem Gelenk der Hinterhand. Rasieren Sie die OP-Bereich. </li><li> Mit einem Skalpell, einen Einschnitt 1,5 cm Länge der ersten, der Hautgewebe, dann mit einer Schere das Muskelgewebe. Anwenden eines leichten Druck auf beiden Seiten des Einschnitts, Die die Niere aus der Bauchhöhle zwingen wird. </li><li> Bewerben Kochsalzlösung mit einem Baumwollknospe, die Nieren feucht zu halten. Wenn Sie Schwierigkeiten bei der Freilegung der Orgel haben, verwenden Sie eine Flachzange, um die umliegende Gewebe Adipozyten, auf die die Niere angeschlossen ziehen. Pflegen Sie die Nieren aus dem retroperitonealen Hohlraum von einem Wattestäbchen unter der Orgel platziert. </li><li> Mit zwei feinen Pinzette, machen Sie eine 2-3 mm Loch in der Kapsel (berühren Sie nicht die Parenchym um Blutungen zu verhindern). Während des gesamten chirurgischen Eingriffs halten die freiliegenden Nierenkapsel kontinuierlich befeuchtet. </li><li> Setzen Sie sorgfältig die Lappen unter die Nierenkapsel, durch die Aufrechterhaltung der Wand der Kapsel geöffnet und schieben Sie das Transplantat unter der Kapsel zum Rand Pol. Platzieren Sie bis zu 6 Keulen pro Niere. </li><li> Ersetzen Sie die Niere in der retro-Bauchhöhle. Naht der Muskel Aponeurosen, dann die Haut mit einzelnen Chirurgen Knoten. Befeuchten Sie die Wunde mit 10% Iodid Povidonlösung. Platzieren Sie die Maus auf einer beheizten pad bei 37 ° C. </li><li> Umfrage der transplantierten Maus bis zur vollständigen Erholung von der Anästhesie durch Kontrolle der Herz-, Atemwegs- und Whisker-Bewegungen, Schleimhaut-Farben bis zur vollständigen Rückgewinnung von Selbst gesehen enthaltenen Bewegungen. HINWEIS: Wir empfehlen Injektion von schmerzstillende Lösung (Buprenorphin, 0,1 mg / kg) intra Muskel direkt nach der Operation und die 2 Tage nach der Operation, um postoperative Schmerzen zu verhindern. </li><li> Halten Sie das betrieben Tier isoliert, bis vollständig erholt. Untersuchen Sie jeden zweiten Tag die Stiche der Wunde zu überprüfen und zu verhindern Infektion. Nie beobachtet Wundinfektion nach diesem Verfahren. HINWEIS: wöchentliche Analyse von peripheren Blutzellen aus dem CD3 - / - Mäuse aufgepfropft uns erlauben, die Thymus-abgeleiteten Populationen entweder E13 oder E18-Vorläufern unter Verwendung der CD45 allotypische Marker und T-Zelllinie spezifische Antikörper (Abbildung 3) entstand detektieren. </li></ol> 9. Analyse des TSP Nachkommen mittels Durchflusszytometrie <ol><li&gt; Tease die FTOCs individuell auf Einzelzellsuspensionen (siehe Protokoll Abschnitt 4) zu erhalten. </li><li> Stain Zellsuspensionen aus einzelnen Lappen mit einem Antikörper Mischung, die Antikörper, die CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4 APCCy7, CD8 APC, CD3 Pacific Blue, Vγ5 FITC, PE Vδ1 und inkubieren, wie in Abschnitt 5 beschrieben. </li><li> Wieder die Zellen in HBSS + 1% FCS + Propidiumiodid und in einem Strömungs analysieren Zytometer (siehe Ergebnisse in Figur 2). </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Zwei Assays können verwendet werden, um T-Zell-Differenzierung ex vivo zu analysieren. Die zuletzt gemeldet ist die Co-Kultur von hämatopoetischen Vorläuferzellen mit BM-Stromazellen, OP9, Expression der Liganden der Noth1, delta wie 1 oder 4 12. Das 2-D-Assay ist leicht durchzuführen, sehr leistungsfähig und empfindlich, so dass bei Analyse Einzelzellebene. Es wird jedoch weder unterstützt T-Zell-Entwicklung über die Stufe der DP noch die Erzeugung von γδ DETC 13, die beide eine ...

T-Lymphozyten, wobei das αβ oder γδ T-Zell-Rezeptor (TCR), differenzieren in einem speziellen Organ, der Thymus. Die ausgereifte Thymus ist in zwei unterschiedliche Bereiche unterteilt: die Rinde, in der Thymus-Vorläuferzellen entwickeln und wo Thymozyten, die produktiv TCR β und α-Kette-Gene neu anordnen aus programmierten Tod (ein Verfahren, wie die positive Selektion bekannt) gerettet; und der Medulla, wo ausgewählt Thymozyten mit zu starke Reaktivität Selbstliganden werden gelöscht (negative Selektion) 1,2. Der Thymus stammt aus dem endodermalen Schicht der dritten Schlundtasche, die später von mesenchymalen Zellen 3 umgeben ist. Es wird von hämatopoetischen Vorläuferzellen ab Embryonaltag E12, und danach wird eine kontinuierliche Einstellung für den normalen T-Zell-Entwicklung 4 erforderliche besiedelt. Thymus Einwanderer entwickeln durch aufeinanderfolgende Entwicklungsstadien, von einem streng regulierten Programm, initiiert und inszeniert maidurch die Aktivierung des Notch-Signalwegs auf Thymocyten bei Wechselwirkung mit seinem Liganden, wie 4 delta ntained, ausgedrückt Thymusepithelzellen (TECs) 5. Thymozyten-Entwicklung beginnt bei der so genannten CD4 - CD8 - doppelt negativ (DN) Stufen. , DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) und DN4 (CD25 - CD44 -) - DN Thymozyten kann weiter gemäß der Expression von CD25 und CD44 in DN1 (CD44 + CD25) unterteilt werden. CD24 (HSA) und CD117 (c-Kit) weiter unterteilt die DN1 Fach in 5 Untergruppen, wo DN1A und b entsprechen frühen Vorläuferzellen des Thymus (ETP). Thymozyten neu anordnen TCR δ, β und α-Ketten an der DN Bühne und pre-TcR Auswahl (DN3-DN4 Stufen) zu unterziehen. Sie Transit auf die CD4 + CD8 + doppelt positiven (DP) Fach, in dem der TCR α-Kette lagert sich vor der positiven und negativen selection. In dieser Phase am meisten Thymozyten eliminiert werden und nur ein kleiner Anteil (3-5%) zu erreichen, die den CD4 + oder CD8 + T-Zellen zu reifen Fach. Die lymphatischen Differenzierungsweg schreitet durch die Stadien der HSCs, die multipotenten Vorläuferzellen (MPP) und lymphatischen grundiert multipotenten Vorläuferzellen (LMPP), die die Erythrozyten und Megakaryozyten Potential 6 verloren zu generieren. LMPP phänotypisch durch das Fehlen von differenzierten Blutzellmarker definiert (Linie negativ, Lin -), die Expression von c-Kit (CD117), Sca-1 und Flt3 / Flk2 (CD135) und das Fehlen von nachweisbaren Konzentrationen an Interleukin ( IL) -7-Rezeptor-α-Kette (IL-7rα oder CD127). LMPPs weiter zu differenzieren, die in Stamm lymphatischen Vorläuferzellen (CLP) 7, dass von diesem Zeitpunkt haben die Fähigkeit, myeloischen Zellen erzeugen verloren. CLP behalten Lymphozyten (B- und T-Zelle), NK-Zelle DC und angeborenen lymphoiden Zelle (ILC) Potential, und unterscheiden sich von LMPP durch die Expression von CD127 und das Fehlen von hohen Sca-1. Obwohl die Art der Thymus Beilegung Vorläuferzellen (TSP) wurde ausgiebig diskutiert 8, vor kurzem wurde klar, dass TSP Änderung Phänotyp, Differenzierungspotenzial und Funktion, während der gesamten Entwicklung 9. Wir führten in vitro und in vivo-Tests, um die TSP, durch FACS-Zellsortierung entweder von E13 (erste Welle) oder E18 (zweite Welle) isoliert kennzeichnen. Fetalen Thymus Organkulturen (FTOC) mit bestrahlten Thymus Lappen kolonisiert durch die gleiche Anzahl von E13 und E18 Vorläuferzellen, die verschiedene allotypische Marker, im Anschluss an ihre Nachkommen in einer ähnlichen Entwicklungsumgebung erlaubt und offenbarte Zelle innewohnenden Eigenschaften, unterschiedlich zwischen beiden Arten von Vorläuferzellen. Thymus Lappen entweder E13 oder E18 TSP kolonisiert erlaubt Entwicklung ohne Selektion aufgrund der Konkurrenz zwischen den beiden Vorläufern. In vivo Transplantation der kolonisierten Thymus Lappen weiter gezeigt, dass auch ter reifen Nachkommen von E13 und E18 TSP haben unterschiedliche biologische Eigenschaften in vivo. FDA von der ersten Welle schnell generieren T-Zellen, sondern führen zu geringen Anzahl von αβ und γδ T-Zellen. Unter den letzteren entdeckten wir Vγ5Vδ1 dendritischen epithelialen T-Zellen (DETC), die eine Invariante TcR, wandern in die Epidermis, wo sie eine Funktion, bei der Wundheilung ausüben und werden nur während der Embryonalentwicklung 10 hergestellt haben. Im Gegensatz dazu TSP aus der zweiten Welle zu nehmen längere Zeit, um eine hohe Zahl von TcR + T-Zellen zu erzeugen und sind unfähig, DETC generieren.

<table><tbody><tr><td>90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture Petri dishes.</td><td>TPP</td><td>T93100/T9340</td><td>Sampling</td></tr><tr><td>26 G &amp;frac38;&quot; 0.45 x 10 mm syringes with needles</td><td>BD Plastipak</td><td>300015</td><td>Cell suspension</td></tr><tr><td>Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces.</td><td>SEFAR NITEX</td><td>03-100/32</td><td>Filtration of cells</td></tr><tr><td>Ethanol 70%.</td><td>VWR</td><td>83801.36</td><td>Sterility actions</td></tr><tr><td>Iodide Povidone 10% (Betadine)</td><td>MEDA Pharma</td><td>314997.8</td><td>Sterility actions</td></tr><tr><td>Ketamine 100 mg/ml (stock solution)</td><td>MERIAL</td><td></td><td>Anesthesic</td></tr><tr><td>Xylazine 100 mg/ml in PBS (stock solution)</td><td>Sigma</td><td>X1251-1G</td><td>Anesthesic and muscle relaxant</td></tr><tr><td>Buprenorphin 0.3 mg/ml stock solution</td><td>AXIENCE</td><td></td><td>Morphinic analgesic</td></tr><tr><td>Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin)</td><td>Schering-Plough Animal Health</td><td></td><td>Eye protection</td></tr><tr><td>DPBS (+ CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>14040-174</td><td>to isolate embryos</td></tr><tr><td>HBSS Hanks&#039; Balanced Salt Solution (+ CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>24020-091</td><td>to wash out the blood and dissect the embryos</td></tr><tr><td>OPTI-MEM I GlutaMAX I</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>51985-026</td><td>Medium for cultures</td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>EUROBIO</td><td>CVFSVF00-0U</td><td>additive for cultures</td></tr><tr><td>Penicilin and streptomycin</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>15640-055</td><td>Antibiotics for cultures</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>31350010</td><td>additive for cultures</td></tr><tr><td>LEICA MZ6 Dissection microscope</td><td>LEICA</td><td>MZ6 10445111</td><td>Occular W-Pl10x/23</td></tr><tr><td>Cold lamp source</td><td>SCHOTT VWR</td><td>KL1500 compact</td><td>Two goose neck fibers adapted</td></tr><tr><td>Silicone elastomer</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Dissecting Pad</td></tr><tr><td>Spoon, round and perforated</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-18</td><td>Dissection tools</td></tr><tr><td>Fine iris scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td>Dissection tools</td></tr><tr><td>Vannas spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td>Dissection tools</td></tr><tr><td>Forceps: Dumont #5/45 Inox 11 cm</td><td>F.S.T.</td><td>11253-25</td><td>Dissection tools</td></tr><tr><td>2 pairs of fine straight watchmakers&amp;rsquo; forceps Dumont #5 11 cm fine tips.</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-20</td><td>Dissection tools</td></tr><tr><td>Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c</td><td>ETHICON</td><td>F2403</td><td>for sutures</td></tr><tr><td>Needle-holder</td><td>MORIA/F.S.T.</td><td>12060-02</td><td>for sutures</td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>VWR</td><td>100229-100</td><td>To maintain mouse temperature during anesthesy</td></tr><tr><td>Membrane Isopore RTTPO2500</td><td>DUTSCHER</td><td>44210</td><td>For FTOC</td></tr><tr><td>Terasaki 60 wells plates</td><td>FISHER</td><td>1x270 10318801</td><td>For hanging drop technique</td></tr><tr><td>Gauze swabs steriles 7.5 x 7.5 cm</td><td>Hydrex</td><td>11522</td><td>To apply disinfecting solution</td></tr><tr><td>Fluorescence or biotin labelled antibodies</td><td>BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences&amp;nbsp;</td><td>Clone Number see table below</td><td>Staining cells</td></tr><tr><td>MACS Columns/Streptavidin Microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401/130-048-101</td><td>Cell depletion</td></tr><tr><td>Mice</td><td>Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs&amp;nbsp; (CD45.2)</td><td>C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2</td><td>Source of cells and thymic lobes</td></tr><tr><td>Mice</td><td>CDTA Orl&amp;eacute;ans, France</td><td>CD 3 epsilon Ko CD45.2</td><td>Grafting experiment</td></tr></tbody></table>

characterization of thymic settling progenitors in the mouse embryo using in vivo and in vitro assays

Charakterisieren Thymus Absetzen Vorläufern ist wichtig, die pre-Thymus Stufen T-Zell-Entwicklung zu verstehen, wesentlich, Strategien für T-Zell-Ersatz in lymphopenischen Patienten zu erstellen. Wir untersuchten Thymus Beilegung Vorläuferzellen aus murinen embryonalen Tag 13 und 18 Thymi durch zwei komplementäre in vitro und in vivo-Techniken, die beide auf der Grundlage des &quot;hängenden Tropfen&quot; Methode. Diese Methode erlaubt besiedeln bestrahlten fetalen Thymus Keulen mit E13 und / oder E18 Thymus-Vorläuferzellen durch CD45 allotypische Marker und damit im Anschluss an ihre Nachkommen aus. Colonization mit gemischter Bevölkerung ermöglicht die Analyse Zell autonomen Unterschiede in biologischen Eigenschaften der Vorläuferzellen während Besiedlung mit entweder Bevölkerung beseitigt mögliche Wettbewerbsselektionsdruck. Die Kolonisierten Thymus Lappen kann auch in immundefizienten männlichen Empfängermäuse ermöglicht die Analyse der reifen T-Zellen-Nachkommen in vivo, wie Populationsdynamik von t aufgepfropft werdener peripheren Immunsystem und Besiedlung von verschiedenen Geweben und Organen. Fötalem Thymus-Organkulturen zeigte, dass E13 Vorläufern entwickelt sich rasch in alle reifen CD3 + Zellen und führten zu der kanonischen γδ T-Zell-Untergruppe, wie dendritische epithelialen T-Zellen bekannt. Im Vergleich dazu haben E18 Vorläuferzellen eine verzögerte Differenzierung und konnten dendritische epithelialen T-Zellen zu erzeugen. Die Überwachung der peripheren Blut von Thymus-gepfropft CD3 - / - Mäuse zeigten weiter, dass E18 Thymus Beilegung Vorläuferzellen zu erzeugen, mit der Zeit, eine größere Anzahl von reifen T-Zellen als ihre Gegenstücke E13, eine Funktion, die nicht in der kurzen Frist fetalen Thymus geschätzt werden konnte Organkulturen.

Um ein Verfahren zum Thymus Keulen endogener Thymozyten ermöglicht die beste Entwicklung der Kolonisierung Vorläufern führen zu wählen, verglichen wir das Niveau von T-Zell-Rekonstitution in Thymus Keulen nach Bestrahlung kolonisiert oder eine 5-Tage-desoxy-guanosin (d-Gua) Behandlung. Die Ergebnisse zeigen, dass, obwohl es keinen Unterschied am Tag 9 der Kultur enthaltenen bestrahlt Lappen mehr T-Zellen als jene mit d-Gua behandelt, am Tag 12. Somit ist die Bestrahlung geeigneter als d-Gua-Behandlung an T-Zell-Entw...

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Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Charakterisierung von Thymic Einschwingzeit Vorläufern in der Mouse Embryo Verwendung<em&gt; In Vivo</em&gt; Und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

8.2K Aufrufe.  Institut Cochin. This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny. 

Serie: Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse this scaffold in a highly coordinated temporal and spatial order while sequentially passing obligatory check points, i.e., T cell lineage commitment, followed by T cell receptor repertoire generation and selection prior to their export into the periphery. The two major resident cell types forming this scaffold are cortical (cTECs) and medullary thymic epithelial cells (mTECs). A key feature of mTECs is the so-called promiscuous expression of numerous tissue-restricted antigens. These tissue-restricted antigens are presented to immature thymocytes directly or indirectly by mTECs or thymic dendritic cells, respectively resulting in self-tolerance.
Suitable in vitro models emulating the developmental pathways and functions of cTECs and mTECs are currently lacking. This lack of adequate experimental models has for instance hampered the analysis of promiscuous gene expression, which is still poorly understood at the cellular and molecular level. We adapted a 3D organotypic co-culture model to culture ex vivo isolated mTECs. This model was originally devised to cultivate keratinocytes in such a way as to generate a skin equivalent in vitro. The 3D model preserved key functional features of mTEC biology: (i) proliferation and terminal differentiation of CD80lo, Aire-negative into CD80hi, Aire-positive mTECs, (ii) responsiveness to RANKL, and (iii) sustained expression of FoxN1, Aire and tissue-restricted genes in CD80hi mTECs.

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

3D Organotypische Cokulturmodell Unterstützung Mark Thymusepithel Zellproliferation, Differenzierung und Genexpression Promiscuous

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development. To follow the migration of individuals in a crowd of thymocytes , we generate neonatal chimeras where less than one percent of the thymocytes are derived from a donor that is transgenic for a ubiquitously express fluorescent protein. To generate these partial hematopoetic chimeras, neonatal recipients are injected with bone marrow between 3-7 days of age. After 4-6 weeks, the mouse is sacrificed and the thymus is carefully dissected and bissected preserving the architecture of the tissue that will be imaged. The thymus is glued onto a coverslip in preparation for ex vivo imaging by TPM. During imaging the thymus is kept in DMEM without phenol red that is perfused with 95% oxygen and 5% carbon dioxide and warmed to 37&deg;C. Using this approach, we can study the events required for the generation of a diverse T cell repertoire.

We present step-by-step instructions for the generation of neonatal chimeras as well as the dissection and preparation of the thymus for ex vivo imaging by 2-Photon Microscopy.

In situ Imaging der Maus Thymus mit 2-Photonen-Mikroskopie

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development.  To follow the ...

Biologie

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Intravital Imaging of the Mouse Thymus mittels 2-Photonen-Mikroskopie

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Immunologie und Infektion

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a promising source for adoptive T cell therapy (ACT). However, classical in vitro methods for producing regenerated T cells from iPSC result in either innate-like or terminally differentiated T cells, which are phenotypically and functionally distinct from na&#239;ve T cells. Recently, a novel three-dimensional (3D) thymic culture system was developed to generate a homogenous subset of CD8&#945;&#946;+ antigen-specific T cells with a na&#239;ve T cell-like functional phenotype, including the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression in vivo. This protocol avoids aberrant developmental fates, allowing for the generation of clinically relevant iPSC-derived T cells, designated as iPSC-derived thymic emigrants (iTE), while also providing a potent tool to elucidate the subsequent functions necessary for T cell maturation after thymic selection.

This article describes a novel method to generate tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived thymic emigrants (iTE) by a three-dimensional (3D) thymic culture system. iTE are a homogenous subset of T cells closely related to na&#239;ve T cells with the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression.

Ein dreidimensionales thymisches Kultursystem zur Generierung von murine induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Tumor-Antigen-spezifischen thymischen Auswanderern

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Krebsforschung

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

Ableitung von T-Zellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Aus embryonalen Stammzellen der Maus

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and selection of T cells specific for self and foreign antigens. The approach entails implantation of thymic grafts derived from various aged mice into immunodeficient scid recipients. Over a relatively short period of time the recipients are fully reconstituted with T cells derived from the implanted thymus graft. Only thymocytes seeding the thymus at the time of isolation undergo selection and develop into mature T cells. As such, changes in the nature and specificity of the engrafted T cells as a function of age-dependent thymic events can be assessed. Although technical expertise is required for successful thymic transplantation, this method provides a unique strategy to study in vivo a wide range of pathologies that are due to or a result of aberrant thymic function and/or homeostasis.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

Isolation und Transplantation von Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

<meta charset="utf8"></head><body>Nachbildung der Thymus-Mikroumgebung mit iPSC-abgeleiteten Organoiden

Formation of Human Thymus Organoids in Three-Dimensional Fibrin Hydrogels

Generation of a functional and self-tolerant T cell repertoire is a complex process dependent on the thymic microenvironment and, primarily, on the properties of its extracellular matrix (ECM). Thymic epithelial cells (TECs) are crucial in thymopoiesis, nurturing and selecting developing T cells by filtering self-reactive clones. TECs have been empirically demonstrated to be particularly sensitive to physical and chemical clues supplied by the ECM and classical monolayer cell culture leads to a quick loss of functionality until their death. Because of this delicate maintenance combined with relative rarity, and despite the high stakes in modeling thymus biology in vitro, models able to faithfully mimic the TEC niche at scale and over time are still lacking. Here, we describe the formation of a multicellular human thymic organoid model, in which the TEC compartment is derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC) and reaggregated with primary early thymocyte progenitors in a three-dimensional (3D) fibrin-based hydrogel. This model answers current needs for a scalable culture system that reproduces the thymic microenvironment ex vivo and demonstrates functionality, i.e., the ability to produce T cells and to support thymus organoid growth over several weeks. Thus, we propose a practical in vitro model of thymus functionality through iPSC-derived organoids that would benefit research on TEC biology and T cell generation ex vivo.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung von Thymus-Epithelzellen und T-Zell-Forschung mit humanen Thymus-Organoiden

Here, we describe a protocol for the formation of human iPSC-derived thymus organoids grown in 3D fibrin hydrogels aiming to support thymic epithelial cell (TEC) maturation and prolonged maintenance, as well as thymopoiesis in vitro.

Bildung humaner Thymus-Organoide in dreidimensionalen Fibrin-Hydrogelen

Generation of a functional and self-tolerant T cell repertoire is a complex process dependent on the thymic microenvironment and, primarily, on the ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

Charakterisierung der Thymus-abhängig und Thymus-unabhängige Immunglobulin Isotype Antworten bei Mäusen mit Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Charakterisierung von Thymic Einschwingzeit Vorläufern in der Mouse Embryo Verwendung

Zusammenfassung

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3D Organotypische Cokulturmodell Unterstützung Mark Thymusepithel Zellproliferation, Differenzierung und Genexpression Promiscuous

In situ Imaging der Maus Thymus mit 2-Photonen-Mikroskopie

Intravital Imaging of the Mouse Thymus mittels 2-Photonen-Mikroskopie

Ein dreidimensionales thymisches Kultursystem zur Generierung von murine induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Tumor-Antigen-spezifischen thymischen Auswanderern

Ableitung von T-Zellen

Isolation und Transplantation von Different Aged Murine Thymic Grafts.

Bildung humaner Thymus-Organoide in dreidimensionalen Fibrin-Hydrogelen

Bildung humaner Thymus-Organoide in dreidimensionalen Fibrin-Hydrogelen

Bildung humaner Thymus-Organoide in dreidimensionalen Fibrin-Hydrogelen

Charakterisierung der Thymus-abhängig und Thymus-unabhängige Immunglobulin Isotype Antworten bei Mäusen mit Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay