3625-32000-104 Tarım ve Gıda Araştırma Girişimi Rekabetçi Hibe no: Araştırma USDA, ARS Cris tarafından desteklenmiştir. Gıda ve Tarım USDA Ulusal Enstitüsü 2011-67015-30736. Biz Jessica Pollock, Emma Frimml-Morgan, Shelly Zimmerman, Kristin Bass, Bruce Pesch, Molly Stafne, Allen Jensen ve Tracy Porter mükemmel teknik yardım için yanı sıra Rebecca Madison, Doug Ewing, Katie Pille Jay Steffen, David Lubbers teşekkür hayvanların mükemmel bakım ve kullanım için Robin Zeisness ve David Panthen.

1. Aşağıdaki Çözümler hazırlayın <ol><li> Tam RPMI (cRMPI), 10% (hacim / hacim) konsantrasyonunda, glutamin (2 mM), sodyum piruvat (1 mM), temel olmayan amino asitler (0.1 uM), penisilin fetal sığır serumu (FBS) ilave edilerek Hazırlama -streptomycin (100 birim / ml penisilin ve 0.1 mg / ml streptomisin) ile RPMI 1640 içinde 2-merkaptoetanol (50 mM). </li><li> Damıtılmış su içinde bir sodyum sitrat (77 mM), sitrik asit (38 uM) ve dekstroz (122 uM), karıştırma ile, 2 x asit sitrat dekstroz hazırlayın. </li><li> Hazırlama Ca + 2, Mg + 2 serbest fosfat tamponlu salin (PBS) pH 7.2: NaCI (137 mM), KCI (2.7 mM), Na 2 HPO 4 (dibazik, 10 mM), KH 2 PO 4 (monobazik, 2 mM) damıtılmış su içinde; pH&#39;ı 7.2&#39;ye ayarlayın. </li><li> PBS (hacim / ağırlık, PBS içinde 1 g / 100 mi), sığır serum albümini ilave edilerek PBS,% 1 (PBS,% 1 BSA) hazırlayın. </li><li> PBS +% 0.05 tween 20 hazırlayınPBS (hacim / hacim, aranın 500 ul PBS 20/1 L) içine,% 0.05 Tween 20 ilave etmek suretiyle (PBST). </li><li> Damıtılmış su içinde Tris (100 mM), HCI (0.50 mM), karıştırarak, 100 mM Tris HCI pH 8.2 tampon hazırlayın. </li><li> (35 etil alkol / ml damıtılmış su içinde 100 mi, hacim / hacim) damıtılmış su içinde bir etil alkol (saflık ≥99.5%) seyrelterek% 35 etanol çözeltisi hazırlayın. </li><li> Filtre cRPMI, 2 x asit sitrat dekstroz, PBS, PBS 0.22 mikron filtreleri kullanarak% 1 BSA sterilize edin. </li></ol> 2. Uzun vadeli Kültür Hücreler (14 Gün Protokolü) (Birinci gün) <ol><li> CRPMI iki kez son konsantrasyonda antijen çözümler hazırlayın. Antijen seçimi önemlidir ve çalışmanın amacına uygun olmalıdır. </li><li> Rekombinant M. seyreltin (her bir antijenin, nihai konsantrasyon 1 ug / ml), tüberküloz, 2 ug / ml TB10.4 ve antijen Ag85A antijenleri. </li><li> Seyreltik M. bovis saflaştırılmış protein türevi10 ug / ml (PPD-B PRIONICS Ag) (nihai konsantrasyon 5 ug / ml). </li><li> 2 ug / ml (1 ug / ml nihai konsantrasyon): yeniden birleştirici erken salgılama antijenik hedef 6 (ESAT-6) ve kültür filtre ürünü proteini 10 (CFP-10) füzyon proteini (CFP10 RESAT-6) seyreltin. NOT: Bu antijenler, tüberküloz mikobakterilerin antijenleri indükleyici immünodominant IFN-γ ve M. gelen PBMC uyarmak için dahil edilebilir bovis hayvanları enfekte. BCG veya M. bu suşların silinir (yani, RD1) bu antijenleri kodlayan bölge, CFP10: bovis ΔRD1 hayvanlar RESAT-6 yanıt yok aşı. reşat-6: Bu çalışmada kullanılan CFP10 Dr. C. Minion, Iowa State Üniversitesi bir tür hediye edildi. TB10.4 ve antijen Ag85A virülan ve aşı M. mevcut imüno antijenleri bovis 37 suşları. PPDB bir saflaştırılmış protein türevi gibi, tüberküloz olmayan mikobakteriler ile ortak antijenler de dahil olmak üzere pek çok antijenlerin bir komplekstir. InfecCFP10 11: aşılanan hayvanlar Reşat-6 yanıt gerekirken, (CFP10 ve PPDb: TB10.4, Ag 85A, reşat-6 olmak üzere) ted hayvanların potansiyel tüm antijenlere yanıt verecektir. </li><li> Levha 500 ul / 24 oyuklu bir plaka içerisinde her bir hayvan için dörtlü antijen çözeltisi de. Bu protokol, bir havuz olarak antijenleri kullanmak; böylece tüm kuyular tüm antijenleri ve bu adımı (örneğin, null veya mitojen olarak) hiçbir denetimleri içeren kullanın. 39 ° C /% 5 CO2 ile plaka inkübe edin. sığır normal sıcaklığı C 39 °; Bu şekilde, bazı araştırmacılar, sığır hücre kültürü için 39 ° C kullanmaktadır. Ayrıca, insan hücreleri ile bazı durumlarda, 39 ° C&#39;de hücre kültürü yarar 26,30 eklendi sağlar. </li><li> 2 x asit sitrat dekstroz için 6 ml, 16 veya 18 G hipodermik iğne ile birlikte Ön yük şırıngalar; ve boyun damarından sığır kan 60 ml toplamak. </li><li> Periferik kan ince beyaz tabaka fraksiyonların standart yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile PBMC izoleMaue ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi 4 x 10 6 hücre / ml hücre konsantrasyonu ayarlanarak değiştirilebilir. 27 </li><li> Antijen içine hücreleri (500 ul / oyuk) ilave edin, her hayvan için (adım 2.5) için dört kez, 24 yuvalı plaka önceden yüklenmiş. 39 ° C /% 5 CO2 ile plaka inkübe edin. </li></ol> (Gün üç ve yedi) <ol start="9"><li> Steril teknik kullanılarak, dikkatli bir şekilde, hücre katmanı bozmadan her gözden üst fazın 500 ul çıkarın. </li><li> IL-2 içeren 500 ul / kuyu ilave cRPMI ile iyice hacmini artırmak (de, yani 30 U / ul, 15 U / rekombinant insan IL-2 Sigma I7908). 39 ° C /% 5 CO2 ile plaka inkübe edin. </li></ol> (Gün 10 ve 12) <ol start="11"><li> Steril teknik kullanılarak, her bir oyuktan süpernatan 750 ul çıkarın. (IL-2) olmadan 750 ul / cRPMI kuyusuna ile hacmini doldurun. 39 ° C /% 5 CO2 ile plaka inkübe edin. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. ELİSPOT Deneyi (Üç Gün Protokolü) (Birinci gün (Uzun süreli kültür protokolünün 12. gün)) <ol><li> Kaplama hücreleri ne hatalardan kaçınmak için, numunelerin her biri için uygun ELISPOT plaka etiketleyin: Uzun vadeli hücreler ve APC &#39;ve ex vivo / kısa dönemli hücreleri olmadan antijen sunan hücreler (APCler), uzun süreli hücreleri (Şekil 1). Iki kopya halinde, en azından yapılmalıdır her bir muamele (örneğin, antijenik uyarımı) için çoğaltır. </li><li> PBS içinde fare anti-sığır, IFN-γ, antikor (MCA2112, klon CC330) (8 ug / ml) seyreltilmesiyle yakalama antikoru çözelti hazırlayın. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak 1 dakika boyunca / kuyu% 35 etanol 15 ul ELISPOT plaka kuyuları önceden ıslatın. Membran hasar görmesini önlemek için, tahlil sırasında herhangi bir noktada pipet uçları ile kuyuların dibine dokunmayın. </li><li> Plakayı PBS içinde 300 ul / oyuk ile altı kez. Yıkama sıvısı plaka tersine çevirerek atılmalıdır. Yıkama plaka kuyuları kurumasına izin vermiyor, hızla yapılmalıdır. </li><li> (Kademe 1 ile elde edilmiş) yakalama, anti-IFN-γ antikorun pipetle 100 ul / oyuk. 4 ° CO / N (bir fermuarlı saklama torbasına içinde plaka tutmak) inkübe. </li></ol> (Gün iki (uzun süreli kültür protokolünün 13. gün)) <ol start="6"><li> Iki nihai konsantrasyonda antijen çözümler hazırlayın. Tedaviler şunlardır: Hiçbir uyarım (cRPMI) PPD-B (20 ug / ml, nihai konsantrasyon: 10 ug / ml), TB10.4 protein kokteyli ve Ag85A (her protein 2 ug / ml, nihai konsantrasyon: 1 ug / Her bir protein mi), RESAT-6: CFP10 (M bovis enfeksiyonuna, 2 ug / ml, son konsantrasyon için iyi: örneğin pokeweed (20 ug / ml son konsantrasyon olarak 1 ug / ml) ve bir pozitif kontrol: 10 | ig / ml) eklenmiştir. Diğer mitojen yerine (örneğin, Concanavalin A) PWM kullanılabilmektedir. NOT: Bu adım için antijenler dört farklı tedaviler oluşturmak ve nOt (adım 2.5 gibi), bir havuz kullanılmıştır. Dört tedaviler: NS, PPDb, protein kokteyli (TB10.4 ve Ag85A tek tedavi oluşturan) ve PWM. </li></ol> 4. Kısa vadeli Hücre Kültürü ve Yapışkan Hücre (APC) İzolasyon <ol><li> (Altı: Uzun süreli kültür, 14 günlük protokolü) 1. gün kan aynı hayvanlardan 60 ml kan toplayın ve daha önce olduğu gibi PBMC&#39;leri izole. </li><li> 2 x 10 6 hücre / ml hücre konsantrasyonunu ayarlayın. Hücreleri kaplama yaparken Etiket tüpleri açıkça yanlış tahsisine yol önlemek için. Bu hücreler olarak kısa süreli hücre kültürü (6.5 adım) da ZPT izolasyonu için kullanılan ve yapılacaktır. Hayvan sayısı ve (: ex vivo, kısa vadeli veya taze hücreler bu durumda) kültür tipi hem Etiket tüpleri. </li><li> Plaka tersine çevirerek ELISPOT aşırı yakalama antikoru çıkarın. Plakaları 300 ul PBST ile 6 kez yıkayın. </li><li> Mümkün olduğu kadar PBST çıkarın. Pipet, uzun vadeli hücre ve APC &#39;olarak adlandırılan oyuklara hücre süspansiyonları 50 ul. Blok diğer welcRPMI 200 ul / oyuk ile ls. 90 dakika ya da 39 ° C inkübe Ön ılık cRPMI veya 39 ° C (daha sonraki adımlar için gerekli). Yapışık hücre (APC &#39;ler) izolasyonu için kullanılmadığı taze PBMC sonraki aşamalarda gerekli olacak ve saklanmalıdır. </li></ol> 5. Kültür Hücreler <ol><li> 90 dakika inkübasyon (adım 4.4, kısa vadeli kültürü ve yapışık hücre izolasyonu adım), hasat, uzun vadeli kültürlü hücrelerde sırasında. </li><li> Yukarı ve aşağı hücreleri ile 5 veya 10 ul pipet, pipet medya kullanılarak dörtlü tek bir 15 ml tüp içine her hayvandan çoğaltır birleştirmek, hücreleri ayırmak için. 400 g&#39;de 5 dakika boyunca tüpler santrifüjleyin. </li><li> Santrifüj işleminden sonra tüp tersine çevirerek süpernatant atın. Hücre pelet çıkarmak. Gerekirse hafifçe pelet yeniden askıya PBS 5 ml ekleyin. Santrifüj tekrarlayın. Iki kez yıkama adımı yineleyin. 1ml cRPMI hücreleri askıya yeniden hafifçe tüp tersine çevirerek Süpernatantı atın ve. Hücre konsantrasyonunu ayarlayın2 x 10 5 hücre / ml. </li></ol> 6. Kaplama Taze ve Kültür PBMC&#39;leri <ol><li> 90 dakika inkübasyondan sonra, 30 saniye için plaka çalkalayıcısı üzerinde çalkalayın. Plaka ters yıkanarak yapışmayan hücreler çıkarın. Pipet 150 ul / sıcak cRPMI iyi (altında 4. adımda, gelen: Kısa vadeli hücreleri ve yapışık hücre (APC) izolasyon adımı). </li><li> Plakaları çalkalayın ve yıkama sıvısı atın. Tekrarlayın yıkama 3 kez. 100 ul / oyuk, uygun kuyulara her bir antijen ekle (ön-etiketli). </li><li> Hücreleri kaplamak için, uzun vadeli bir hücre ve APC &#39;etiketli kuyu içine pipetle 100 ul / oyuk uzun süreli kültürlenmiş hücre süspansiyonu (2 x 10 5 hücre / ml). APC iyi zaten olduğu gibi bu aşamada eklenen uzun vadeli hücreleri aynı hayvandan emin olun. Farklı hayvanlardan APC en uzun vadeli kültür hücreleri karıştırmayın. </li><li> APC olmayan kuyulara uzun süreli kültürlenmiş hücre süspansiyonu pipetle 100 ul / oyuk (2 x 10 5 hücre / ml)Uzun vadeli kültür yanıt APC ihtiyacının değerlendirilmesi için s. </li><li> 100 ul / kuyucuk kısa süreli hücreleri (yeni izole edilmiş ve 2 x 10 6 hücre / ml olacak şekilde ayarlandı) ex vivo müdahale değerlendirilmesi için ekleyin. 39 ° C /% 5 CO 2 inkübatör plakaları O / N inkübe edin. Plakalar düz yalan olduğundan emin olun ve plakaları yığını yok. Not: Hücre fenotipinin analiz isteniyorsa, akış sitometrisi, bir yan deneyi olarak gerçekleştirilebilir. Hücreler, ELISPOT deneyi için tarif edildiği gibi 96 oyuklu U tabanlı bir plakanın (yerine ELISPOT plakaları) kaplanır. Yakalama antikor adsorpsiyon (3,4-3,5 adımları) atlanır edilmelidir. Hücreler daha sonra 39 ° C /% 5 CO2 ve uygulanan standart hücre boyama protokolü O / N inkübe edilir. Hücre boyama reaktifleri reaktifler tabloya dahil edilmiştir. </li></ol> Gün üç (Uzun süreli kültür protokolünün 14. gün) <ol start="6"><li> Algılama antikoru (fare anti-sığır, IFN-γ, klon CC3 seyreltilir02) PBS% 1 BSA içinde 5 ug / ml. Kuyu sıvı atılır ve plakalar yıkama: ek bir 6 kez önce ve aradaki yıkamalar, bir kez dH 2 O (300 ul / göz) ile 10 saniye boyunca karıştırma cihazı üzerinde, her yerleştirme altı kez PBST ile (300 ul / kuyucuk), PBS ile PBST ile (300 ul / göz) ve iki kez (300 ul / oyuk). Hücreler plakalardan kaldırıldıktan sonra hiçbir biyogüvenlik endişeleri uygularsanız, ve, prosedürler, biyolojik güvenlik kabinleri dışında yapılabilir. </li><li> Atın yıkama sıvısı. Kağıt havlu üzerine plakayı dokunarak mümkün olduğu kadar yıkama sıvısı çıkarın. Algılama antikor ekleyin (100 ul / oyuk). </li><li> 120 dakika ya da 39 ° C için inkübe Bu inkübasyon adımı sırasında, imalatçının talimatlarına uygun olarak alkali fosfataz solüsyon hazırlanır. Kullanmadan önce otuz dakika (örneğin, oyuklara algılama antikoru ilave edildikten sonra 90 dakika) PBST içinde reaktif seyreltin. Reaktifler karıştırın ve oda sıcaklığında kuluçkaya hafifçe Tüpü ters çevirin. </li><li> 12 sonrası0 dakika inkübasyon, plaka ters aşırı algılama antikoru atın. Plakayı PBST ile 6 kez (300 ul / oyuk). Kağıt havlu üzerine plakayı dokunarak mümkün olduğu kadar yıkama sıvısı çıkarın. </li><li> 100 ul / oyuk (aşama 3 ile elde edilmiş), alkalin fosfataz çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 45 dakika boyunca inkübe edin. Sıvı atın ve PBST ile her bir levha 6 kez yıkayın (300 ul / oyuk). </li><li> Üreticinin talimatlarına (Vector Blue AP alt-tabaka III) alt-tabaka çözeltisi hazırlayın: 100 mM Tris HCI pH 8.2 tampon maddesi içinde reaktifleri ile seyreltilir. Pipet 50 ul / alt-tabaka çözeltisi de. </li><li> Mavi renk (yaklaşık 30 dakika) gelişmeye başlar kadar oda sıcaklığında inkübe edin. Sıvı atın ve dH 2 O. bol miktarda tabakları yıkamak , Membran maruz geri kuyu yıkama ve kuru hava plaka izin alt plakasını sökün. </li><li> Stereomikroskopta kullanarak elle immünospot görüntü analizörü veya ELISPOT okuyucu (Tablo 1), ya da plakaları okuyun. Alternatif olarak, tabak tutmakokumaya erişilene kadar oda sıcaklığında karanlıkta. Çünkü Reaksiyon alt tabakanın, yüksek stabilite, kalitesi birkaç yıl boyunca korunur. NOT: Hücreler ve antijen konsantrasyonları sayılamayan noktalar 23,24,27,37 ile kuyu önlemek için optimize edilmiştir. Bu sayılamayan noktalar oluşumu farklı ortamlarda veya bağlı biyolojik çeşitliliği meydana mümkündür. Bu durumda okunabilir nokta sayma tepkisi elde edilir, böylece hücre konsantrasyonu optimize edilmelidir. </li></ol> 7. Plakalar Okuma ve Veri Analizi <ol><li> Hücresel Teknoloji Limited (CTL) ELISPOT plaka okuyucu kılavuzuna (Tablo 1) göre analiz gerçekleştirin. Noktalar sayımları oyuktan her biri için elde edildikten sonra, çiftleri arasındaki ortalama hesaplamak. her bir antijenik uyarıya spesifik immün yanıt antijen uyarımlı kuyu bu olmayan stimüle kuyularda lekelerin ortalama sayısı çıkarılarak hesaplanır. </li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

Uzun vadeli kültürlü ELISPOT deneyleri IFN-γ üretim insanlarda TCM genellikle nedeniyle, ancak bu yanıt kültüründe nasıl geliştiği tam olarak anlaşılamamıştır. İster Tcm dolaşımda bulunan ve in vitro genişletmek veya TCM yanıtları kültür sırasında TCM içine efektör ve Tem hücrelerin farklılaşması sonucu ise bilinmemektedir. Bununla birlikte, insanlar örnekler ile yapılan çalışmalar, ex vivo ve uzun vadeli kültürlenmiş, IFN-γ ELISPOT deneyleri CD4 + T hücreleri, TCM yanıtları efektör hücreler 28 gelişir yok olduğunu ima ilişkisiz epitop özgüllükleri sahip olduğunu bulmuşlardır. Açıkçası, cevap süresi değişebilir, ancak patojen açıklık elde edilir ise, sonuçta hem ex vivo ve TCM yanıtları düşüş. Ayrıca, uzun süreli kültürleri yanıtları erken ve geç antijen prime sonra ölçülen (efektör tepkisi daha düşük olduğunda) gösteren ilişkili olduğu gösterilmiştir, anti sonra erken ve uzun TCM popülasyonları dolaşımgen hazırlama in vivo ilgili kalır. Öte yandan, ex vivo olarak tepkinin büyüklüğü hafıza yanıtının 29 büyüklüğü ile ilgili olarak görünmemektedir. Bu sonuçlar, uzun dönemli kültür IFN-γ ELISPOT yanıtları TCM in vitro genişlemesi ve numunedeki efektör tepkilerinin ilişkili bir azalmasından yerine TCM fenotip efektör hücrelerin farklılaşması sonucu olduğunu düşündürmektedir. Sığır ile, uzun vadeli bir IFN-γ ELISPOT deneyleri ile tespit tepkiler efektör bellek alt nispi katkısı bilinmemektedir. Son çalışmalar aşı arasında bir korelasyon M. ile müteakip deneysel enfeksiyona karşı uzun vadeli kültürlü IFN-γ ELISPOT yanıtları ve koruma elicited gösteriyor bovis 23-24. Bu aşı, zayıf, uzun vadeli, IFN-γ ELISPOT yanıtları koruma 30 yokluğu ile ilişkili olduğu bildirilmiştir. Hem canlı ve öldürmeked aşılar benzer ex vivo IFN-γ ELISPOT yanıtları neden, ama canlı BCG ile aşılama öldürdü aşı hazırlıkları yapmak daha güçlü, uzun vadeli kültürlü IFN-γ ELISPOT yanıtları ortaya çıkarır. Öldürülen formülasyonlar öldürücü tüberküloz mikobakteriler 31-32, 33 ile meydan karşı koruma sağlamak için başarısız olurken İlginçtir, canlı aşılar koruyucu. TCM yanıtlarının değerlendirilmesi de PBMC&#39;den bu hücrelerin sıralayarak mümkündür. PBMC&#39;den TCM Doğrudan zenginleştirme, ancak, son derece kişisel eğitimli pahalı cihazları gerektirir ve bu hücreler, kan akışında çok değil gibi zordur. PBMC Uzun süreli kültür TEM ve pahalı cihazlar olmadan efektör hücrelerin üzerinde TCM zenginleşmesine sağlar; Bu T hücre popülasyonlarının in vitro genişletilmiş Ancak, in vivo bellek karşılıkları daha az temsil ediyor olabilir. Bu uzun vadeli bir kültür veya TCM sıralama kullanarak (IFN-γ hafıza yanıtları ulaşmak mümkündürsitokin ELISA 34, sitokin kordon diziler (CBA), hücre içi boyama (ICS), veya sitokin protein dizinlerinin (CPA), örneğin: ELISPOT dışında deneyleri ile stratejiler) ing. Bu yöntem; Bununla birlikte, genellikle, ELISPOT 35 deneylerden daha az duyarlıdır. ELISPOT bir avantajı kısa bir süre salma diğer hücrelere enzimatik yarılma veya sitokin emme kuvvetiyle yüzücüye ve parçalanmasında seyreltme önlenmesi sonra sitokin hemen yakalama tespit yeteneğidir. ELISPOT deneyleri bile gürültü senaryolar (yani, düşük özgül tepkiler) 35 düşük sinyalde kesin sonuçlar veren sitokin üreten tek hücreleri tespit. Ayrıca, ICS ile, serbest bırakmak için önceden sitokinlerin tespit sitokinleri üreten hücrelerin sahte tanımlama neden olabilir (örn., Bağlı salgılama işlemi sırasında veya öncesinde, post-translasyonel modülasyonu) 34. sitokin salgılanmasını en aza indirmek için ICS deneylerinin birlikte kullanılabilir iletim inhibitörlerinin(Golgi durdurma proteinleri olarak da bilinir) antijen uyarımı esnasında nedeniyle sonuçta sitokin üretimini 35 etkileyen bu proteinlerin hücre toksisitesine hücre uyarımı süresini sınırlamak. Bu bahsedilen birlikte - (., Yani ICS) CBA, CPA ve ICS ve / veya hücre yüzey işaretleyici ifade saptanması için aynı anda birden fazla sitokinleri ölçmek için yararlı bir teknik vardır. Bu nedenle, bu yöntemler, IFN-γ, ELISPOT deneyi 36 ile kombinasyon halinde de kullanılabilir. Önceki sığır TB aşı etkinliği çalışmaları ELISPOT testi aracılığıyla TCM yanıtları ölçülen ederken, diğer tekniklerle TCM tepkilerinin tespiti karşılaştırılabilir sonuçlar büyük olasılıkla verecektir. Önemli olarak, ELISPOT testi daha az pahalı ve FMA, CPA ve ICS analiz teknikleri 34 daha gerçekleştirmek için daha kolaydır. SFC Manuel sayma otomatik sayım bir alternatiftir ve ELISPOT plakalar önce veya nokta c sonra, en az kalite kaybı ile uzun süre boyunca oda sıcaklığında muhafaza edilebilir37 tutarlı. Uzun süreli kültürlenmiş IFN-γ ELISPOT yanıtı tüberküloz aşısı yanıtları değerlendirilerek bellek insan tarafından yanıtları ve sığır değerlendirmek için uygulanmıştır 14-16,31-32,33. . TCM yanıtları da örneğin, sığır birçok enfeksiyon maddeleri, ev sahibi yanıtlarında önemli roller oynadığı kabul edilmektedir: Mycoplasma mycoides subsp mycoides 42, Anaplasma 38 ve sığıra ait solunum sistemi sinsitiyal virüsü 39 marginale. Potansiyel olarak, uzun dönem ELISPOT testi diğer hayvan türleri, sitokinler ve enfeksiyon için adapte edilebilir. Bunlar geniş uygulamalar nedeniyle belirli reaktif akım sınırlı kullanılabilirliği veteriner immünoloji uygulamaları için özellikle yararlı olacaktır. TCM yanıtları birkaç enfeksiyonlarına karşı koruma için çok önemlidir, ancak ma (hastalık sonucu tahmin veya aşı etkinliği için) enfeksiyonu / aşılamadan sonra onları erken ölçümy hantal. Ex vivo olarak, kısa antijenik uyarımı koşullar altında bağışıklık tepkisinin analizi ile daha sık, özellikle immünolojik hafıza oluşumunun başlangıcı sırasında, bağlı bellek efektör tepkilerinin örtüşmeye efektör tepkilerini temsil etmektedir. Antijen yükü sürekli olan kronik hastalıklar çerçevesinde, ex vivo olarak cevaplar efektör hücre yanıtları veya bellek efektör hücre yanıtlarının bir arada değerlendirecektir. Uzun süreli kültürlenmiş IFN-γ ELISPOT deneyi, büyük olasılıkla TCM yanıtları yerine efektör T hücresi veya bir araya CD4 + T hücre yanıtlarının ölçümünü sağlar, burada açıklanan. Özet olarak, uzun dönem kültürlenmiş IFN-γ ELISPOT testi T hücre bellek karşılıkları tahmin etmek için değerli bir yaklaşım sağlar ve enfeksiyonlar ajanlar çeşitli birçok türün bellek tepkilerini ölçmek için başanlı bir şekilde kullanılmıştır 12-16, 20-25,29 , 31,33,34,38,39.

Efektör ve hafıza T hücreleri, antijen tanıma sonra naif CD4 + T hücrelerinin gelişim programlama yoluyla oluşturulur. Sitokin üreten hücrelere naif CD4 + T hücrelerinin farklılaşması doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, antijen T hücrelerine sunum, ko-stimülasyon ve polarize sitokin üretiminde elde edilen transkripsiyon değişiklikler ile patojen kabul edilmesini gerektirmektedir. Örneğin antijen sunan hücreler, bir araya antijen tanıma, sinyal ileticisi ve bir aktivatör ile sinyal ile T yardımcı içine 1 (Th1) hücreler 1,2 T hücrelerinin farklılaşmasını teşvik, hücre içi patojenler, tepki olarak interlökin (IL) -12 üretmek Transkripsiyon 4 (STAT 4) ve T-hücresi aktivasyonu kutusu, IL-2 üretimi, klonal genişleme ve interferon (IFN) -γ üretimi 3,4 giden, T hücreleri (T-bahis) olarak ifade edilmiştir. Enfeksiyon kontrol edilirse, genleşme fazı esnasında üretilen T hücrelerinin% 95&#39;e kadar (yani, daralma ortadan kalkarfazı) ve hafıza T hücreleri bir ömür boyu 5, bazen kalır. Sallusto ve ark., 6, lenf düğümü homing reseptörler sentezlenmesi dayalı olarak insanlarda hafıza T hücreleri, iki işlevsel ayrı alt saptandı. Merkezi bellek T-hücreleri (TCM) CC kemokin reseptörü (CCR) -7 ve CD45RO ifade esas olarak, ikincil lenfoid organların T-hücresi alanlarda yer almaktadır. TCM efektör fonksiyonu, düşük aktivasyon eşiği ve yüksek IL-2 üretimi ve çoğalma kapasitesini korumak sınırlıdır. Efektör hafıza T hücreleri (Tem), CD45RO ifade eden periferik veya iltihaplı dokulara güdümlü için CCR7 ve ekran reseptörlerini yoksundur. Efektör hücreler CCR7 veya CD45RO ya ekspres ama derhal antijen tanıma üzerine, bu tür IFN-γ gibi efektör sitokinler, üretemezler. IFN-γ salınım analizleri (IGRA) sığır ve insan tüberküloz 7 tanısında kullanılır. Mycobacterium bovis insan ca ise sığır tüberkülozu (BTB) temel maddedirTüberküloz ses Mycobacterium tuberculosis başta kaynaklanır. Bu testler, tam kan ya da periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) ile ELISA ile ya da ELISPOT teknikleri kullanılarak IFN-γ üreten hücrelerin saptanması yoluyla ölçülür 16 saat ve süpernatan içinde IFN-γ üretimi 24 için mikobakteriyel antijenlerin çoğu ile uyarılmaktadır. Kısaca, uyarım periyodu bir sonucu olarak (örneğin., 16-24 saat) ve hızlı bir sitokin üretimi, ex vivo deneyler, esas olarak, efektör ve TEM yanıtları algılamak. Bu durum, bu kültürler 8-10 hücre popülasyonlarının akış sitometrik analizi ile teyit edilmiştir. Ex vivo IFN-γ yanıtları rutin sığır tarafından tepkilerini ölçmek için kullanılanlar da dahil olmak üzere tüberküloz aşıları, bir bağışıklık tepkisi paneli değerlendirmeye dahil edilmiştir. En etkili sığır tüberkülozu aşıları belirli IFN-γ tepkiler değil, IFN-γ yanıtları teşvik tüm aşılar protectiv vardıre. Ayrıca, enfeksiyon öncesi ölçülen, aşılama ile ortaya çıkarılan, IFN-γ seviyeleri, gerekli koruma ile ilişkili değildir. Örneğin, farklı bir BCG suşları içindeki koruma seviyesi 11 rağmen, ex vivo IFN-γ karşılığının uyarılması için farklı kapasitelere sahiptir. Böylece, ex vivo IGRA tüberküloz tanısı için ve aşı immünojenikliğini erişmek için değerlidir; Ancak, aşı etkinliğinin belirleyicileri olarak kullanımı sınırlıdır. İnsanlarda 15,16 fareler 14 ve sıtma insan olmayan primatlarda 12,13 tüberküloz, simian bağışıklık sistemi bozucu virüs (SIV) enfeksiyonu ile gösterildiği gibi, aşılamaya TCM tepkiler, diğer taraftan, aşı etkinliğini öngörmek için kullanılabilmektedir. Patojen boşlukla sonuçlanan etkili bir bağışıklık tepkisi sonra TCM korunur ve, aynı madde ile nihai bir ikinci enfeksiyon ile koruma sağlar. Bu senaryoya bir istisna M. ise Tüberküloz INFEinsanların ction olan iyileştirici anti-mikobakteriyel tedavisi alan hastalar yeniden enfeksiyon için 17,18 duyarlıdır. Ayrıca, kronik enfeksiyonlar sırasında immünolojik bellek yöneten olaylar, antijenik stimülasyon devam buradaki iyi 19 anlaşılmamıştır. Böyle insan immün yetmezlik virüsü (HIV) ve tüberküloz gibi kronik enfeksiyonlarda sırasında önemli bir TCM tepkisi olumlu sonuç 20,21 (HIV, tüberküloz ve subklinik hastalığı olan, örneğin, gecikme) ile ilişkilidir. Farelerde ve insanlarda yapılan çeşitli çalışmalarda, uzun vadeli kültürlenmiş, IFN-γ ELISPOT deneyleri TCM yanıtlar 16,20-22 ölçmek olduğunu göstermiştir. Bu testte, PBMC, 10-14 gün için antijen konsantrasyonunun azaltılması efektör yanıtları tepe ve azalmaya izin kültürlenmiştir; TCM kolaylaştırılması ayırt etmek ve kültür içinde genişletmek. Uzun süreli kültürlenmiş, IFN-γ ELISPOT deneyleri, aynı zamanda veterinerlikte kullanılmıştırAraştırma, ancak, hücrelerin fenotipi nedeniyle önemli reaktifler eksikliği, CCR7, özellikle bir antikora değerlendirmek zor olmuştur. Etkili sığır tüberkülozu aşılar [örneğin. M. tek bir doz kullanılarak bovis Bacille Calmette Guerin (BCG), BCG bovis ΔRD1] korunması ile ilişkili aşılama sonrası uzun süreli kültürlenmiş IFN-γ ELISPOT yanıtları (yani, daha düşük mikobakteriyel yükü ortaya çıkarmak. Viral vektörlü Antijen 85A alt birim aşı veya zayıflatılmış M ardından ve azalmış TB-ilişkili patoloji) öldürücü M. ile sonraki tehdide karşı bovis 23,24. Ayrıca, uzun süreli PBMC kültürleri içinde antijene spesifik IFN-γ salgılayan hücrelerin sayısı 12 ayda yüksek ama koruma saptanabilir sonrası M. derecesi ile ilişkilendirerek, yenidoğan buzağıların BCG aşısından sonra 24 ayda azalma bovis meydan 25. Bu senaryoda, kültürlenmiş IFN-γ ELISPOT a,, aşı etkinliğini tahmin yüksek maliyet etkinlik denemeleri için aşı adayları öncelik için bir araç sağlamak için n önemli bir araçtır. Buna ek olarak, kültür ELISPOT teknikleri farklı araştırma alanında, çeşitli amaçlar için antijenler veya antikorlar değiştirerek, çeşitli ana, patojenler ve sitokinler için adapte edilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Sodium citrate (dihydrate)</td>
			<td rowspan="2">Various</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Citric acid (monohydrate)</td>
			<td rowspan="2">Various</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Dextrose</td>
			<td rowspan="2">Various</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISPOT PVDF plate</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectastain ABC &#8211; AP KIT Standard</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>AK-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-5300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag85A</td>
			<td>Lionex</td>
			<td>LRP-0004.3</td>
			<td>23, 24, 25, 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB 10.4</td>
			<td>Lionex</td>
			<td>LRP-0061.6</td>
			<td>23, 24, 25, 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPDb</td>
			<td>Prionics AG</td>
			<td>7600055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rESAT-6:CFP10</td>
			<td>Kind gift Dr. Minion, Iastate</td>
			<td></td>
			<td>23, 24, 25, 27,&#160; 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine IFN-&#947; Clone CC302</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA1783B</td>
			<td>23, 24, 25, 27,&#160; 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine IFN-&#947; Biotinylated Clone CC330</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA2112</td>
			<td>23, 24, 25, 27,&#160; 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine CD4 Clone CC8</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA1653GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine CD45RO Clone IL116A</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA2434GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-human CCR7 Clone 3D12</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab95665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine IFN-&#947;-Pe Clone CC302</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA1783PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti- mouse IgG2a- Alexa Fluor 350</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG3 APC-CY7</td>
			<td>SouthernBiotechnology</td>
			<td>1080-193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat IgG-APC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm&#8482;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrefeldinA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pokeweed Mitogen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinat human Interleukin 2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7908</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay for assessing effector and memory t cell responses in cattle

Efektör ve hafıza T hücreleri antijen tanıma aşağıdaki naif hücrelerin gelişim programlama yoluyla oluşturulur. Enfeksiyon genişletme aşamasında üretilen T hücrelerinin% 95&#39;e kadar kontrol edilirse elimine edilir (örneğin., Kasılma fazı) ve hafıza T hücreleri, bazen ömür boyu devam etmektedir. İnsanlarda, bellek T hücrelerinin iki fonksiyonel olarak farklı alt-gruplar lenf nodu homing reseptörler sentezlenmesi göre tarif edilmiştir. Merkezi bellek T hücreleri CC kemokin reseptörü 7 ve CD45RO ifade esas olarak, ikincil lenfoid organların T-hücresi alanlarda yer almaktadır. Efektör hafıza T hücreleri, CD45RO ifade eden periferik veya iltihaplı dokulara lenfosit ile ilişkili CCR7 ve ekran reseptörlerini yoksundur. Efektör T hücreleri CCR7 veya CD45RO ancak bu tür interferon-γ gibi antijen üretmek efektör sitokinler ile karşılaşma sırasında ya ifade yoktur. İnterferon-γ salınım deneyleri sığır ve insan tüberküloz tanısı için kullanılır vetemel olarak efektör ve efektör bellek T hücre yanıtları algılamak. İnsanlarda simian bağışıklık sistemi bozucu virüs, insan olmayan primatların enfeksiyon, tüberküloz, farelerde ve sıtma gösterildiği gibi aşılama CD4 + T hücreleri tarafından merkezi bellek T hücresi tepkileri, diğer taraftan, aşı etkinliğini öngörmek için kullanılabilmektedir. Fareler ve insanlar dahil olmak üzere sığır yayınlanmamış veriler çeşitli çalışmalar, interferon-γ ELISPOT deneyleri merkezi bellek T hücresi tepkilerini ölçmek olduğunu göstermiştir. Bu testte, periferal kan mononükleer hücreleri, 10-14 gün (uzun dönemli kültür) için antijen konsantrasyonunun azaltılması efektör yanıtları tepe ve azalmaya izin kültürlenmiştir; merkezi bellek T hücreleri ayırt kolaylaştırılması ve kültür içinde genişletmek.

M. ile yaklaşık bir aylık post-aerosol enfeksiyonu bovis (10 4 koloni oluşturan birim), PBMC&#39;ler enfekte (n = 8) ve kontrol hayvanları (n = 8) antijen ve 13 gün boyunca IL-2 mevcudiyetinde kültürlenmiştir. TCM yanıtlarının gelişimi enfeksiyondan sonra, IFN-γ ELISPOT deneyi kullanılarak belirlendi. (APC &#39;varlığında veya yokluğunda) Örnek TCM ve ex vivo IFN-γ, Şekil 1&#39; de gösterilmiştir, enfekte hayvanların (üç hayvan) ve enfekte olmayan bir hayvan (bir hayvan) ile ilgili ELISPOT yanıtlar. Başarılı bir uzun dönemli, IFN-γ IFN-γ üreten hücrelerinde ELISPOT testi sonuçları uyarılmış koşullar altında ve enfekte olmayan hayvanlardan yanıt verilmemesi halinde yakın ve uyarılmamış koşullar altında (Noktası-oluşturan hücreler, SFC). Ayrıca, güçlü bir T-hücresi yanıtı PWM&#39;ye cevaben gerçekleşmelidir. M. Özgü tepkiler CFP10 antijenik uyarımı: bovis PPD-B ya da RESAT-6 ile değerlendirildi. Şekilde gösterildiği gibi,1, sağlam TCM ve eski PPD-B ve Reşat-6 vivo yanıtları: CFP10 her üç M. gelen saptandı bovis hayvanları ile enfekte. Hiçbir TCM ve ex vivo yanıtları Minimal kontrol hayvandan saptandı. Otolog APC &#39;lerin yokluğunda kültürlenen uzun süreli hücreler tarafından büyük ölçüde azaltılmış yanıtları ile gösterildiği gibi aynı zamanda, APC&#39; lerin varlığı, enfekte olmuş hayvanlar tarafından iyi TCM cevapları için gerekli oldu. M. PBMC&#39;ler tarafından IFN-γ yanıtı bovis enfekte olan ve olmayan enfekte edilmiş hayvanları, Şekil 2&#39;de sunulmaktadır. her hayvandan SFC&#39;leri sayısı PPD-B eksi tek başına ortam için ilgili yanıt yanıt olarak, ikili örneklerde SFC&#39;leri ortalama sayısı olarak hesaplanmıştır. Tepkiler 10 6 hücreleri için tahmin edilmiştir. Farklılık Yanıtlar (p &lt;0.05) enfeksiyonu durumu varlığında veya APC &#39;ve Kültür süresi (yani., Uzun dönemli kültür karşı ex vivo kültür) yokluğunda dayalı. <table border="0" cellpadding = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <colgroup><col /><col /></colgroup><tbody><tr><td colspan="2"> Plakaların imajını Kazanılması </td></tr><tr><td> 1. </td><td> Makineyi açın </td></tr><tr><td> 2. </td><td> Aç &quot;Immuno Capture&quot; Version 6.3 yazılımı. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Adım 1: select plaka tipi. </td></tr><tr><td> 4. </td><td> Adım 2: yük plakası. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Adım 3: tarama seçeneklerini belirleyin. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> Adım 4: Tarama işlemini başlatmak. </td></tr><tr><td> 7. </td><td> Plaka genel görüntü elde. </td></tr><tr><td> 8. </td><td> Plaka çıkarın. </td></tr><tr><td> 9. </td><td> &quot;Immuno Yakalama&quot; yazılımını çıkın. </td></tr><tr><td colspan="2"> Spot oluşturan birimler Sayma </td></tr><tr><td> 1. </td><td> &quot;Bağışıklık Nokta Yakalama&quot; Version 5.0 yazılımını açın. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> Seçin hedeflere<html> t tipi: Normal. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Seçin sayma modülü: akıllı sayım. </td></tr><tr><td> 4. </td><td> 1. Adım: yük plakası. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Adım 2: sayım parametreleri tanımlayın: Spot tanıma testi doğruluğu farklı noktalar ile kuyularda. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> Otomatik sayısını başlatın. </td></tr><tr><td colspan="2"> Kalite kontrol </td></tr><tr><td> 1. </td><td> Aç &quot;immünospot Capture&quot; Version 5.0 yazılımı. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> Seçin sayma modülü: kalite kontrol. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> 1. Adım: yük plakası. </td></tr><tr><td> 4. </td><td> Adım 2: bireysel vurgulanan kuyular analiz edin. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Kalite kontrolünü bitirin. </td></tr></tbody></table> Tablo 1 - otoimmun Diagnostika ELISPOT okuyucu görüntü toplama ve hücre prosedürü sayma. ove_content &quot;fo: keep-together.within sayfa =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52833/52833fig1.jpg" /> ELISPOT testi γ uzun vadeli kültürlenmiş IFN-y ile ilgili oyuklara Şekil 1. Görüntü. Kültürlenmiş IFN-γ ELISPOT testi virülan M ile yüklemeden sonra approximatelyone ayda gerçekleştirilmiştir bovis (üç hayvan). Enfekte olmayan hayvanların kontrol (bir hayvan) olarak alındı ​​uzun vadeli yeniden birleştirici hücre çizgileri Ag85A (1 ug / ml), TB10.4 (1 ug / ml) bir kokteyli ile PBMC&#39;nin uyarılması tarafından oluşturulan, RESAT-6.: CFP10 (1 ug / ml) ve bunların PPD-B otolog APC varlığında veya yokluğunda, ELISPOT plakalarına transferi ve ardından 13 gün süreyle (5 ug / ml). PBMC günde 13 izole ELISPOT plakalarına doğrudan kaplama kısa vadeli hücreleri oluşmuştur. Uzun dönem ve kısa dönem hücrelerinin PPD-B (10 ug / ml), RESAT-6 ile uyarıldı: 5 (CFP10 (1 ug / ml), tek başına ortam veya pokeweed mitojen ve# 956 g / mi) 24 saat karıştırıldı. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52833/52833fig2.jpg" /> M. ELISPOT yanıt γ uzun vadeli kültürlü IFN gelen Şekil 2. Temsilcisi sonuçları bovis saflaştırılmış protein türevi (PPD-B). Kültürlenmiş IFN-γELISPOT deney virülan M ile yüklemeden sonra approximatelyone ayda gerçekleştirilmiştir bovis (sekiz hayvanlar). Enfekte olmayan hayvanların Sekiz hayvan uzun süreli hücreler, rekombinant Ag85A bir kokteyli (1 ug / ml), TB10.4 (1 ug / ml) ile PBMC&#39;nin uyararak elde edildi (kontrol olarak dahil edildi RESAT-6: CFP10 (1 ug / ml) ve bunların PPD-B otolog APC &#39;lerin varlığı veya yokluğunda, ELISPOT plakalarına transferi ve ardından 13 gün süreyle (5 ug / ml). Kısa vadeli hücreleri PBMC oluşuyordu günde 13 izole edilmiş ve ELISPOT plakasına doğrudan kaplamalı . Uzun vadeli ve shooda sıcaklığı süreli hücreleri tek başına, 24 saat boyunca PPD-B (10 ug / ml) ya da ortam ile uyarıldı. Her bir hayvan (SFC / 10 6 hücre) için spesifik yanıtların PPD-B (kopya halindeki numunelerin ortalamasını) eksi tek başına ortam tepki tepki olarak sunulmaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Application of Long-term cultured Interferon-Î³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle at JoVE.com

Application of Long-term cultured Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Uzun süreli kültürlenmiş interferon-γ enzime bağlı immünospot deneyi merkezi bellek tepkilerinin bir ölçüsü olarak kullanılır ve koruyucu, anti-mikobakteriyel aşı cevabı ile bağıntılı olduğu ortaya konmaktadır. Bu testte, periferal kan tek-çekirdekli hücreleri, mikobakteriyel antijenlerin ve interlökin-2, 14 gün için, etkinleştirme farklılaşma ve merkezi bellek T hücrelerinin genişlemesi ile stimüle edilir.

Sığırlarda Efektör ve hafıza T Hücre Yanıtları değerlendirilmesi için uzun vadeli kültürlü İnterferon-γ Enzim-linked immünospot Testi Uygulaması

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

application-long-term-cultured-interferon-enzyme-linked-immunospot

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

12.1K Görüntüleme.  United States Department of Agriculture.  Uzun süreli kültürlenmiş interferon-γ enzime bağlı immünospot deneyi merkezi bellek tepkilerinin bir ölçüsü olarak kullanılır ve koruyucu, anti-mikobakteriyel aşı cevabı ile bağıntılı olduğu ortaya konmaktadır. Bu testte, periferal kan tek-çekirdekli hücreleri, mikobakteriyel antijenlerin ve interlökin-2, 14 gün için, etkinleştirme farklılaşma ve merkezi bellek T hücrelerinin genişlemesi ile stimüle edilir. 

Video: Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens. The ability to detect and quantify these responses in humans is an important diagnostic tool. The enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) is gaining popularity for its ability to identify cellular immune responses against microbial antigens, including immunosuppressed populations such as those with HIV infection, transplantation, and steroid use. This assay has the capacity to quantify the immune responses against specific microbial antigens, as well as distinguish if these responses are Th1 or Th2 in character. ELISPOT is not limited to the site of inflammation. It is versatile in its ability to assess for immune responses within peripheral blood, as well as sites of active involvement such as bronchoalveolar lavage, cerebral spinal fluid, and ascites. Detection of immune responses against a single or multiple antigens is possible, as well as specific epitopes within microbial proteins. This assay facilitates detection of immune responses over time, as well as distinctions in antigens recognized by host T cells. Dual color ELISPOT assays are available for detection of simultaneous expression of two cytokines. Recent applications for this technique include diagnosis of extrapulmonary tuberculosis, as well as investigation of the contribution of infectious antigens to autoimmune diseases.

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Identification of microbial targets of adaptive immunity in idiopathic diseases can be accomplished by the use of the enzyme-linked immunospot assay.

Enzim-linked immünospot Testi (ELISPOT): Th-1 Mikrobiyal antijenlere karşı hücresel immün cevaplar Kantitasyonu

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

Human Papillomavirüs Roman T hücre epitopları Karakterizasyonu için interferon-γ Enzim bağlı immünospot Assay Kullanımı

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

Vitro Testi HIV-spesifik CD4 T hücre efektör işlevi üzerinde immünoregülatör yolları etkisini değerlendirmek için

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

T hücre yanıtlarının Değerlendirme Floresan hedef Dizilerin Kullanımı<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Efektör CD4 Evlatlık transferi ile Kemirgen Bağırsak Enflamasyon indüksiyonu<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Yüksek</sup&gt; Bağışık yetmezliği olan farelere içine T Hücreleri

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Enzim-linked Lektin Testi tarafından Grip Nöraminidaz İnhibisyon antikor titreleri Ölçme

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

Bir IL-8 Geçici Transgenize Edilmiş Fare Modeli<emIn vivo</em&gt; İnflamatuvar Yanıtların Uzun Vadeli İzlenmesi

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable dry eye animal model to test novel therapeutics to treat autoimmune dry eye conditions. This protocol describes a chronic autoimmune dry eye rat model. Lewis rats were immunized with an emulsion containing lacrimal gland extract, ovalbumin, and complete Freund&#39;s adjuvant. A second immunization with the same antigens in incomplete Freund&#39;s adjuvant was administered two weeks later. These immunizations were administered subcutaneously at the base of the tail. To boost the immune response at the ocular surface and lacrimal glands, lacrimal gland extract and ovalbumin were injected into the forniceal subconjunctiva and lacrimal glands 6 weeks after the first immunization. The rats developed dry eye features, including reduced tear production, decreased tear stability, and increased corneal damage. Immune profiling by flow cytometry showed a preponderance of CD3+ effector memory T cells in the eyeball.

This report describes a method to induce chronic experimental autoimmune dry eye in Lewis rats through immunization with an emulsion of rat lacrimal gland extract, ovalbumin, and complete Freund's adjuvant, followed by the injection of lacrimal gland extract and ovalbumin into the forniceal subconjunctiva and lacrimal glands six weeks later.

Eyeball Dokusunda Efektif Hafıza T Hücrelerini Artıran Kronik Otoimmün Kuru Göz Fare Modeli

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Geliştirme ve doğrulama vericiyi bir tek molekül dijital enzim bağlı Immunosorbent Assay insan Interferon-α için dizi

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...